Summary
Протеомная дисрегуляция играет важную роль в распространении диффузно инфильтрирующих глиом, но несколько соответствующих белков остаются неидентифицированными. Цифровая пространственная обработка (DSP) предлагает эффективный, высокопроизводительный подход для характеристики дифференциальной экспрессии белков-кандидатов, которые могут способствовать инвазии и миграции инфильтративных глиом.
Abstract
Диффузно инфильтрирующие глиомы связаны с высокой заболеваемостью и смертностью из-за инфильтративного характера распространения опухоли. Они представляют собой морфологически сложные опухоли с высокой степенью протеомной изменчивости как в самой опухоли, так и в ее гетерогенном микроокружении. Злокачественный потенциал этих опухолей усиливается дисрегуляцией белков, участвующих в нескольких ключевых путях, включая процессы, которые поддерживают клеточную стабильность и сохраняют структурную целостность микросреды. Хотя было проведено множество объемных и одноклеточных анализов глиомы, существует относительная нехватка пространственной стратификации этих протеомных данных. Понимание различий в пространственном распределении опухолевых факторов и популяций иммунных клеток между внутренней опухолью, инвазивным краем и микроокружением дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе пролиферации и распространения опухоли. Цифровое пространственное профилирование (DSP) представляет собой мощную технологию, которая может стать основой для этих важных многослойных анализов.
DSP - это метод, который эффективно количественно определяет экспрессию белка в заданных пользователем пространственных областях в образце ткани. DSP идеально подходит для изучения дифференциальной экспрессии нескольких белков внутри и между регионами различия, обеспечивая несколько уровней количественного и качественного анализа. Протокол DSP является систематическим и удобным для пользователя, что позволяет проводить индивидуальный пространственный анализ протеомных данных. В этом эксперименте тканевые микрочипы строятся из архивных биопсий ядра глиобластомы. Затем выбирается панель антител, нацеленных на интересующие белки в образце. Антитела, которые предварительно конъюгируются с Олигонуклеотидами УФ-фоторасщепления ДНК, затем инкубируются с образцом ткани в течение ночи. При флуоресцентной микроскопии визуализации антител с образцами определяются области интереса (ROI), в пределах которых можно количественно оценить экспрессию белка. Затем ультрафиолетовый свет направляется на каждый ROI, расщепляя ДНК олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды микроаспирируются и подсчитываются в пределах каждого ROI, количественно оценивая соответствующий белок на пространственной основе.
Introduction
Диффузно инфильтрирующие глиомы являются наиболее распространенным типом злокачественной опухоли головного мозга у взрослых и неизменно летальны. Склонность клеток глиомы к обширной миграции в мозге является серьезной терапевтической проблемой. Механизм, с помощью которого они распространяются, включает в себя направленную миграцию и неконтролируемое вторжение. Было показано, что инвазивные клетки глиомы демонстрируют тропизм и миграцию вдоль трактов белого вещества1, причем недавние исследования предполагают демиелинизацию этих путей в качестве активного протуморигенного признака2. Инвазия опосредована эпителиально-мезенхимальным переходом, при котором клетки глиомы приобретают мезенхимальные свойства за счет снижения экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул клеточной адгезии, усиливая миграцию и облегчая распространение через микроокружение опухоли 3,4,5.
На молекулярном уровне было продемонстрировано нарушение работы нескольких белков, которые придают клеточную стабильность и взаимодействие с иммуногенными компонентами6. Инфильтративные глиомы, как известно, подвергаются подавлению белков с антиапоптотическими (например, PTEN) свойствами7. Они также сверхэкспрессируют белки, которые способствуют уклонению иммунного ответа хозяина (например, PD1 / PDL1)8. Дисрегуляция этих сложных путей усиливает опухолегенность и повышает злокачественный потенциал.
В образцах инвазивной глиомы цель состояла в том, чтобы оценить дифференциальную экспрессию белков, имеющих ключевое значение для роста, выживания и пролиферации клеток, а также для структурной целостности микросреды между инвазивными и неинвазивными компонентами. Кроме того, мы стремились изучить дифференциальную регуляцию белков с активной иммуногенной ролью, предлагая понимание механизма, с помощью которого скомпрометированная иммунная защита хозяина может усиливать пролиферативный и инвазивный потенциал глиом. Это особенно актуально, учитывая недавнюю широту исследований, демонстрирующих, как иммунные маркеры и драйверы дисрегуляции злокачественных новообразований могут служить мишенями иммунотерапии. Определение жизнеспособных терапевтических мишеней среди многих белков, участвующих в иммунонадзоре и реактивности, требует высокочувствительного и комплексного подхода.
Учитывая широкий спектр белков-кандидатов, которые могут быть изучены, мы искали метод, похожий на иммуногистохимию, но с повышенной эффективностью обработки данных. В области биологии рака DSP стала мощной технологией с важными преимуществами по сравнению с альтернативными инструментами для протеомного анализа и количественной оценки. Отличительной чертой DSP является его высокопроизводительная мультиплексирующая способность, позволяющая одновременно изучать несколько различных белков в образце, отмечая важное отличие от стандартных, но низкоплексных технологий, таких как иммуногистохимия (IHC)9,10. Мультиплексная особенность DSP не ставит под угрозу его точность как количественного и аналитического инструмента, как показали исследования, сравнивающие DSP с IHC. При использовании для протеомной количественной оценки образцов немелкоклеточного рака легкого, например, было показано, что DSP имеет результаты, аналогичные IHC11. Кроме того, DSP предлагает настраиваемую региональную спецификацию, в которой пользователи могут вручную определять области, в которых выполняется протеомный анализ. Это представляет собой преимущество перед методами мультиплексирования всего сечения10,12. Таким образом, в одном раунде обработки DSP предлагает несколько уровней анализа, исследуя несколько белковых мишеней в нескольких областях, представляющих интерес.
DSP имеет применение в нескольких различных патологических условиях. DSP особенно выгоден в онкологическом анализе, так как пространственная изменчивость может коррелировать с клеточной трансформацией и дифференциальной экспрессией белка. Например, DSP был использован для сравнения протеомного профиля рака молочной железы с соседним микроокружением опухоли. Это имеет важные последствия для понимания естественной истории этой опухоли и ее прогрессирования, а также потенциального ответа на лечение13. Дополнительные контексты, иллюстрирующие универсальность DSP, включают пространственную количественную оценку разнообразия белков при раке предстательной железы14, связь экспрессии маркера иммунных клеток с прогрессированием заболевания при плоскоклеточном раке головы и шеи15 и демонстрацию эпителиально-мезенхимального градиента экспрессии белка, отличающего метастатический рак яичников от первичного чистоклеточного рака яичников16 . Реализуя DSP, мы характеризуем пространственную топографию белков, которые могут влиять на опухолевыйгенез и инвазию глиом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол, изложенный ниже, соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человека Дартмута-Хичкока. Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы тканей были включены в это исследование. В разделе Таблица материалов приведены подробные сведения обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Подготовка слайдов17
- Извлеките или подготовьте закрепленную формалином, парафинированную ткань из диффузно инфильтрирующих глиом взрослого типа человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовались парафиновые встроенные блоки биопсии трех пациентов с глиобластомой. - Создайте блок тканевого микрочипа (TMA). Возьмите несколько сердечников по 2 мм из каждой биопсии и поместите их в один блок TMA (рисунок 1, сверху). Вырежьте секции из блока TMA на 4 мкм и установите их на стеклянные слайды. Поместите каждый слайд в прокладку держателя слайда. Инкубируйте горку при 60 °C в течение 30 мин.
2. Полуавтоматическая подготовка системы IHC и настройка программного обеспечения (для загрузки и запуска слайдов)17
- Установите реагенты. Нажмите на кнопку Настройка реагента . Нажмите кнопку Добавить на вкладке Настройка .
- Зарегистрируйте буфер стирки, введя его имя в поле Имя . Выберите Вспомогательный в поле Тип . Нажмите кнопку Сохранить.
- Зарегистрируйте блокирующее решение, повторив те же шаги, что и выше (измененные в зависимости от обстоятельств, например, в поле «Имя »), но выбрав «Первичное антитело » в поле «Тип ». Выберите нужные протоколы в раскрывающихся списках Протокол окрашивания по умолчанию и Протокол HIER по умолчанию. При необходимости выберите параметр «Протокол ферментов по умолчанию » (это поле было оставлено пустым в текущем протоколе). Нажмите кнопку Сохранить.
- Зарегистрируйте систему обнаружения, состоящую из лотка для контейнеров с реагентами со штрих-кодом. Отсканируйте штрих-код.
- Начните ввод сведений о реагентной системе в окне Добавить исследовательскую реагентную систему . Введите имя системы обнаружения.
- Введите дату истечения срока действия. Выделите первую строку диаграммы Реагенты и отсканируйте штрих-код нового контейнера с реагентами объемом 30 мл, после чего штрих-код заполнит строку 1.
- Поместите контейнер в положение 1 системы обнаружения. Выберите название буфера промывки в выпадающем списке столбца Реагент и нажмите кнопку Добавить. Повторите эти шаги, чтобы добавить дополнительные реагенты в последующие строки, включая блокирующий раствор.
- Настройте белковый протокол для IHC. Нажмите Настройка протокола. Выделите строку, соответствующую нужному протоколу, и нажмите кнопку Копировать. Введите Имя и заполните все другие соответствующие поля в окне Изменение свойств протокола .
- Установите флажок Показать шаги стирки. Убедитесь, что поля Inc (min) и DispenseType верны для каждого реагента (10 мин для блокирующего раствора, 0 мин для буфера промывки и 150 мкл для каждого DispenseType). Нажмите кнопку Сохранить.
- Подготовьте исследование. Заполните контейнер в позиции 1 буфером для стирки. Заполнить 150 мкл на слайд и 5 мл мертвого объема; оставьте крышку открытой. Повторите эти шаги для контейнера в позиции 2, который должен быть заполнен блокирующим решением. Этот контейнер должен иметь 150 мкл на слайд и 350 мкл мертвого объема.
- Загрузите лоток для контейнеров с реагентами на машину. Разрешите системе выполнять меры по распознаванию контейнеров и подтверждению томов. Нажмите на настройка слайдов | Добавить исследование. Введите идентификатор исследования и название исследования и выберите 150 мкл в разделе Объем дозирования | требуемый протокол в раскрывающемся списке Протокол подготовки (предлагается Bake and Dewax ). Выделите исследование и нажмите « Добавить слайд».
- Выберите исследуемую ткань по типу ткани | 150 мкл при объеме дозирования | Одиночный и рутинный из раскрывающихся списков Режим окрашивания. Выберите процесс (IHC для текущего исследования) | Имя решения блокировки в раскрывающемся списке поля Маркер | Протокол IHC DSP в поле Окрашивание вкладки Протоколы | * Выпечка и депарация для приготовления | * HIER 20 мин с ER1 для HIER. Оставьте поле Enzyme пустым.
- Повторите этот процесс для каждого слайда. Нажмите «Закрыть» после завершения, а затем нажмите « Печать наклеек». Отметьте все наклейки на слайдах, которые еще не напечатаны для текущего исследования , и нажмите «Печать». Прикрепите метки к верхней части слайдов.
- Загружайте и запускайте слайды. Загрузите слайды в лоток для слайдов, убедившись, что образец и этикетка обращены вверх. Поместите плитки обложки поверх слайдов, убедившись, что слайды ориентированы с вкладками внизу. Загрузите лотки для слайдов на инструмент.
- Нажмите светодиодную кнопку, чтобы опустить лоток и позволить инструменту начать сканирование и распознавание слайдов. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать эксперимент.
- Завершите эксперимент. Нажмите светодиодную кнопку, когда она мигает зеленым цветом, указывая на завершение запуска. Снимите лоток с инструмента и осторожно поднимите крышку плитки с каждого слайда. Поместите слайды в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), удалите избыточный буфер и очертите каждый участок ткани гидрофобной ручкой, чтобы создать гидрофобный барьер.
3. Инкубация антител и окрашивание ядер17
- Выберите панель антител для локализации интересующих антигенов (см. Таблицу 1 для антител, используемых в этом эксперименте).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело уже конъюгировано с олигонуклеотидом ДНК с УФ-фоторасщепляющимся сегментом (PC-oligo), который однозначно идентифицирует его (индексирование олиго, рисунок 2). - Сделайте рабочий раствор антитела-PC-олиго, добавив на каждый слайд 8 мкл каждого антитела (разведенного 1:40) в панель. Используйте блокирующий реагент в качестве разбавителя, чтобы достичь конечного объема 200 мкл для каждого слайда. Инкубировать в течение ночи при 4 °C (рисунок 3, этап 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологические маркеры, биологические красители или флуоресцентно меченые антитела также могут быть добавлены в раствор на этом этапе. - На следующий день поместите горку в банку Coplin и вымойте 3 x 10 минут в 1x TBS-T. Постфикс в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре, затем 2 х 5 мин в 1x TBS-T.
- Добавьте ядерное пятно SYTO13 (разбавленное 1:10 в 1x TBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Вымойте 2x с 1x TBS-T, а затем сохраните слайд в 1x TBS-T.
4. Флуоресцентная визуализация, идентификация ROI и УФ-фоторасщепление на приборе DSP17
- Наведя указатель мыши на Пункт сбора данных в Центре управления выберите Создать/Продолжить выполнение.
- Поместите слайд в держатель слайда с наклейкой к пользователю. Опустите зажим лотка для слайдов, следя за тем, чтобы ткань была видна в удлиненном окне. Добавьте 6 мл buffer S.
- Следуйте инструкциям в Центре управления. Увеличьте масштаб между различными осями с помощью ползунков X и Y, чтобы очертить область для сканирования. Выберите Сканировать. Разрешите сканирование продолжаться до тех пор, пока не будет сфотографирована вся определенная целевая область.
- Создайте 20-кратное изображение. Определите рентабельность инвестиций автоматически или вручную (рисунок 3, шаг 2). Чтобы следовать этому протоколу, выберите три круглых ROI одинакового размера (диаметр 250 мкм) для каждого ядра ткани (рисунок 4, внизу).
ПРИМЕЧАНИЕ: ROI настраиваются по размеру и форме. В каждом разделе можно выбрать несколько ROI. В этом эксперименте циклические ROI определяются вручную. - Подтвердите окупаемость инвестиций, нажав кнопку Выход из рабочей области сканирования . Подождите, пока ультрафиолетовый свет расщепляет олиго от антител.
- После завершения процесса очистки инструмента выберите Новый сбор данных , чтобы продолжить работу с текущими слайдами или пластинами. В противном случае выберите Удалить слайды и микропластины.
- Откройте окно Finalize Plate , дважды щелкнув область значка пластины в правом нижнем углу Центра управления. Если известен номер лота пакета кода гибридизации (Hyb) (#), введите номер и нажмите « Обновить» (необязательно на этом шаге). Нажмите На кнопку Завершить.
- Отсоедините держатель слайда и пластину сбора, следуя инструкциям. Храните слайды в TBS-T. Если слайды не будут использоваться в течение длительного времени, накройте их водной средой и крышкой.
5. Считывание белка17
- Используйте проницаемое уплотнение и высушите аспираты при 65 °C в термоциклере с открытым верхом. Добавьте 7 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и перемешайте. Инкубируйте на RT в течение 10 минут, а затем быстро раскрутите.
- Выберите соответствующие уравнения Probe R и Probe U из таблицы 2 , чтобы направлять создание смеси зонд/буфер. Основываясь на количестве Гиб-кодов, необходимых для гибридизации в настоящем эксперименте, примените уравнение (1), как показано ниже. Быстро перемешайте и раскрутите.
# Hyb Codes Probe R Рабочий пул Probe U Буфер гибридизации рабочего пула n = _____ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Добавьте 84 мкл смеси зондов и буферов в каждый пакет кода Hyb, который будет использоваться. Проведите пальцем, чтобы смешать и вращать вниз. В свежей 96-луночной гибридизационной пластине добавьте 8 мкл каждой Hyb Code Master Mix во все 12 скважин указанного ряда.
- Перенесите 7 мкл с коллекторной пластины DSP в соответствующую скважину в пластине гибридизации. Аккуратно перемешать. Термоуплотняйте и выполняйте быстрый отжим. Затем инкубируют в течение ночи при 67 °C. Охладите тарелку на льду и выполните быстрое вращение.
- Выложите продукты hyb из каждой скважины в ленточную трубу, аккуратно прокачивая каждую скважину 5x для смешивания. Закройте ленточную трубку и открутите вниз. Заморозьте все оставшиеся несмотанные продукты hyb при -80 °C. Загрузите ленточные трубы в систему анализа.
- Сохраните CDF-файл на USB-накопитель, а затем перенесите данные с DSP-инструмента в цифровой анализатор. Завершите настройку, выполнив следующие действия.
- Загрузите расходные материалы и объединенные образцы на подготовительную станцию. На экране нажмите Начать обработку. Выберите Высокая чувствительность, а затем Далее. Нажмите Выбрать все для количества скважин с пробами | Финишная | Далее по | уведомлений по электронной почте Начало.
- Как только подготовительная станция будет готова, запечатайте картридж и перенесите на цифровой анализатор. Нажмите Начать подсчет, выберите Положение рабочей области, нажмите Загрузить существующий CDF-файл и выберите ранее загруженный файл. Нажмите Готово, снова выберите положение этапа, нажмите Готово | Запустите программу.
- Сохраните сжатый файл файлов преобразования счетчика репортеров из системы анализа на USB-накопитель, а затем вставьте диск в устройство DSP. В Центре управления DSP наведите указатель мыши на пункт Сбор данных и выберите пункт Отправить счетчики. Выберите соответствующий ZIP-файл.
6. Анализ данных17
- Щелкните Записи в Центре управления DSP. Чтобы просмотреть проверки в очереди, выберите Добавить выбранные сканирования в очередь | Моя очередь анализа. Выберите Новое исследование из очереди после наведения указателя мыши на параметр Анализ данных в Центре управления.
- Выберите Контроль качества в разделе Параметры панели задач. Продолжите использовать значения по умолчанию или при необходимости измените. Выберите Выполнить контроль качества и просмотрите сетку результатов. Щелкните Выполнить контроль качества , чтобы продолжить и создать новый набор данных, нормализовав значения до положительных элементов управления гибридизацией.
- Импортируйте новые теги в файл XLSX. Выберите Управление заметками в области Сканирование , а затем загрузите шаблон, вставьте теги и импортируйте файл.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: После выполнения контроля качества настройте данные с помощью других параметров панели инструментов. Используйте инструменты на панели Визуализации для построения преобразованных данных.
- Перейдите по серому раскрывающемуся списку параметров, чтобы создать каждый график на панели Визуализации . Выберите определенную область на графике, чтобы визуализировать соответствующие выделенные сегменты на панели Сканирование , и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы создать теги или группы. В разделе Сводка набора данных просмотрите графики из раздела Нормализация, Масштабирование и другие параметры анализа и отображения.
- Сохраните визуализацию, щелкнув значок Сохранить; просмотрите визуализации, уже сохраненные в разделе Сводка. Нажмите кнопку Экспорт (.svg), чтобы экспортировать визуализацию в .svg формате. Экспортируйте данные, на которых основана визуализация, нажав кнопку Экспорт (.xlsx ). Экспортируйте все данные, содержащиеся в определенном наборе данных, наведя курсор на имя набора данных во второй панели и щелкнув значок экспорта .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты эксперимента DSP, проведенного на образцах глиобластомы. Представлена тепловая карта, иллюстрирующая один из методов визуального сбора данных с помощью программного обеспечения DSP. Строки представляют белковые мишени, и каждый столбец соответствует интересующей области. Цветовая гамма от синего до красного обозначает низкую и высокую экспрессию соответственно. Изменчивость цвета в пределах ряда отражает региональную гетерогенность белка и предполагает возможную пространственную связь с дифференциальной экспрессией белка. Например, в настоящем эксперименте S100 и CD56 универсально высоки, потому что они являются нейронными маркерами.
Маркеры с наибольшей вариабельностью включали B7-H3, Ki-67, CD44 и фибронектин. Эти маркеры имеют важные связи с пролиферацией опухоли, миграцией и метастазированием соответственно. Таким образом, разумно, что они будут демонстрировать региональную изменчивость между образцами злокачественного ядра, злокачественной инвазии и незлокачественной ткани. Также возможно численное представление данных; файл, содержащий значение выражения каждого белкового маркера в пределах ROI в табличной форме, может быть экспортирован для математического и статистического анализа. Это значение выражения создается цифровой функцией подсчета, доступной через DSP, которая количественно определяет микроаспирированные PC-олиго в пределах каждой окупаемости инвестиций (рисунок 1 и рисунок 2).
Рисунок 1: Определение областей, представляющих интерес в микрочипе тканей из биопсии глиобластомы. Верхний, гематоксилиновый и эозин-окрашенный участок тканевого микрочипа, содержащий несколько биопсий ядра диаметром 2 мм от трех пациентов с глиобластомой. Внизу, области интереса, определенные на флуоресцентном изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фоторасщепляемые олигонуклеотиды. Антитела или антисмысловые олигонуклеотидные зонды для белковых или РНК-мишеней, соответственно, ковалентно связаны с олигонуклеотидами с фоторасщепляемыми линкерами. Участки тканей окрашиваются зондами. Затем ультрафиолетовый свет направляется на ROI, чтобы освободить олигосы ПК, которые подсчитываются в цифровом виде. Эта цифра была изменена с9, с разрешения Springer Nature (copyright 2020). Сокращения: PC-oligos = фоторасщепляющиеся олигонуклеотиды; ROI = интересующие регионы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедура DSP. 1) Обработка тканей: Тканевый слайд окрашивается олигоконъюгированными антителами или РНК-зондами. 2) Выбор ROI: слайд ткани визуализируется, а ROI очерчены вручную или автоматически на основе определенных флуоресцентных паттернов. 3) Расщепление сопряженных олигонуклеотидов: ультрафиолетовый свет направлен на ROI, что приводит к расщеплению фоторасщепляемых олигонуклеотидов. 4) Коллекция PC-oligo: PC-oligos аспирируются в микрокапиллярную трубку. 5) Покрытие: Аспирированные PC-олиго осаждаются в микротитерную пластину. 6) Повторите: Шаги 3-5 повторяются для каждого ROI; между каждым циклом выполняется тщательная стирка. 7) Количественная оценка: Пространственно разрешенные пулы PC-олиго могут быть гибридизированы с флуоресцентными штрих-кодами; это позволяет осуществлять цифровой подсчет примерно 1 миллиона связывающих событий на окупаемость инвестиций. Альтернативно, PC-олиго могут быть количественно определены с помощью NGS, в котором вся микротитерная пластина объединена в одну трубку и секвенирована. Затем показания переводятся в цифровые подсчеты и сопоставляются с их исходной рентабельностью инвестиций, создавая визуальную карту экспрессии белка или РНК в каждом участке ткани. Эта цифра была изменена с9, с разрешения Springer Nature (copyright 2020). Сокращения: DSP = цифровая пространственная обработка; PC-oligos = фоторасщепляемые олигонуклеотиды; ROI = интересующие регионы; NGS = секвенирование следующего поколения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативная тепловая карта из эксперимента DSP. Столбцы представляют отдельные интересующие области. Строки представляют собой белковую мишень. Низкая экспрессия показана синим цветом, а высокая — красным. Аббревиатура: DSP = цифровая пространственная обработка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Профилирование иммунных клеток GeoMx - человек | Пан-опухолевый модуль |
| ПД-1 | МАРТ1 |
| СД68 | Нью-Йорк ЭСО-1 |
| HLA-DR | С100Б |
| Ки-67 | Бкл-2 |
| Бета-2 микроглобулин | ЭпкАМ |
| CD11c | Ее2 |
| СД20 | ПТЕН |
| СД3 | ЭР-альфа |
| СД4 | Pr |
| СД45 | |
| СД56 | |
| СД8 | |
| CTLA4 | |
| ГЗМБ | |
| ПД-Л1 | |
| Панк | |
| СМА | |
| Фибронектин | |
| Рб ИгГ | |
| Г-жа IgG1 | |
| Г-жа IgG2a | |
| Гистон H3 | |
| С6 | |
| ГАПДХ |
Таблица 1: Репрезентативный образец белков, который может быть оценен с использованием предварительно разработанных панелей антител.
| Зонд U Рабочий пул | ||||||
| Модуль 2 Зонд R | Другие модули | Вода, обработанная DEPC (микролитра) | общий объем (микролитры) | Зонд U Master Stock (микролитр) | Вода, обработанная DEPC (микролитр) | общий объем |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Таблица 2: Коды гибридизации и рабочие пулы Probe R и Probe U. Аббревиатура: hyb = гибридизация; DEPC = диэтилпирокарбонат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Учитывая разнообразие белков, которые потенциально могут влиять на агрессивность глиом, и представление о том, что некоторые из этих белков остаются неоткрытыми, высокопроизводительный метод количественной оценки белка является идеальным технологическим подходом. Кроме того, учитывая, что пространственные данные в онкологических образцах часто коррелируют с дифференциальной экспрессией18, включение пространственного профилирования в подход к количественной оценке белка позволяет проводить более эффективный анализ.
Высокопроизводительный подход DSP также позволяет использовать его в подходе, подобном дробовику, который идеально подходит для обнаружения потенциальных новых биомаркеров заболевания и реакции на терапию. В двух исследованиях меланомы DSP использовали для оценки ответов на комбинированную терапию ипилимумабом и ниволумабом по сравнению с монотерапией ниволумабом19 и на неоадъювантную комбинированную терапию ипилимумабом и ниволумабом по сравнению со стандартным адъювантным лечением20. В обоих исследованиях профилирование DSP различных белковых мишеней после лечения продемонстрировало дифференциальную относительную экспрессию ключевых иммунологических маркеров, предполагая роль потенциальных биомаркеров терапевтического ответа.
DSP также облегчает определение конечного патологического значения сложных процессов молекулярного уровня. Например, отличительной особенностью инвазивных глиом является их склонность к миграции непосредственно через внеклеточный матрикс (ECM), а их миграционный путь часто направляется сосудистыми и белыми трактами 1,2. Изменчивость экспрессии белка микроокружения тканей является отличительной чертой эпителиально-мезенхимального перехода, который приводит к инвазии. В нескольких исследованиях изучалось, как глиомы могут повышать регуляцию матричных металлопротеиназ (MMP), что приводит к разрушению окружающего ECM и увеличению инвазивности 21,22,23. Визуализируя и количественно оценивая кумулятивный, нисходящий эффект этого дифференциального регулирования, DSP обеспечивает широкомасштабный, целостный анализ.
Ключевым фактором, определяющим злокачественный потенциал глиом, является их способность взаимодействовать и манипулировать иммунной защитой хозяина. Подобно другим солидным опухолям, глиомы используют различные механизмы, чтобы уклониться от иммунонаблюдения хозяина и нарушить активацию белков, критически важных для установления иммунного ответа. Последние достижения в области иммуноонкологии были сосредоточены на выявлении иммуногенных белков, которые экспрессируются или эксплуатируются опухолями. На переднем крае этих разработок находится использование Т-клеток для обнаружения иммунологически активных опухолевых антигенов, против которых онколитические вирусы могут быть направлены24,25, и разработка ингибиторов контрольных точек против ингибирующих Т-клеток белков (например, PD1 / PDL1 и CTLA4) для потенцирования иммунитета хозяина против опухолей26,27 . Другие стромальные популяции, которые занимают видное место в микроокружении глиомы, включают макрофаги, микрососудистые эндотелиальные клетки, иммунные клетки и недавно идентифицированную субпопуляцию, называемую «стромальными клетками, связанными с глиомой» (GASCs)28. Взаимодействие этих клеток с хемокинами, цитокинами и компонентами ECM имеет важные последствия для пролиферации опухоли, инвазии и ответа на лечение и, таким образом, служит важными целями для региональной количественной оценки и сравнения с помощью таких технологий, как DSP.
Протокол DSP удобен для пользователя и позволяет выполнять несколько уровней настройки. Поскольку большая часть процесса количественной оценки автоматизирована, основные зависящие от пользователя шаги направлены на достижение максимально возможной чувствительности и специфичности обнаружения целей. Таким образом, ключевые этапы протокола включают определение пятна для первоначальной флуоресцентной визуализации образца, разграничение ROI и выбор панелей антител.
При разработке протокола окрашивания важно сначала идентифицировать мишень, которая, вероятно, продемонстрирует количественные различия между различными областями образца, соответствующие критической характеристике или поведению ткани происхождения. Затем необходимо выбрать агент, который будет эффективно связывать целевой объект. Например, если кто-то надеется визуализировать области гиперплазии или ядерной атипии, может быть выбран H & E или ядерное пятно; в качестве альтернативы, если целью является визуализация изменений в экспрессии гена, который, как известно, связан со злокачественными или предраковыми тканями, может быть выбрано флуорофорно-конъюгированное антитело. Сами опухолевые клетки могут быть специально помечены в случае мутантных опухолей IDH1-R132H. Настоящий протокол может быть изменен путем добавления флуоресцентно меченого IDH1-R132H в качестве морфологического маркера (этап протокола 3.2). Может быть использовано до четырех пятен на образец. После того, как визуализация окрашенной ткани произошла, назначаются ROI. Выбор ROI должен отражать, где ожидаются значительные различия в экспрессии белковых мишеней. Ключевые соображения при выборе ROI включают размер (диаметр 10-600 мкм), форму (круг, прямоугольник или нарисованный пользователем) и сегментацию (дальнейшее разграничение субрегионов в рамках одной окупаемости инвестиций, предлагая дополнительный потенциальный уровень анализа). Эти переменные должны быть оптимизированы для наиболее эффективного захвата пространственных вариаций в целевой экспрессии, которая ожидается на основе выбранной панели антител.
Выбор панели антител имеет решающее значение, так как дифференциальная экспрессия антител в конечном итоге служит конечной точкой исследования. При выполнении этого этапа важно учитывать, какие маркеры могут проявлять экспрессию, которая коррелирует положительно или отрицательно со стадиями по спектру развития опухоли, от доброкачественных до преинвазивных, инвазивных или злокачественных. Также важно тщательно рассмотреть свойства как ткани происхождения, так и типа опухоли, поскольку обе эти особенности могут влиять на экспрессию определенных маркеров.
Поскольку большая часть процесса автоматизирована, любые недостатки в процедуре, как правило, связаны с неисправностью оборудования или программного обеспечения, что обеспечивает ограниченные возможности устранения неполадок пользователя. Проблемы, которые могут возникнуть, включают нарушение встроенной меры контроля качества (QC) (предназначенной для пометки и потенциального пропуска данных, указывающих на низкое отношение сигнал/шум, низкое количество и неадекватное обнаружение целей), аберрантные обновления программного обеспечения и процедурные проблемы (например, преждевременное прекращение различных этапов). При возникновении этих проблем рекомендуется, чтобы пользователь обратился к производителю за удаленной поддержкой. В качестве альтернативы, если пользователь сталкивается с проблемами внутренних данных (например, низкое количество ядер в целом, низкая изменчивость в экспрессии между ROI), он может рассмотреть возможность повторения более ранних шагов в процедуре (например, перепубливание данных из исходного TMA, переопределение ROI). Также важно рассматривать изменения плотности тканей как потенциальный фактор антигенной продукции и, следовательно, экспрессии антител; следовательно, ткани одинаковой плотности должны быть отобраны для анализа.
Меры контроля встроены в протокол. Программа обеспечивает как внутренний положительный, так и отрицательный контроль, который учитывает изменения в гибридизации PC-олиго с флуоресцентными штрих-кодами. Домашние белки предлагают еще один положительный контроль, который может дополнительно служить фактором нормализации на основе клеточности.
Способность определять ROI, в пределах которых происходит количественная оценка, является основой возможности пространственного профилирования DSP. Это настраиваемое разграничение ROI знаменует собой критический и отличительный шаг в рамках протокола. Возможность создания ROI размером с одну клетку обеспечивает региональную точность количественной оценки белка или нуклеиновых кислот, а возможность определения нескольких ROI и количественной оценки их содержимого в тандеме с помощью мультиплексного анализа дает подход с высокой пропускной способностью.
Когда ROI выбраны для представления патологически различных областей в образце глиомы (например, некротических, периваскулярных), протеомное профилирование и региональное сравнение могут выявить механизмы распространения и прогрессирования опухоли. Например, IHC использовался для региональной количественной оценки экспрессии гипоксийно-индуцируемого фактора (HIF-1α) в образцах глиобластомы и выявил более высокую экспрессию вблизи некротических областей по сравнению с периваскулярными зонами29. Это согласуется с несколькими исследованиями, указывающими на роль гипоксии в опухолевом генезе глиомы.
Региональная изменчивость также широко изучена среди компонентов иммунных клеток микроокружения опухоли. Макрофаги / микроглия составляют преобладающую популяцию иммунных клеток в глиомах и были всесторонне изучены на региональной основе. Было показано, что субпопуляции опухолеассоциированных макрофагов (TAM) играют различную роль в прогрессировании опухоли в зависимости от их расположения в опухоли и микроокружении. Те, кто находится внутри инвазивного края опухоли, разрушают базальную мембрану, способствуя распространению; те, что находятся в гипоксических областях, оказывают ангиогенное действие, способствуя росту; те, кто находится в непосредственной близости от сосудистой системы опухоли, секретируют EGF и связанные с ним факторы для направления стромальных опухолевых клеток к кровеносным сосудам, что приводит к метастазированию30. Эти критические, пространственно зависимые свойства демонстрируют ценность региональных протеомных данных в биологии рака и представляют собой важное дополнительное применение DSP для характеристики популяций иммунных клеток в опухоли и ее микроокружении.
Метод имеет несколько ограничений, включая стоимость и относительно небольшое количество мишеней, которые доступны в основных панелях антител. Кроме того, хотя субклеточное разрешение невозможно с DSP, оно будет возможно с предстоящими новыми технологиями31. Несмотря на эти ограничения, DSP является мощным методом для определенных типов целевых, ранее неразрешимых вопросов в клеточной биологии глиомы. Эта инновационная технология предоставляет исключительную возможность для открытия новых биологических перспектив путем точной оценки различных белковых мишеней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку Лаборатории клинической геномики и передовых технологий в отделе патологии и лабораторной медицины системы здравоохранения Дартмута Хичкока. Авторы также признают общий ресурс патологии в Дартмутском онкологическом центре с грантом поддержки онкологического центра NCI 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
