Summary
在这里，我们介绍了一种详细的RNA干扰在 嗜木杆菌 中浸染的方法，以促进基因功能的研究。
Abstract
松林线虫， 伯萨菲伦丘斯嗜木杆菌，是全球最具破坏性的入侵物种之一，导致松树枯萎并最终死亡。尽管人们认识到它们的经济和环境意义，但迄今为止还不可能使用传统的正向遗传学和转基因方法研究植物寄生线虫（PPN）的详细基因功能。然而，作为一种反向遗传学技术，RNA干扰（RNAi）有助于研究线虫的功能基因，包括 嗜木杆菌。
本文概述了一种针对嗜木杆菌ppm-1基因的RNAi的新方案，据报道，该方案在其他致病性线虫的发育和繁殖中起着至关重要的作用。对于RNAi，T7启动子通过聚合酶链反应（PCR）与靶片段的5′末端连接，并通过体外转录合成双链RNA（dsRNA）。随后，通过将线虫浸泡在与合成神经刺激剂混合的dsRNA溶液中来完成dsRNA递送。将嗜木杆菌的同步幼体（约20，000个个体）洗涤并在浸泡缓冲液中的dsRNA（0.8μg/ mL）中浸泡24小时，在25°C的黑暗中。
将相同数量的线虫置于没有dsRNA的浸泡缓冲液中作为对照。同时，将另一个相同数量的线虫置于以绿色荧光蛋白（gfp）基因dsRNA作为对照的浸泡缓冲液中。浸泡后，使用实时定量PCR测定靶标转录本的表达水平。然后通过对表型的微观观察和比较各组之间成人的体型来确认RNAi的效果。目前的方案可以帮助推进研究，以更好地了解 嗜木杆菌 和其他寄生线虫基因的功能，从而通过基因工程制定控制策略。
Introduction
植物寄生线虫（PPNs）对粮食安全和森林生态系统构成持续威胁。据估计，它们每年造成1000亿美元的经济损失1，其中最成问题的主要是根结线虫、囊肿线虫和松木线虫。松木线虫， 伯萨菲伦丘斯嗜木虫，是一种迁徙的内寄生虫线虫，是松枯萎病2的致病病原体。它对全世界的松树林造成了极大的伤害3.使用Van Megen等人的术语4， 嗜木杆菌 是副杆菌科的成员，属于进化枝10，而大多数其他主要植物寄生虫属于进化枝12。
作为一种独立且最近进化的植物寄生虫， 嗜木杆菌 是比较研究的有吸引力的模型。迄今为止，已经对属于分支12的根结线虫和囊肿线虫进行了大量研究，它们是专性，久坐不动的内寄生虫，是一些研究最深入的线虫。然而，在这一重要领域进行进一步研究带来了一个重大挑战：寄生基因的功能是研究的瓶颈。功能研究通常包括异位表达和敲除/切除实验，但依赖于线虫的有效遗传转化方案。因此，PPN中的反向遗传学几乎完全依赖于RNAi的基因沉默。
RNAi是一种广泛存在于真核细胞中的机制，通过引入双链RNA（dsRNA）5来沉默基因表达。迄今为止，dsRNA诱导的转录后基因沉默机制已在所有研究的真核生物中被发现，RNAi技术作为功能基因组学研究和其他应用的工具，在许多生物体中得到了迅速发展。自1998年在 秀丽隐杆线虫 中发现RNAi机制6以来，RNAi技术已成为鉴定线虫基因功能的有效方法，并被提出作为有效控制致病性线虫的新方法7。
从技术上讲，RNAi很容易将幼体浸泡在dsRNA中就足够了;然而，这种方法的有效性和可重复性随线虫物种和靶基因8而有很大差异。使用长dsRNA作为触发因素，研究了根结线虫 Meloidoyne隐性RNAi途径中涉及的20个基因的沉默，导致不同的反应，包括一些基因表达的增加和无变化9。这些结果表明，靶基因可能对RNAi敲低的反应不同，因此有必要对它们作为通过RNAi控制线虫的靶标的适用性进行详尽的评估。然而，目前缺乏对 嗜木杆菌的发育和生殖生物学的研究。
作为先前工作10，11，12，13的延续，我们在这里描述了应用RNAi研究嗜木杆菌ppm-1基因功能的方案，包括dsRNA的合成，合成神经兴奋剂浸泡和定量聚合酶链反应（qPCR）检测。从这种实验方法中获得的知识可能会显着有助于了解基本的生物系统和预防松树枯萎病。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该研究获得浙江农林大学动物实验委员会批准。 嗜木杆菌 分离株NXY61最初是从中国浙江省宁波地区的一种患病 的马尾松 中提取的11。
1. 基因克隆
注意：有关本实验方案中使用的引物的详细信息，请参阅 材料表 。
- 收集线虫。
- 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上的灰霉病菌丝体上培养木霉菌菌株，在25°C下培养3-5天。
- 使用贝尔曼漏斗方法14收集线虫。
- 将夹紧的橡胶管放在漏斗下方，并将两层滤纸放在漏斗的口中。将真菌培养物转移到漏斗中，并加水以浸入真菌垫中。等待2小时，然后收集线虫。
- 根据以下步骤，使用总RNA提取试剂从线虫中提取总RNA（参见 材料表）11 。
- 将500μL提取试剂和100μL磁珠加入2 mL离心管中。吸出20μL线虫并将样品转移到研磨机中，以9，000× g 研磨30秒。孵育5分钟，然后在12，000× g 和4°C下离心10分钟。
- 将上清液转移到新的离心管中。加入100μL氯仿，盖上管盖，并通过倒置管几次来混合。孵育3分钟，然后在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
- 将上清液转移到新的离心管中。加入250μL异丙醇并剧烈涡旋。以12，000× g 离心10分钟。
- 弃去上清液。加入500μL75%乙醇洗涤RNA，然后涡旋样品。在12，000× g 和4°C下离心5分钟。
- 将RNA沉淀风干5分钟。
- 将沉淀重悬于30μL无RN酶的水中。
- 使用以下公式计算RNA浓度：A260×稀释×40 = μg RNA / mL。计算 A260/A280 比率。
注意：~2的比率被认为是纯的。
- 对优质RNA进行逆转录以获得cDNA模板。
- 设计并使用一对特定的引物ppm-1-F/R（参见材料表），以扩增嗜木杆菌（GenBank种质编号QTZ96795）中Bx-ppm-1基因的部分编码序列。
- 按照标准克隆方案11将ppm-1基因序列克隆到含有T7启动子的pGEM-Teasy载体中。
- 按如下方式设置PCR反应：2μLcDNA，25μL2x Ex Taq聚合酶预混料，2μL每个引物（10 pmol / l）和无菌蒸馏水至最终体积为50μL。
- 按如下方式进行扩增程序：在94°C下5分钟;随后在94°C下进行35次循环，在30 s，在55°C下为30s，在72°C下为1分钟;并在72°C下进行最后一次扩展步骤5分钟。
- 将扩增产物克隆到pGEM-T简易载体中进行测序。
2. 双链氨基酸的合成
- 使用PCR制备用于dsRNA合成的DNA模板，引物旨在两端添加T7启动子位点。将T7启动子序列添加到引物的5'末端。
- 使用含有 ppm-1 基因片段（894 bp）的质粒作为PCR的模板，并回收含有T7启动子11的片段。使用上述PCR程序和系统。
- 使用 体外 转录试剂盒合成dsRNA11。
- 将冷冻试剂解冻在冰上。
- 向离心管中加入2μL10x反应缓冲液，2μL酶混合物和1μgDNA。加入不含核酸酶的水以产生标准的4μL反应。然后，将等体积的四种核糖核苷酸溶液（ATP，CTP，GTP和UTP）混合在一起，并向管中加入8μL混合物。充分混合并在37°C下孵育4小时。
- 加入1μLDNase，充分混合，并在37°C下孵育15分钟。
- 停止反应并加入30μL无核酸酶水和30μLLiCl沉淀溶液以沉淀RNA。彻底混合。在-20°C孵育过夜。
- 在12，000× g 和4°C下离心15分钟。 弃去上清液。
- 加入1毫升75%乙醇洗涤RNA。涡旋样品并在12，000× g 和4°C下离心10分钟。
- 风干RNA沉淀3分钟。
- 将沉淀重悬于30μL无RN酶的水中。
- 使用分光光度计分析dsRNA的质量。将1μLdsRNA样品移液到测量基座上，并将波长设置为340nm。在1.0%琼脂糖凝胶上可视化产品。
3. 浸泡
- 将4μL5x浸泡缓冲液（0.05%明胶，5.5mM KH2PO4，2.1mM NaCl，4.7mM NH4Cl，3mM亚精胺）与dsRNA和ddH2O混合，产生总体积为20μL，最终RNA浓度为0.8μg/ mL。
- 获取J2幼虫。
- 从真菌培养物中收集线虫并将其转移到直径为6厘米的玻璃培养皿中。在培养皿中加入10毫升水，以确保线虫可以自由游泳。将线虫放在盘子里30分钟，等待鸡蛋粘附在底部。
- 小心地清除水和线虫，确保不要打扰鸡蛋。重复这些步骤，直到所有的幼虫和成虫都被移除，只留下盘子里的鸡蛋。
- 在25°C的黑暗中孵化收集的卵24小时，以获得J2幼虫。收集J2幼虫，将它们放入管中，并用ddH2O洗涤它们三次，用于RNAi实验15。
- 将J2幼虫转移到含有dsRNA溶液的2mL管中，并加入间苯二酚溶液（包裹在锡箔中并溶解在水中）以产生1.0%的最终浓度。在25°C的摇床上以15×g 离心孵育幼虫24小时，以确保幼虫有效吸收dsRNA。
- 在没有dsRNA探针或GFP dsRNA探针作为对照的情况下，将相同数量的线虫浸泡在浸泡缓冲液中。使用GFP基因（gfp， M62653.1）作为非内源性对照，并使用基因特异性引物T7-GFP-F / R合成 gfp 的dsRNA。
4. 二聚氯乙烯检测
- 用ddH 2 O清洁J2幼虫，包括具有靶基因干扰，GFP基因干扰和未受干扰的对照组的幼虫。使用上述方法从每组中提取总RNA。
- 启动二聚氯乙烯。
- 使用所需的软件设计 q-ppm-1-F/R 引物（参见 材料表）。
- 在含有1 μL cDNA，6 μL荧光预混料，0.4 μL每个引物（10 pmol / l）和无菌蒸馏水的12 μL中设置qPCR反应。
- 按如下方式进行qPCR：在95°C下2分钟;随后在95°C下循环40次，每次10秒，在55°C下30秒，在72°C下1分钟。
- 使用 actb 基因（基因库加入号EU100952）和 tbb-2 基因（基因库加入号MT769316）或其他基因作为内部参考基因，评估RNAi15后基因表达水平的变化。
- 根据周期阈值（Ct）值和溶解曲线，采用2-ΔΔCt 方法估算靶基因的相对表达水平，验证干扰效率。
- 从靶基因的Ct值中减去每个样品的内部参考基因的Ct值，得到ΔCt值。然后，从对照组的ΔCt值中减去干扰组的ΔCt值，得到ΔΔCt值。
注：ΔΔCt 值大于 0 表示干扰有效。
- 从靶基因的Ct值中减去每个样品的内部参考基因的Ct值，得到ΔCt值。然后，从对照组的ΔCt值中减去干扰组的ΔCt值，得到ΔΔCt值。
5. 评估RNAi后线虫成虫的体长
- 在RNAi之后，在PDA板的双 歧杆菌 草坪上培养J2幼虫直到成年期，在25°C15下培养60小时。
- 使用贝尔曼漏斗方法收集成虫（见步骤1.1.2.1）14。
- 在显微镜下获取成年线虫的图像，并使用ImageJ软件（或其他测量软件）测量体长。
- 使用 ImageJ 测量长度，方法是选择“ 分析|设置比例。如果距离已知，请输入绘制的直线的长度值。输入长度单位。
- 选中全局复选框（对所有图片使用此标准），然后单击确定以选择要测量的长度，并在要测量的图像上使用直线进行测量。
- 使用命令 Ctrl+M （测量）显示结果并将其记录在 结果 窗口中。
- 测量50条雄性和50条雌性线虫进行统计分析12。
- 通过计算每个样本的平均值和标准偏差来分析数据。使用学生 t 检验比较来自不同组的样本均值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNAi后嗜木杆菌ppm-1表达分析
用GFP dsRNA浸泡的嗜木杆菌ppm-1基因和用靶基因dsRNA浸泡的ppm-1基因的相对表达水平分别为0.92和0.52（ddH2O处理的对照组的ppm-1基因表达水平设置为1）（图1）。因此，外源性dsRNA对嗜木杆菌的ppm-1表达没有影响;然而，ppm-1 dsRNA可以有效地抑制靶基因的表达。
ppm-1表达对木生芽孢杆菌生长发育的影响
在RNAi之后，成虫的大小显着减小（图2），导致SMA（小体型）突变表型。虽然RNAi治疗的个体发展到性成熟，但他们的体长远小于正常成年人。具体而言，在J2期线虫中进行RNAi后，雌性和雄性的平均体长分别为544.61 μm和526.24 μm。相比之下，对照组女性和男性的平均体长分别为971.86μm和912.31μm（图3），差异显著（P = 0.0322）。
图 1：嗜木杆菌 RNAi 后 ppm-1 基因的表达。 **P < 0.001。缩写：RNAi = 核糖核酸干扰;GFP = 绿色荧光蛋白。请点击此处查看此图的大图。
图2：在嗜木杆菌中ppm-1干扰后成虫的体长减少。 RNAi组的成年男性（A）和女性（C）的图像。对照组成年男性（B）和女性（D）的图像。比例尺 = 50 μm。缩写：RNAi = 核糖核酸干扰。请点击此处查看此图的大图。
图3：ppm-1基因RNAi后嗜木杆菌成虫成人体长的定量和统计分析。 （*P = 0.0322）。缩写：RNAi = 核糖核酸干扰。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然嗜木杆菌的生活史和寄生环境与其他线虫不同，但对这种植物病原体的分子发病机制的研究有限。尽管CRISPR/Cas9基因组编辑技术在秀丽隐杆线虫和其他线虫中的应用取得了巨大进展，但迄今为止，只有应用于嗜木杆菌的RNAi技术已经发表。RNAi是研究线虫基因功能的最强大的工具之一，已被广泛用于阐明嗜木杆菌基因功能，信号转导途径和基因治疗的研究18，19，20。与无脊椎动物模型中使用的基因敲除方法相反，RNAi介导的线虫中靶基因敲除能够快速评估基因功能。
有三种方法可以在 秀丽隐杆线虫中进行RNAi：注射6，浸泡21和喂养6。由于J2幼虫仅在感染后进食，因此浸泡方法通常用于植物寄生线虫的RNAi。浸泡方法的关键步骤是添加神经毒剂以刺激线虫进食。Urwin首先使用章鱼胺刺激两种口腔囊肿线虫物种的J2， 即苍 白球藻和 异端甘氨酸，导致从浸泡溶液22中摄取dsRNA。同样的方法已成功用于诱导根结线虫的J2 隐性肾小球 藻吸收dsRNA 23。间苯二酚还可以诱导J2对隐性分枝杆菌 的dsRNA摄取，并且对于这种线虫24可能比章鱼胺更有效。此外，在浸泡缓冲液中加入亚精胺并延长孵育时间提高了RNAi在线虫25中的效率。浸泡24小时后，dsRNA有效地进入 嗜木杆菌，从而沉默 ppm-1 基因。
因此，该协议为未来研究其他具有吞噬作用的植物寄生线虫的RNAi提供了参考。此外，振动台的悬浮效果在最大化浸泡方法的优势方面起着重要作用。这种方法可以允许同时治疗大量的线虫。当专注于不容易获得突变体的靶基因时，RNAi更容易操作，并且用于评估发育中不同点的影响，因为线虫可以在任何生命阶段浸泡。因此，RNAi可用于研究特定基因在特定发育阶段的功能。Wang等人利用dsRNA浸泡26分析了MAPK对嗜木杆菌繁殖力的影响及其在线虫生长发育中的重要作用。Qiu等人发现，Bxpel1基因下调后，松树中木性双歧杆菌的迁移速度和繁殖力下降，表明该基因是27型嗜木杆菌的重要致病因素。
然而，并非所有线虫中的RNAi都通过dsRNA起作用。杜洛维奇和斯特雷特应用了小的干扰RNA（siRNA）而不是较长的dsRNA来成功地干扰 类圆线虫rati28。在 类圆线虫 中使用 dsRNA 治疗 RNAi 的限制可能与已知参与 dsRNA 摄取的 rsd-6、sid-1 或 sid-2 等基因的缺失有关。RNAi还与位置效应以及暂时和不完全敲除的缺点有关，并且对某些基因和细胞类型（如神经元）的有效性有限29。然而，在 嗜木杆菌 转基因技术取得突破之前，RNAi代表了一种相对有效的研究策略。
RNAi在作物保护方面显示出巨大的潜力。使用RNAi技术，能够产生靶向根结线虫基因的dsRNA的转基因马铃薯已被培育出来，以产生对根结线虫30的完全抗性。靶向昆虫基因的dsRNA的表达可以在没有化学杀虫剂的情况下提供作物保护，并提供不产生外来蛋白质的额外优势，靶基因的数量几乎无限31。因此，在应用于害虫防治的RNAi领域的加速研究将为植物线虫防治提供更好的生物安全性，而不是转基因方法或其他化学防治方法。
综上所述，该协议描述了通过将嗜木杆菌的幼虫直接浸泡在dsRNA溶液中来实现ppm-1基因的dsRNA的制备，以实现RNAi。干扰效应基于幼虫发育成成虫后与对照组相比体型的显着减小，证实了干扰效应，表明ppm-1基因对嗜木杆菌的生长和发育产生影响。本研究为进一步揭示ppm-1的功能提供了理论依据，对指导该植物寄生虫的生物防治具有额外的实用价值。相信随着RNAi技术机制的进一步公开和完善，其在嗜木杆菌防治领域的应用将具有广阔的前景。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（31870637、31200487）资助，浙江省重点研究计划（2019C02024、LGN22C160004）联合资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
