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Biology

पाइनवुड नेमाटोड में आरएनए हस्तक्षेप का अनुप्रयोग, बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

Summary

यहां, हम जीन कार्यों के अध्ययन की सुविधा के लिए बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस में आरएनए हस्तक्षेप की एक विस्तृत भिगोने की विधि पेश करते हैं।

Abstract

पाइनवुड नेमाटोड, बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस, दुनिया भर में सबसे विनाशकारी आक्रामक प्रजातियों में से एक है, जिससे देवदार के पेड़ों की मुरझाने और अंतिम मृत्यु हो जाती है। उनके आर्थिक और पर्यावरणीय महत्व की मान्यता के बावजूद, पारंपरिक फॉरवर्ड जेनेटिक्स और ट्रांसजेनिक विधियों का उपयोग करके पौधे-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) के विस्तृत जीन कार्यों का अध्ययन करना अब तक असंभव रहा है। हालांकि, एक रिवर्स जेनेटिक्स तकनीक के रूप में, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) नेमाटोड के कार्यात्मक जीन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें बी।

यह पत्र बी ज़ाइलोफिलस में पीपीएम -1 जीन के आरएनएआई के लिए एक नए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है, जिसे अन्य रोगजनक नेमाटोड के विकास और प्रजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की सूचना दी गई है। आरएनएआई के लिए, टी 7 प्रमोटर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा लक्ष्य टुकड़े के 5'-टर्मिनल से जुड़ा हुआ था, और डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित किया गया था। इसके बाद, डीएसआरएनए डिलीवरी सिंथेटिक न्यूरोस्टिमुलेंट के साथ मिश्रित डीएसआरएनए समाधान में नेमाटोड को भिगोकर पूरा किया गया था। जाइलोफिलस (लगभग 20,000 व्यक्तियों) के सिंक्रनाइज़ किशोरों को धोया गया और 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 24 घंटे के लिए भिगोने वाले बफर में डीएसआरएनए (0.8 μg /

नेमाटोड की समान मात्रा को नियंत्रण के रूप में डीएसआरएनए के बिना भिगोने वाले बफर में रखा गया था। इस बीच, नेमाटोड की एक और समान मात्रा को नियंत्रण के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जीन डीएसआरएनए के साथ भिगोने वाले बफर में रखा गया था। भिगोने के बाद, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके लक्ष्य टेपों की अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किया गया था। आरएनएआई के प्रभावों की पुष्टि तब फेनोटाइप के सूक्ष्म अवलोकन और समूहों के बीच वयस्कों के शरीर के आकार की तुलना का उपयोग करके की गई थी। वर्तमान प्रोटोकॉल जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से नियंत्रण रणनीतियों को विकसित करने की दिशा में बी ज़ाइलोफिलस और अन्य परजीवी नेमाटोड के जीन के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए अनुसंधान को आगे बढ़ाने में मदद कर सकता है।

Introduction

पादप-परजीवी सूत्रकृमि (पीपीएन) खाद्य सुरक्षा और वन पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए एक निरंतर खतरा है। वे हर साल आर्थिक नुकसान में अनुमानित 100 बिलियन अमरीकी डालर का कारण बनते हैं, जिनमें से सबसे अधिक समस्याग्रस्त मुख्य रूप से रूट-गाँठ नेमाटोड, पुटी नेमाटोड और पाइनवुड नेमाटोड हैं। पाइनवुड नेमाटोड, बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस, एक प्रवासी, एंडोपैरासिटिक नेमाटोड है, जो पाइन विल्ट रोग2 का कारण रोगज़नक़ है। इसने दुनिया भर में देवदार के जंगलों को बहुत नुकसान पहुंचायाहै 3. वान मेगन एट अल 4 की शब्दावली का उपयोग करते हुए, बी ज़ाइलोफिलस पैरासिटाफेलेनचिडा का सदस्य है और क्लेड 10 से संबंधित है, जबकि अधिकांश अन्य प्रमुख पौधे परजीवी क्लेड 12 से संबंधित हैं।

एक स्वतंत्र और हाल ही में विकसित पौधे परजीवी के रूप में, बी ज़ाइलोफिलस तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल है। आज तक, क्लैड 12 से संबंधित रूट-गाँठ नेमाटोड और पुटी नेमाटोड पर पर्याप्त शोध किया गया है, जो बाध्यकारी, गतिहीन एंडोपारासाइट्स हैं और कुछ सबसे गहन अध्ययन किए गए नेमाटोड हैं। हालांकि, इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में आगे के शोध का संचालन एक बड़ी चुनौती के साथ आता है: परजीवीजीन का कार्य एक शोध अड़चन है। कार्यात्मक अध्ययनों में आम तौर पर एक्टोपिक अभिव्यक्ति और नॉकडाउन / आउट प्रयोग शामिल होते हैं लेकिन नेमाटोड के लिए प्रभावी आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं। नतीजतन, पीपीएन में रिवर्स जेनेटिक्स लगभग विशेष रूप से आरएनएआई द्वारा जीन साइलेंसिंग पर निर्भर करता है।

आरएनएआई, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से मौजूद एक तंत्र, डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) 5 को पेश करके जीन अभिव्यक्ति को चुप करता है। आज तक, डीएसआरएनए द्वारा प्रेरित पोस्टट्रांसक्रिप्शनल जीन-साइलेंसिंग तंत्र सभी अध्ययन किए गए यूकेरियोट्स में पाया गया है, और आरएनएआई प्रौद्योगिकी, कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान और अन्य अनुप्रयोगों के एक उपकरण के रूप में, कई जीवों में तेजी से विकसित हुई है। 19986 में कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में आरएनएआई मशीनरी की खोज के बाद से, आरएनएआई तकनीक नेमाटोड के जीन फ़ंक्शन की पहचान करने के लिए प्रभावी तरीके बन गए हैं और रोगजनक नेमाटोड7 को प्रभावी ढंग से नियंत्रित करने के एक नए तरीके के रूप में प्रस्तावित हैं।

आरएनएआई तकनीकी रूप से डीएसआरएनए में किशोरों को भिगोना पर्याप्त हो सकता है; हालाँकि, इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता और प्रजनन क्षमता नेमाटोड प्रजातियों और लक्ष्य जीन 8 के साथ व्यापक रूप से भिन्न होतीहै। रूट-गाँठ सूत्रकृमि के आरएनएआई मार्गों में शामिल 20 जीनों की चुप्पी, मेलोइडोगिन गुप्त, ट्रिगर्स के रूप में लंबे डीएसआरएनए का उपयोग करके जांच की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिक्रियाएं हुईं, जिनमें वृद्धि और कुछ जीनों की अभिव्यक्ति में कोई बदलाव नहीं हुआ9. इन परिणामों से पता चलता है कि लक्ष्य जीन आरएनएआई नॉकडाउन का अलग-अलग जवाब दे सकते हैं, जिससे आरएनएआई के माध्यम से नेमाटोड नियंत्रण के लक्ष्य के रूप में उनकी उपयुक्तता के संपूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। हालांकि, वर्तमान में विकासात्मक और प्रजनन जीव विज्ञान पर अनुसंधान की कमी है बी।

पिछले काम10,11,12,13 की निरंतरता के रूप में, हम यहां बीएसआरएनए, सिंथेटिक न्यूरोस्टिमुलेंट भिगोने और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) का पता लगाने के संश्लेषण सहित बी ज़ाइलोफिलस के पीपीएम -1 जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए आरएनएआई को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से प्राप्त ज्ञान संभवतः बुनियादी जैविक प्रणालियों को समझने और पाइन विल्ट रोग को रोकने में स्पष्ट रूप से योगदान देगा।

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Protocol

अध्ययन को झेजियांग कृषि और वानिकी विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग परिषद द्वारा अनुमोदित किया गया था। जाइलोफिलस आइसोलेट एनएक्सवाई 61 मूल रूप से झेजियांग प्रांत, चीन11 के निंगबो क्षेत्र में एक रोगग्रस्त पीनस मासोनियाना से निकाला गया था।

1. जीन क्लोनिंग

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. सूत्रकृमि इकट्ठा करें।
    1. 3-5 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए) प्लेटों पर बोट्रिटिस सिनेरिया के मायसेलिया पर बी जाइलोफिलस तनाव की संस्कृति।
    2. बेलमैन फ़नल विधि14 का उपयोग करके नेमाटोड एकत्र करें।
      1. एक फ़नल के नीचे एक क्लैंप रबर ट्यूब रखें और फ़नल के मुंह में फ़िल्टर पेपर की दो परतें रखें। कवक संस्कृतियों को फ़नल में स्थानांतरित करें और फंगल चटाई को विसर्जित करने के लिए पानी जोड़ें। 2 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें, फिर नेमाटोड इकट्ठा करें।
  2. कुल आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग करके नेमाटोड से कुल आरएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)11 निम्नलिखित चरणों के अनुसार।
    1. निष्कर्षण अभिकर्मक के 500 μL और चुंबकीय मोती के 100 μL एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए जोड़ें। नेमाटोड के 20 μL की आकांक्षा करें और नमूने को 30 एस के लिए 9,000 × ग्राम पर पीसने के लिए एक चक्की में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 12,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म के 100 μL जोड़ें, ट्यूब को कैप करें, और ट्यूब को कई बार उलटकर मिलाएं। 3 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। आइसोप्रोपिल अल्कोहल और भंवर के 250 μL सख्ती से जोड़ें। 10 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। आरएनए को धोने के लिए 75% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें और फिर नमूना भंवर करें। 12,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. 5 मिनट के लिए आरएनए गोली को हवा से सुखाएं।
    6. आरनेस मुक्त पानी के 30 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    7. सूत्र का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता की गणना करें: ए 260 × कमजोर पड़ने × 40 = μg आरएनए / A260/A280 अनुपात की गणना करें।
      नोट: ~ 2 का अनुपात शुद्ध माना जाता है।
  3. सीडीएनए टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें।
    1. आर (सामग्री की तालिका देखें) की एक जोड़ी का उपयोग करें, बी एक्स-पीपीएम -1 जीन के आंशिक कोडिंग अनुक्रम को बढ़ाने के लिए बी।
    2. पीपीएम -1 जीन अनुक्रमों को पीजीईएम-टीसी वेक्टर में क्लोन करें जिसमें मानक क्लोनिंग प्रोटोकॉल11 के बाद टी 7 प्रमोटर होता है।
      1. पीसीआर प्रतिक्रियाओं को निम्नानुसार सेट करें: सीडीएनए के 2 μL, 2x एक्स टैक पोलीमरेज़ प्रीमिक्स के 25 μL, प्रत्येक प्राइमर के 2 μL (10 पीएमओएल /
      2. निम्नानुसार प्रवर्धन प्रक्रिया करें: 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 35 चक्रों के बाद, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम।
      3. अनुक्रमण के लिए पीजीईएम-टी आसान वेक्टर में प्रवर्धित उत्पादों को क्लोन करें।

2. डीएसआरएनए का संश्लेषण

  1. दोनों सिरों पर टी 7 प्रमोटर साइटों को जोड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों के साथ पीसीआर का उपयोग करके डीएसआरएनए संश्लेषण के लिए डीएनए टेम्पलेट तैयार करें। प्राइमरों के 5 'अंत में टी 7 प्रमोटर अनुक्रम जोड़ें।
  2. पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में पीपीएम -1 जीन टुकड़ा (894 बीपी) युक्त प्लास्मिड का उपयोग करें और टी 7 प्रमोटर11 युक्त टुकड़े को पुनर्प्राप्त करें। ऊपर वर्णित पीसीआर प्रक्रिया और सिस्टम का उपयोग करें।
  3. डीएसआरएनए11 को संश्लेषित करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करें।
    1. बर्फ पर जमे हुए अभिकर्मकों को पिघलाएं।
    2. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 μL, एंजाइम मिश्रण के 2 μL, और डीएनए के 1 μg जोड़ें। एक मानक 4 μL प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी जोड़ें। फिर, चार राइबोन्यूक्लियोटाइड समाधान (एटीपी, सीटीपी, जीटीपी और यूटीपी) के बराबर मात्रा को एक साथ मिलाएं और ट्यूब में मिश्रण के 8 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. DNase के 1 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. प्रतिक्रिया को रोकें और आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी के 30 μL और एलआईसीएल वर्षा समाधान के 30 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स करें। रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. 12,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. आरएनए को धोने के लिए 75% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें। भंवर नमूना और 12,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    7. 3 मिनट के लिए आरएनए गोली को हवा से सुखाएं।
    8. आरनेस मुक्त पानी के 30 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    9. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएसआरएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण करें। माप पेडस्टल पर डीएसआरएनए नमूने के पिपेट 1 μL और 340 एनएम करने के लिए तरंग दैर्ध्य सेट। 1.0% एगरोज़ जेल पर उत्पादों की कल्पना करें।

3. भिगोने से आरएनएआई

  1. डीएसआरएनए औरडीडीएच2ओ के साथ 5 एक्स भिगोने वाले बफर (0.05% जिलेटिन, 5.5 एमएम केएच 2 पीओ 4, 2.1 एमएम एनएसीएल,4.7एमएम एनएच 4 सीएल, 3 एमएम स्पर्मिडीन) के 4 μL को 20 μL की कुल मात्रा और 0.8 μg /
  2. जे 2 लार्वा प्राप्त करें।
    1. कवक संस्कृतियों से नेमाटोड ले लीजिए और उन्हें व्यास में 6 सेमी एक गिलास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए पकवान में 10 मिलीलीटर पानी जोड़ें कि नेमाटोड स्वतंत्र रूप से तैर सकते हैं। नेमाटोड को 30 मिनट के लिए पकवान में रखें और अंडे के नीचे का पालन करने की प्रतीक्षा करें।
    2. पानी और नेमाटोड को ध्यान से निकालें, सुनिश्चित करें कि अंडे को परेशान न करें। सभी लार्वा और वयस्कों को हटाए जाने तक चरणों को दोहराएं, पकवान में केवल अंडे छोड़ दें।
    3. जे 2 लार्वा प्राप्त करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 24 घंटे के लिए एकत्र किए गए अंडे हैच करें। जे 2 लार्वा ले लीजिए, उन्हें एक ट्यूब में रखें, और आरएनएआई प्रयोग15 के लिए डीडीएच2ओ के साथ उन्हें तीन बार धो लें।
    4. जेएसआरएनए समाधान युक्त 2 एमएल ट्यूब में जे 2 लार्वा को स्थानांतरित करें और 1.0% की अंतिम एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए रेसोरसिनॉल समाधान (टिनफॉइल में लिपटे और पानी में भंग) जोड़ें। लार्वा प्रभावी ढंग से डीएसआरएनए को अवशोषित करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक मिलाते हुए मेज पर 15 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ लार्वा सेते हैं।
    5. डीएसआरएनए जांच के बिना या नियंत्रण के रूप में जीएफपी डीएसआरएनए जांच के साथ भिगोने वाले बफर में नेमाटोड की समान मात्रा को भिगोएं। जीएफपी जीन (जीएफपी, एम 62653.1) का उपयोग एक गैर-अंतर्जात नियंत्रण के रूप में करें और जीन-विशिष्ट प्राइमरों टी 7-जीएफपी-एफ / आर का उपयोग करके जीएफपी के डीएसआरएनए को संश्लेषित करें।

4. क्यूपीसीआर का पता लगाना

  1. लक्ष्य जीन हस्तक्षेप, जीएफपी जीन हस्तक्षेप और निर्बाध नियंत्रण समूह सहित डीडीएच 2 ओ के साथ जे2लार्वा को साफ करें। ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करके प्रत्येक समूह से कुल आरएनए निकालें।
  2. क्यूपीसीआर शुरू करें।
    1. वांछित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके क्यू-पीपीएम -1-एफ / आर प्राइमर डिज़ाइन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. सीडीएनए के 1 μL, फ्लोरोसेंट प्रीमिक्स के 6 μL, प्रत्येक प्राइमर के 0.4 μL (10 पीएमओएल / एल), और बाँझ आसुत पानी युक्त 12 μL में क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करें।
    3. निम्नानुसार क्यूपीसीआर करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट; इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस के 40 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट।
    4. आरएनएआई 15 के बाद जीन अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में एक्टबी जीन (जेनबैंक परिग्रहण संख्या ईयू 100952) और टीबीबी -2 जीन (जेनबैंक परिग्रहण संख्या एमटी 769316), या अन्य जीन का उपयोग करें।
  3. चक्र थ्रेशोल्ड (सीटी) मान और विघटन वक्र के अनुसार, लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान लगाने और हस्तक्षेप दक्षता को सत्यापित करने के लिए 2-ΔΔCt विधि का उपयोग करें।
    1. ΔCt मान प्राप्त करने के लिए लक्ष्य जीन के सीटी मान से प्रत्येक नमूने के आंतरिक संदर्भ जीन के सीटी मान को घटाएं। उसके बाद, ΔΔCt मान प्राप्त करने के लिए नियंत्रण समूह के ΔCt मान से हस्तक्षेप समूह के ΔCt मान घटाएँ।
      नोट: 0 से अधिक एक ΔΔCt मान इंगित करता है कि हस्तक्षेप प्रभावी है।

5. आरएनएआई के बाद नेमाटोड वयस्कों के शरीर की लंबाई का मूल्यांकन करें

  1. आरएनएआई के बाद, 25 डिग्री सेल्सियस15 पर 60 घंटे के लिए पीडीए प्लेटों में बी सिनेरिया लॉन पर वयस्कता तक जे 2 लार्वा की संस्कृति।
  2. बेलमैन फ़नल विधि का उपयोग करके वयस्कों को इकट्ठा करें (चरण 1.1.2.1 देखें)14.
  3. माइक्रोस्कोप के तहत वयस्क नेमाटोड की छवियों को प्राप्त करें और शरीर की लंबाई को मापने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर (या अन्य माप सॉफ्टवेयर) का उपयोग करें।
    1. विश्लेषण | का चयन करके इमेजजे का उपयोग करके लंबाई को मापें स्केल सेट करें। यदि दूरी ज्ञात है, तो खींची गई सीधी रेखा का लंबाई मान दर्ज करें। लंबाई की इकाई दर्ज करें।
    2. वैश्विक चेक बॉक्स (सभी चित्रों के लिए इस मानक का उपयोग करें) चेक करें, और मापी जाने वाली छवि पर सीधी रेखा के साथ मापी जाने वाली लंबाई का चयन करने के लिए ठीक क्लिक करें।
    3. परिणाम प्रदर्शित करने और परिणाम विंडो में उन्हें रिकॉर्ड करने के लिए कमांड Ctrl + M (माप) का उपयोग करें।
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 50 पुरुष और 50 महिला नेमाटोड का माप लें12.
  5. प्रत्येक नमूने के लिए माध्य और मानक विचलन की गणना करके डेटा का विश्लेषण करें। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके विभिन्न समूहों के नमूनों के साधनों की तुलना करें।

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Representative Results

आरएनएआई के बाद बी ज़ाइलोफिलस की पीपीएम -1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण
जीएफपी डीएसआरएनए के साथ भिगोए गए बी ज़ाइलोफिलस के पीपीएम -1 जीन का सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर और लक्ष्य जीन डीएसआरएनए के साथ भिगोया गया क्रमशः 0.92 और 0.52 था (डीडीएच2ओ-उपचारित नियंत्रण समूह का पीपीएम -1 जीन अभिव्यक्ति स्तर 1 पर सेट किया गया था) (चित्रा 1)। इस प्रकार, बहिर्जात डीएसआरएनए का पीपीएम -1 अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है बी। हालांकि, पीपीएम -1 डीएसआरएनए लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से रोक सकता है।

बी जाइलोफिलस की वृद्धि और विकास पर पीपीएम -1 अभिव्यक्ति का प्रभाव
आरएनएआई के बाद, वयस्कों का आकार स्पष्ट रूप से कम हो गया (चित्रा 2), जिसके परिणामस्वरूप एसएमए (छोटे शरीर का आकार) उत्परिवर्ती फेनोटाइप होता है। यद्यपि आरएनएआई-उपचारित व्यक्ति यौन परिपक्वता के लिए विकसित हुए, उनके शरीर की लंबाई सामान्य वयस्कों की तुलना में काफी कम थी। विशेष रूप से, जे 2-चरण नेमाटोड में आरएनएआई के बाद, महिलाओं और पुरुषों की औसत शरीर की लंबाई क्रमशः 544.61 μm और 526.24 μm थी। इसके विपरीत, नियंत्रण समूह में महिलाओं और पुरुषों की औसत शरीर की लंबाई क्रमशः 971.86 μm और 912.31 μm थी (चित्रा 3), महत्वपूर्ण अंतर (P = 0.0322) का प्रतिनिधित्व करती है।

Figure 1
चित्रा 1: बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस के आरएनएआई के बाद पीपीएम -1 जीन की अभिव्यक्ति। ** पी < 0.001। संक्षिप्त नाम: आरएनएआई = आरएनए हस्तक्षेप; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस में पीपीएम -1 के हस्तक्षेप के बाद वयस्कों की शरीर की लंबाई में कमी। आरएनएआई समूह के एक वयस्क पुरुष (ए) और महिला (सी) की छवियां। नियंत्रण समूह के एक वयस्क पुरुष (बी) और महिला (डी) की छवियां। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षिप्त नाम: आरएनएआई = आरएनए हस्तक्षेप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीपीएम -1 जीन के आरएनएआई के बाद बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस के वयस्कों के शरीर की लंबाई का परिमाणीकरण और सांख्यिकीय विश्लेषण। (* पी = 0.0322)। संक्षिप्त नाम: आरएनएआई = आरएनए हस्तक्षेप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यद्यपि बी ज़ाइलोफिलस का जीवन इतिहास और परजीवी वातावरण अन्य नेमाटोड से अलग है, इस पौधे रोगज़नक़ के आणविक रोगजनन पर सीमित शोध हुआ है। सी एलिगेंस और अन्य नेमाटोड में सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग में बड़ी प्रगति के बावजूद, बी जाइलोफिलस पर लागू केवल आरएनएआईतकनीक को आज तक प्रकाशित किया गया है। आरएनएआई नेमाटोड के जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक है और बी ज़ाइलोफिलस जीन फ़ंक्शन, सिग्नल ट्रांसडक्शन पाथवे और जीन थेरेपी 18,19,20 को स्पष्ट करने वाले अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। अकशेरुकी मॉडल में उपयोग किए जाने वाले जीन नॉकआउट दृष्टिकोणों के विपरीत, नेमाटोड में लक्ष्य जीन का आरएनएआई-मध्यस्थता नॉकडाउन जीन फ़ंक्शन के तेजी से मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।

एलिगेंस में आरएनएआई का संचालन करने के तीन तरीके हैं: इंजेक्शन6, भिगोना 21, और खिलाना6। क्योंकि जे 2 लार्वा केवल संक्रमण के बाद फ़ीड करते हैं, भिगोने की विधि का उपयोग आमतौर पर पौधे-परजीवी नेमाटोड के आरएनएआई के लिए किया जाता है। भिगोने की विधि में महत्वपूर्ण कदम फ़ीड करने के लिए नेमाटोड को उत्तेजित करने के लिए एक तंत्रिका एजेंट जोड़ना है। उरविन ने पहली बार दो मौखिक पुटी सूत्रकृमि प्रजातियों, ग्लोबोडेरा पैलिडा और हेटरोडेरा ग्लाइसिन के जे 2 को उत्तेजित करने के लिए ऑक्टोपामाइन का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप भिगोने वाले समाधान22 से डीएसआरएनए का उत्थान हुआ। डीएसआरएनए 23 को अवशोषित करने के लिए रूट-गाँठ नेमाटोड मेलोइडोगिन गुप्त के जे 2 को प्रेरित करने के लिए एक ही विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इनकॉग्निटा के जे 2 द्वारा डीएसआरएनए के उत्थान को भी प्रेरित कर सकता है और इस सूत्रकृमि24 के लिए ऑक्टोपामाइन की तुलना में अधिक प्रभावी हो सकता है। इसके अलावा, लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय के साथ भिगोने वाले बफर में स्पर्मिडीन के अलावा नेमाटोड25 में आरएनएआई की दक्षता में सुधार हुआ। भिगोने के 24 घंटे के बाद, डीएसआरएनए प्रभावी रूप से बी ज़ाइलोफिलस में प्रवेश करता है, जिससे पीपीएम -1 जीन चुप हो जाता है।

इसलिए, यह प्रोटोकॉल फागोसाइटोसिस व्यवहार के साथ अन्य पौधे-परजीवी नेमाटोड के आरएनएआई के भविष्य के अध्ययन के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है। इसके अलावा, मिलाते हुए तालिका का निलंबन प्रभाव भिगोने की विधि के लाभ को अधिकतम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह विधि बड़ी संख्या में नेमाटोड के एक साथ उपचार की अनुमति दे सकती है। आरएनएआई को लक्षित जीन पर ध्यान केंद्रित करते समय संचालित करना आसान होता है जिसके लिए म्यूटेंट आसानी से प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं और विकास में विभिन्न बिंदुओं पर प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए क्योंकि नेमाटोड को किसी भी जीवन चरण में भिगोया जा सकता है। इस प्रकार, आरएनएआई का उपयोग एक विशिष्ट विकास चरण में एक विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। वांग एट अल ने बी ज़ाइलोफिलस की फेकुंडिटी पर एमएपीके के प्रभाव का विश्लेषण किया और डीएसआरएनए भिगोने26 का उपयोग करके नेमाटोड के विकास और विकास में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका का विश्लेषण किया। किउ एट अल ने पाया कि देवदार के पेड़ों में बी जाइलोफिलस की माइग्रेशन गति और फेकंडिटी बीएक्सपेल 1 जीन के डाउनरेगुलेशन के बाद कम हो गई, जो इंगित करता है कि यह जीन बी का एक महत्वपूर्ण रोगजनक कारक है।

हालांकि, नेमाटोड में सभी आरएनएआई डीएसआरएनए के माध्यम से काम नहीं करते हैं। ड्यूलोविक और स्ट्रेट ने स्ट्रॉन्गिलॉइड्स रत्ती28 के साथ सफलतापूर्वक हस्तक्षेप करने के लिए लंबे डीएसआरएनए के बजाय छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) को लागू किया। स्ट्रॉन्गिलॉइड्स में आरएनएआई के लिए डीएसआरएनए का उपयोग करने की सीमा आरएसडी -6, सिड -1, या सिड -2 जैसे जीन की अनुपस्थिति से संबंधित हो सकती है जो डीएसआरएनए अपटेक में शामिल होने के लिए जाने जाते हैं। आरएनएआई एक स्थितिगत प्रभाव और अस्थायी और अपूर्ण नॉकआउट के नुकसान से भी जुड़ा हुआ है और कुछ जीन और सेल प्रकारों (जैसे न्यूरॉन्स) 29 के लिए सीमित प्रभावशीलता है। हालांकि, जब तक बी ज़ाइलोफिलस की ट्रांसजेनिक तकनीक में सफलता हासिल नहीं की जाती है, तब तक आरएनएआई अपेक्षाकृत प्रभावी अनुसंधान रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है।

आरएनएआई ने फसल संरक्षण की अपार संभावनाएं दिखाई हैं। आरएनएआई तकनीक का उपयोग करते हुए, रूट-गाँठ नेमाटोड जीन को लक्षित करने वाले डीएसआरएनए का उत्पादन करने में सक्षम ट्रांसजेनिक आलू को रूट-गाँठ नेमाटोड30 के पूर्ण प्रतिरोध का उत्पादन करने के लिए नस्ल किया गया है। डीएसआरएनए की अभिव्यक्ति जो कीट जीन को लक्षित करती है, रासायनिक कीटनाशकों की अनुपस्थिति में फसल सुरक्षा प्रदान कर सकती है और लक्ष्य जीन31 की लगभग असीमित संख्या के साथ विदेशी प्रोटीन का उत्पादन नहीं करने का अतिरिक्त लाभ प्रदान करती है। इसलिए, कीट नियंत्रण के लिए लागू आरएनएआई के क्षेत्र में त्वरित अनुसंधान ट्रांसजेनिक विधियों या अन्य रासायनिक नियंत्रण विधियों की तुलना में पौधे सूत्रकृमि नियंत्रण के लिए बेहतर जैव सुरक्षा प्रदान करेगा।

अंत में, यह प्रोटोकॉल डीएसआरएनए समाधान में बी जाइलोफिलस के लार्वा को सीधे भिगोकर आरएनएआई प्राप्त करने के लिए पीपीएम -1 जीन के डीएसआरएनए की तैयारी का वर्णन करता है। नियंत्रण की तुलना में वयस्कों में विकसित होने के बाद लार्वा के शरीर के आकार में महत्वपूर्ण कमी के आधार पर हस्तक्षेप प्रभाव की पुष्टि की गई थी, यह दर्शाता है कि पीपीएम -1 जीन बी। यह अध्ययन इस पौधे परजीवी के जैविक नियंत्रण का मार्गदर्शन करने में अतिरिक्त व्यावहारिक मूल्य के साथ पीपीएम -1 के कार्य को और प्रकट करने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है। यह माना जाता है कि आरएनएआई प्रौद्योगिकी तंत्र के आगे प्रकटीकरण और सुधार के साथ, बी ज़ाइलोफिलस नियंत्रण के क्षेत्र में इसके आवेदन में व्यापक संभावनाएं होंगी।

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Disclosures

हितों के टकराव की घोषणा नहीं की गई।

Acknowledgments

इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31870637, 31200487) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और झेजियांग कुंजी अनुसंधान योजना (2019सी02024, एलजीएन 22 सी 160004) द्वारा संयुक्त रूप से वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baermann funnel n/a n/a to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9 Shanghai kangyusheng information technology co. n/a to design qPCR primers
Botrytis cinerea n/a n/a as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus n/a n/a its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased
Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. H1703544 to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus Bio-Rad Laboratories 1704466 to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75% Sinopharm Chemical Reagent Co. 80176961 to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix Takara Bio Inc. RR030A for PCR
Ex Taq Polymerase Premix Takara Bio Inc. RR390A for PCR
Gel imager LongGene Scientific Instruments Co. LG2020 to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8 GraphPad Prism n/a to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge Hangzhou Allsheng Instruments Co. AS0813000 centrifug
High-flux tissue grinder Bertin to extract RNA
ImageJ software National Institutes of Health n/a to measure the body lengths
isopropyl alcohol Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. L1909022 to extract RNA
Leica DM4B microscope Leica Microsystems Inc. to observe nematodes
magnetic beads Aoran science technology co. 150010C to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit Thermo Fisher Scientific Inc. AM1333 to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc. NanoDrop 2000/2000C to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier Bio-Rad Life Medical Products Co. 1851148 to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes n/a n/a to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector Promega Corporation A1360 for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium) n/a n/a to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser Takara Bio Inc. RR047B to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0 PREMIER Biosoft n/a to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R Tsingke Biotechnology Co. n/a F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R Tsingke Biotechnology Co. n/a F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. for qPCR
shaking table Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. to soak nematodes
stereoscopic microscope Chongqing Optec Instrument Co. 1814120 to observe nematodes
T7-GFP-F/R Tsingke Biotechnology Co. n/a F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA
GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG
TTACAAACTCAAGAAGG-3'
 T7 promoter Tsingke Biotechnology Co. n/a TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Takara Bio Inc. 9762 to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) Takara Bio Inc. RR820A for qPCR
trichloroethane Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. to extract RNA
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific Inc. 15596026 total RNA extraction reagent,to extract RNA

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जीव विज्ञान अंक 181
पाइनवुड नेमाटोड में आरएनए हस्तक्षेप का अनुप्रयोग, <em>बर्साफेलेंकस जाइलोफिलस</em>
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Liu, X., Zhou, X., Zhou, L., Hu, J., Guo, K. Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus. J. Vis. Exp. (181), e63645, doi:10.3791/63645 (2022).

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