Summary
Genom att kombinera viral vektortransduktion och hjärnrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man undersöka ett stort antal nervceller och astrocyter samtidigt.
Abstract
Genom att kombinera viral vektortransduktion och vävnadsrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man samtidigt undersöka flera typer av hjärnceller och deras interaktioner. Viral vektortransduktion möjliggör märkning av olika celltyper i olika fluorescensfärger inom samma vävnad. Celler kan identifieras genetiskt genom aktivitet eller projektion. Med hjälp av ett modifierat CLARITY-protokoll har den potentiella provstorleken för astrocyter och neuroner ökat med 2-3 storleksordningar. Användningen av CLARITY möjliggör avbildning av kompletta astrocyter, som är för stora för att passa i sin helhet i skivor, och undersökning av somata med alla sina processer. Dessutom ger det möjlighet att undersöka den rumsliga interaktionen mellan astrocyter och olika neuronala celltyper, nämligen antalet pyramidala neuroner i varje astrocytisk domän eller närheten mellan astrocyter och specifika hämmande neuronpopulationer. Detta dokument beskriver i detalj hur dessa metoder ska tillämpas.
Introduction
Under de senaste åren har kunskapen om astrocytfunktion och hur de interagerar med neuronala kretsar ökat dramatiskt. Astrocyter kan påverka plasticitet 1,2, hjälpa till med neuronal återhämtning efter skada 3,4 och till och med inducera de novo neuronal potentiering, med nyligen genomförda studier som visar vikten av astrocyter vid minnesförvärv och belöning, som tidigare betraktades som rent neuronala funktioner 5,6,7 . En egenskap av särskilt intresse för astrocytforskning är cellernas rumsliga arrangemang, som upprätthåller unika rumsliga organisationer i hippocampus och andra hjärnstrukturer 8,9,10. Till skillnad från de neuronala dendriterna som sammanflätas mellan cellsomater, bor hippocampala astrocyter visuellt urskiljbara territorier med liten överlappning mellan deras processer, vilket skapar distinkta domäner 8,11,12,13. Bevisen som stöder astrocyternas deltagande i neuronala kretsar stöder inte bristen på detaljerad anatomisk beskrivning av sådana populationer och neuronerna i deras domäner14.
Virala vektortransduktionsförfaranden, tillsammans med transgena djur (TG), har populariserats som en verktygssats för att undersöka hjärnstrukturer, funktioner och cellinteraktioner15,16. Användningen av olika promotorer möjliggör inriktning av specifika celler enligt deras genetiska egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projektionsmål. Olika virus kan uttrycka olika färgade fluoroforer i olika populationer. Ett virus kan kombineras med det endogena uttrycket av fluoroforer i TG, eller TG-djur kan användas utan behov av virus. Dessa tekniker används ofta för neuronal märkning, och vissa laboratorier har börjat använda dem med modifieringar specialiserade för att rikta in sig på andra celltyper, såsom astrocyter 5,9,19.
CLARITY-tekniken, som först beskrevs 2013 20,21, möjliggör studier av tjocka hjärnskivor genom att göra hela hjärnan transparent samtidigt som de mikroskopiska strukturerna lämnas intakta. Genom att kombinera de två metoderna - viral vektortransduktion och vävnadsrensning - är möjligheten att undersöka de rumsliga interaktionerna mellan olika celltyppopulationer nu tillgänglig. De flesta astrocyt-neuroninteraktionsstudier utfördes på tunna hjärnskivor, vilket resulterade i bilder av ofullständiga astrocyter på grund av deras stora domäner, vilket radikalt begränsade antalet analyserade celler. Användningen av CLARITY-tekniken möjliggör encellsupplösningskarakterisering av cellpopulationer i storskaliga volymer samtidigt. Avbildning av fluorescerande märkta cellpopulationer i klara hjärnor ger inte synaptisk upplösning men möjliggör grundlig karakterisering av de rumsliga interaktionerna mellan astrocyter och en mängd olika neuronala celltyper.
Av den anledningen utnyttjade vi dessa toppmoderna tekniker för att undersöka egenskaperna hos astrocyter i hela dorsal CA1, avbildning av all lamina (Stratum Radiatum, pyramidal layer och Stratum Oriens). Vi mätte tiotusentals astrocyter (med viral penetrans på >96%5) och analyserade därmed informationen från hela den astrocytiska befolkningen runt CA1. Med effektiv penetrans av neuronala markörer kunde vi registrera interaktionerna mellan hela populationen av CA1-astrocyter och de fyra typerna av neuronala celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hämmande neuroner och excitatoriska pyramidala celler9.
Flera experiment utfördes med användning av en kombination av fluorescens från TG-djur och olikfärgade virusvektorer (alla hämmande celler), medan andra (excitatoriska) använde två virala vektorer som uttryckte olika fluoroforer under olika promotorer9. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive märkning av önskade celler i hjärnan, vilket gör hjärnan transparent med hjälp av ett modifierat CLARITY-förfarande, samt avbildning och analys av kompletta hjärnstrukturer, med hjälp av olika procedurer och programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella protokoll godkändes av Hebrew University Animal Care and Use Committee och uppfyllde riktlinjerna från National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduktion
OBS: Viral vektortransduktion används för att uttrycka fluoroforer i hjärnan.
- Använd en atlas (t.ex. Allen Brain Atlas) för att hitta relevant samordning av målområdet.
OBS: 3D-atlaser finns online (t.ex. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Använd stereotaktisk kirurgi, injicera virusvektorerna i den relevanta hjärnstrukturen. Se9 för ett detaljerat protokoll.
- Vänta i 3-6 veckor för fluoroforuttryck.
OBS: En kort tidsperiod räcker om endast cellkroppar behöver markeras. En lång tidsperiod kommer att behövas om de axonala projektionerna är relevanta för frågan, eftersom det tar längre tid för fluoroforerna att uttrycka sig i axoner, som kan vara flera millimeter långa. - Validera specificiteten och penetransen hos fluoroforuttryck (både av viralt uttryck och TG-djur) i förväg (figur 1A). Innan du fortsätter med CLARITY-proceduren, utse minst en hjärna för tunna skivor och se till att fluoroforuttrycket är både starkt och specifikt för målcellfunktionen.
2. TYDLIGHET
OBS: Denna metod gör hjärnan transparent inom 2-6 veckor.
- Utför transkraniell perfusion på djur med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Ta bort hjärnan och förvara den i PFA över natten vid 4 °C i ett 50 ml rör eller en liknande behållare.
OBS: Innan transkraniell perfusion utförs måste djuret sövas djupt. I exemplen som presenteras i detta protokoll bedövades alla djur med ketamin och xylazin (90% respektive 10%. - Ersätt PFA med hydrogellösning (HS; se tabell 1) i 48 timmar vid 4 °C.
OBS: Låt inte materialen bli varmare än kyltemperaturen (4-8 ° C) i detta skede, annars polymeriseras hydrogelen. HS som används i detta protokoll innehåller 2% akrylamid, till skillnad från tidigare protokoll som tyder på 4%22 eller 1%17. Fördelen med 2% beskrivs i diskussionsavsnittet. När du förbereder HS, arbeta på en iskall yta. Förvara den vid -20 °C. - Avgasning
OBS: Syftet med detta steg är att avlägsna allt fritt syre från vävnaden eftersomO2 stör polymerisationsprocessen. Allaicke-O2-gaser kan användas (t.ex.N2, CO2). N2 rekommenderas.- Överför N2 från tanken via en 5 mm (intern) flexibel slang, ansluten till en 19 G nål i slutet (figur 1B).
- Gör två små hål (nålbredda) i rörets lock: ett för att införa gasen och det andra för att låta luften lämna röret (Figur 1C).
- Fäst röret frånN2-gasen på röret och byt ut gaserna i cirka 30 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort röret och försegla omedelbart hålen med modelleringslera på varje rör (Figur 1D).
- Överför de avgasade förseglade rören till ett 37 ° C bad i 3,5 timmar för att polymerisera HS, som blir en gel. Var försiktig så att du inte skakar rören (figur 1E).
- Extrahera hjärnan från röret och ta försiktigt bort den polymeriserade gelén från runt den med laboratorieservetter. Se till att ingen kvarvarande gel förblir fäst vid vävnadens yta, eftersom den kan reagera med lösningen i följande steg, vilket hämmar vävnadsrensningsprocessen (Figur 1F).
OBS: Eftersom gelén innehöll PFA bör extraktionen göras under en dragskåpa. - Skär hjärnan om den aktuella frågan bara kräver en del av den. Dela den i hälften eller i mycket tjocka skivor som innehåller alla intressanta områden (Figur 1G).
- Placera skivorna i den första röjningslösningen (CS1, se tabell 2) i en ny behållare och skaka vid 70 varv/min i 24 timmar vid 37 °C.
- Följ stegen som beskrivs nedan för att överföra hjärnan från CS1 till den andra clearinglösningen (CS2, se tabell 2).
- Förbered ett perforerat rör för hjärnan i förväg (Figur 1H).
- Förvärm CS2 till 40-45 °C i en bägare som är tillräckligt stor för att innehålla röret. Gör detta på en kokplatta med en omrörare. Se till att temperaturen inte når 55 °C för att förhindra blekning av de uttryckta proteinerna.
- Placera bägaren fylld med CS2 och det perforerade röret på en omrörningsanordning (en 2 L bägare i figur 1I). Ställ in en måttlig omrörningshastighet som får vätskan att flöda utan att snedvrida vävnaden.
OBS: Inom 2-6 veckor blir vävnaden transparent (processen börjar i periferin och rör sig inåt mot de centrala hjärnstrukturerna). Beslutet om när vävnaden är "tillräckligt tydlig" är upp till personlig bedömning. Hjärnan ska vara tillräckligt transparent för avbildning under mikroskopet utan störningar (Figur 1J inte tillräckligt tydlig; Figur 1K tillräckligt tydlig). Att överträffa den punkt där vävnaden är tillräckligt klar kan orsaka förlust av vävnadsstyvhet.
- Överför från CS2 till PBST (0,5 % Triton X-100 i PBS, se tabell 2) i en ny behållare vid 37 °C med mild skakning (70 rpm) i 24 timmar.
OBS: I PBST blir vävnaden vitaktig (Figur 1L). Tydligheten kommer att återkomma (och förbättras) när den bäddas in i brytningsindexmatchningslösningen (RIMS, se steg 2.14). - Ersätt PBST med ny PBST. Förvara under samma förhållanden (37 °C med mild skakning) i ytterligare 24 timmar.
- Byt ut PBST igen med ny PBST och håll den vid RT i 24 timmar.
- Överför till PBS vid RT i 24 timmar.
- Byt ut PBS och låt stå vid RT i ytterligare 24 timmar.
- Ta bort hjärnan från PBS och överför den till RIMS vid 37 °C över natten.
OBS: Initialt kan krusningar i RIMS omge hjärnan. Detta protokoll utformades och validerades med hjälp av två specifika kommersiella RIMS (se tabell 3). Protokollet bör dock inte skilja sig åt när du använder andra RIMS (kommersiella eller självtillverkade). - Håll vävnaden vid RT i ytterligare 24 timmar eller tills lösningen når full jämvikt, dvs när vävnaden blir transparent och lösningen inte längre innehåller några synliga krusningar (Figur 1M).
- Om vävnaden är transparent, fortsätt till kammarberedningen. Om vävnaden vid denna tidpunkt blir vit istället för transparent (på grund av aggregat av kvarvarande SDS-molekyler), rengör provet igen genom att upprepa steg 2.9 och 2.10 och överför vävnaden till CS2 (steg 2.8) i några dagar, följt av alla steg fram till steg 2.15.
3. Förberedelse av kammaren
OBS: Varje prov kräver en bild med en bildkammare där provet kommer att placeras.
- Placera provet i mitten av bilden.
- Använd en varm limpistol och skapa väggar vid kanterna på bilden, nästan lika höga som vävnaden. Se till att lämna ett litet mellanrum (cirka 5 mm) i ett av hörnen (figur 2A,B).
- Applicera 1-2 droppar av RIMS på provet för att hålla den övre ytan fuktig och förhindra att bubblor bildas mellan täckglaset och vävnaden.
- Omedelbart efter applicering av RIMS-dropparna, tillsätt det sista lagret av hett lim på väggarna (så att de når hjärnans / skivans höjd) och fortsätt omedelbart (medan det heta limet fortfarande är flytande) till steg 3.5.
- Försegla toppen med en täckglas och placera den så jämnt som möjligt på toppen av det fortfarande varma heta limskiktet (figur 2C).
- Fyll kammaren med RIMS genom gapet kvar i de heta limväggarna (figur 2D,E).
- Stäng klyftan med hett lim. Lämna ingen luft inuti (figur 2F).
- Om de heta limväggarna sträcker sig utanför bildens gränser, skär de utsträckta kanterna (figur 2G).
- Om målet som används för avbildning är nedsänkt, tillsätt ytterligare 2-3 mm lim på väggarna ovanför täckglaset så att nedsänkningslösningen kommer att pågå under en längre period (Figur 2H).
4. Avbildning (konfokal eller tvåfoton)
- Kontrollera om scenen kan hålla kammaren, eftersom kammarens tjocklek kan nå flera millimeter.
OBS: Till exempel är det konfokala mikroskopet (se materialförteckningen) som används i detta protokoll utrustat med flera steg (t.ex. cirkulärt, rektangulärt). Vilket steg som väljs för att hålla kammaren är irrelevant så länge dess parametrar passar kammarstorlekarna. - Arbeta med ett mål med ett tillräckligt arbetsavstånd, dvs ett minimalt arbetsavstånd ≥3 mm, eftersom hjärnområdet av intresse kan vara några millimeter djupt och täckglaset kanske inte är helt rakt eftersom det placerades manuellt.
OBS: Som en demonstration erhölls resultaten som presenterades i figur 1, video 1 och video 2 under ett tvåfotonmikroskop med användning av ett vattennedsänkning 16x mål med ett 3 mm arbetsavstånd och förstoring av 2,4 för att erhålla ett synfält på 652 x 483 μm och en z-stack med 0,937 μm intervall mellan planen. - Utför avbildning med flera områden, vilket kan ta några timmar eller till och med dagar. Se till att det finns gott om ledigt lagringsutrymme i datorn eftersom storleken på varje bild kan nå upp till tiotals gigabit.
OBS: CLARITY-avbildning kan resultera i betydligt fler bildavsnitt på djupet. Därför bör intensiteterna som används för att fånga uttrycket vara relativt låga för att förhindra överuttryck under bildsummeringen. - För nedsänkningsmål, kontrollera vätskan rutinmässigt under avbildning och komplettera med ytterligare vätska om det behövs.
OBS: Under avbildningen av de data som presenteras i video 3 tillsattes vatten till kammarens yta var 6-8: e timme för att bekämpa avdunstning. - När avbildningen har förvärvats kan du visa och analysera den med flera olika programvarupaket.
OBS: Rekommenderad programvara inkluderar Imaris och SyGlass för både visualisering och analys. Den exakta rörledningen för optimerad rekonstruktion av astrocyter med hjälp av Imaris programvara har beskrivits tidigare9. Kort sagt, Imaris-funktionerna som användes i denna studie var Filaments för att helt rekonstruera cellstrukturer och Spots för att extrahera positionen i utrymmet för alla somata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik rensning av tjocka hjärnvävnadsskivor resulterar i ett nytt antal frågor som kan ställas angående egenskaperna hos stora cellpopulationer i motsats till egenskaperna hos enskilda celler eller angränsande grupper av celler. För att uppnå framgångsrika resultat bör man strikt följa CLARITY-protokollet, eftersom det finns ett brett spektrum av parametrar som måste beaktas för att minska variansen mellan prover (t.ex. procentandel av klarhet, fluorescensinformation, svullnadsparametrar).
Figur 1 beskriver hela rensningsprocessen från fluorescerande proteinuttrycksvalidering genom alla steg i clearingmetoden. Figur 2 beskriver hur man förbereder en kammare för den klarade vävnaden, optimal för avbildning under ett tvåfoton- eller konfokalmikroskop. Materialen som krävs i detta protokoll är extremt billiga i förhållande till andra protokoll för kammarberedning.
Figur 3 presenterar kuben som beskrivs i video 1, där över 300 astrocyter visas i en rensad del av CA1-delen av en musflod hippocampus. Figur 4 presenterar kuben som beskrivs i video 2, där både astrocyter och excitatoriska neuronala somata visas i tjock transparent vävnad. Figur 5 presenterar en hel halvklot, som beskrivs i video 3. Hjärnomfattande neuronala projektioner visas från dorsal CA1 (grön, GFP) och ventral CA1 (röd, TdTomato).
Video 1 presenterar en tjock bild av hippocampala astrocyter (>300) som förvärvats med ett tvåfotonmikroskop efter ett CLARITY-förfarande. Fluorescens tillhandahölls genom viral vektortransduktion specifik för astrocyter. Video 2 presenterar den rumsliga närheten mellan astrocyter och kärnorna i hippocampala pyramidala celler. Video 3 spårar axonala buntar över en hel halvklot; axoner projicerar från den primära motoriska cortexen och spåras tillbaka från ryggmärgen. En annan bunt spåras från dorsal hippocampus mot Supra Mammillary-kropparna. Slutligen spårar den en röd bunt axoner från Mammillary-kropparna mot deras ursprung vid ventral hippocampus. Alla markerade celler är uteslutande excitatoriska.
Figur 1: Detaljerad beskrivning av clearingprocessen. (A) Validering av fluoroforuttryck. I detta exempel uttrycker alla astrocyter i CA1-delen av en musflod hippocampus ett rött protein (TdTomato, avbildat i magenta), och alla excitatoriska neuroner uttrycker ett grönt protein i sina kärnor (H2B-GFP). Denna bild förvärvades med hjälp av ett 2-fotonmikroskop. Bilden togs med hjälp av ett vattennedsänkningsmål på 16x (0,8 NA) med förstoring på 2,4 för att få ett synfält på 652 x 483 μm, vid 15,5 bildrutor/s och en z-stack med 0,937 μm mellanrum mellan planen. Specificiteten och penetransen verifierades av immunohistokemi9. (B) Överföring avN2-gasen från tanken till röret som håller hjärnan kräver ett rör med en nål i slutet. (C) Luft inuti röret ersätts medN2 genom att skapa två hål, ett (övre pilen) för inflödet avN2via nålen ansluten till rörledningen från bensintanken och en annan (bottenpil) för utflöde. (D) Att täcka hålen med modelleringslera omedelbart efter avgasning förhindrar attN2 lämnar röret. (E) Uppvärmning av den avgasade lösningen i 3,5 timmar i ett varmt bad. (F) Framgångsrik polymerisation resulterar i en hjärna inbäddad i gelad HS. Gasbubblor kan fastna i polymeren. (G) Omedelbart efter extraktion från gelén är den bästa punkten för hjärnan att skäras i önskad tjocklek. (H) Perforerade rör gör att flödet av lösningen på omröraren kan nå provet. (I) Hjärnor inuti perforerade rör hålls vertikalt av en självtillverkade hållare av en storlek som är gjord för att passa en 2 L bägare, stående på en kokplatta omrörare. (J) Exempel på en hjärna som inte är tillräckligt tydlig. Provet ska omröras i CS2 i ungefär en vecka till. (K) Exempel på en tillräckligt klar hjärna. (L) När den klara hjärnan sätts in i PBST blir vävnaden vitare än tidigare. Denna färgförändring beror på Triton och kommer att försvinna när den flyttas från denna lösning till nästa. (M) Efter >24 timmar i RIMS blir hjärnan helt transparent igen. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; NA = numerisk bländare; HS = hydrogellösning; CS2 = Clearinglösning 2; PBST = fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,5% Triton X-100; RIMS = Matchningslösning för brytningsindex. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förberedelse av kammaren. (A) Det första lagret av heta limväggar täcker kanterna på en bild och lämnar ett utrymme som är tillräckligt brett för att innehålla hjärnan utan att röra vid väggarna. Ett hål finns kvar i det övre vänstra hörnet av bilden. (B) Lägga till lager efter lager för att nå vävnadens höjd. (C) Rak täckglas (vit pil) förseglar kammaren. (D) Kammare fylld med RIMS genom hålet i kammarväggarna. (E) Kammaren är fylld med RIMS som inte lämnar några luftbubblor. (F) Tätning av hålet i kammaren med hett lim för att förhindra läckage. Sidovy. (G) I detta skede ska eventuella heta limrester som sträcker sig över bildens kanter skäras av kammaren. (H) Fullt förberedd kammare, redo för avbildning under mikroskopet. Förkortning: RIMS = Brytningsindex Matchande lösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Alla avbildade astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röd) i en rensad hippocampus. En enda bildruta från Video 1 som fångar alla avbildade astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röd) i en rensad hippocampus. Alla detaljer om bildegenskaperna beskrivs under Video 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röda) och hippocampala pyramidala cellkärnor (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grön) i tjock transparent vävnad. En enda bildruta från Video 2 som visar både astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röd) och hippocampala pyramidala cellkärnor (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grön) i tjock transparent vävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Gröna axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grön) och röda axoner (AAV5-CaMKII::TdTomato). En enda bild från Video 3 som visar båda typerna av axoner härledda från flera platser i en mushjärna som kan spåras över en hel halvklot. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Bilder av >1 mm tjock skiva av hippocampala dorsala CA1-astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röd). Videon förvärvades med ett tvåfotonmikroskop med hjälp av ett 16x-mål (0,8 NA) med förstoring på 2,4 efter en CLARITY-procedur. I likhet med figur 1A var z-stackintervallet inställt på 0,937 μm. Fluorescens tillhandahölls genom viral vektortransduktion specifik för astrocyter. Antalet astrocyter i denna kub är >300, och de flesta processer är tillgängliga för analys i de flesta celler. Förkortningar: NA = numerisk bländare; AAV = adenoassocierat virus; GFAP = glialt fibrillärt surt protein. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Astrocyter och excitatoriska neuronkärnor i en 3D-kub. Kuben innehåller all lamina av dCA1 under de optiska förhållanden som nämns för figur 1A och video 1. Denna kub uppvisar den rumsliga närheten mellan astrocyter (AAV1-GFAP::TdTomato, röd) och kärnorna i hippocampala pyramidala celler (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grön). Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; GFAP = glialt fibrillärt surt protein; CAMKII = kalcium/kalmodulinberoende proteinkinas II; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; H2B = histon 2B. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Spåra axonala buntar över en hel halvklot. Gröna axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grön) som slutar vid ryggmärgen spåras lätt tillbaka till den primära motoriska cortexen (mer än 7 mm från varandra). Från hippocampus (dorsal sida) spåras en annan bunt mot Supra Mammillary-kropparna (de flesta ventrala sidan av hjärnan), ett spår på nästan 3 mm långt. Den andra halvan av videon spårar en röd bunt axoner (AAV5-CaMKII::tdTomato) med ursprung vid den ventrala hippocampus tillbaka från deras målplats vid Mammillary-kropparna. Bilden togs under ett Olympus-skanningslaserkonfokalmikroskop FV1000 med ett 4x-mål (0,16 NA), och flera ROI kombinerades med MATL FluoView-funktionen för att presentera hela halvklotet. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; CAMKII = kalcium/kalmodulinberoende proteinkinas II; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; NA = numerisk bländare; MATL = flera arealens time-lapse. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Hydrogellösning (1 l) | |
| Material | Belopp |
| VA-044 Initiativtagare | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 ml |
| Akrylamid (40%) | 50 ml |
| Bisakrylamid (2%) | 50 ml |
Tabell 1: Beredning av hydrogellösning (1 liter). Hydrogellösning måste framställas på en iskall yta. Ordningen i vilken ingredienserna blandas är inte viktig. Observera att den totala andelen akrylamid är 2% till skillnad från liknande protokoll som använder antingen 1%17 eller 4%22.
| Clearinglösningar (1 l) | ||
| Material | Belopp | |
| CS1 | CS2 | |
| Borsyra (M.W. = 61,83 g/mol) | 12.366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 g | 80 g |
| Trisbas (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12,1 g |
| Destillerat vatten (DW) | Fyll till 1 L | Fyll till 1 L |
| NaOH | pH 8,5 | |
| 1 liter fosfatbuffrad saltlösning med 0,5% Triton X-100 | ||
| Material | Belopp | |
| PBS | 995 ml | |
| Triton X-100 | 5 ml | |
Tabell 2: Beredning av clearinglösningarna 1 och 2 (1 liter) och 1 liter fosfatbuffrad saltlösning med 0,5% Triton X-100. Clearinglösningarna kan förberedas i förväg och hållas vid rumstemperatur under en lång period. Alla lösningar som innehåller borsyra och SDS bör hanteras under en draghuva för att undvika inandning eller hudkontakt med antingen SDS eller borsyra. NaOH i CS1 bör tillsättas sist för att ställa in pH vid 8,5. Varje hjärnprov ska placeras i minst 5-25 ml CS1 och förvaras över natten för tillräcklig diffusion. Förkortningar: CS1 = clearinglösning 1; SDS = natriumdodecylsulfat; M.W. = molekylvikt.
| Produktnamn | Primär fördel | Primär nackdel |
| RapiClear | Provet förblir transparent | Svullnad i vävnad |
| RapiClear CS | Provet krymper tillbaka till normal storlek | Provet kan förlora transparensen |
Tabell 3: RIMS-alternativ med fördelar och nackdelar. Rapiclear (RC, RI = 1,47) eller CLARITY-specifik Rapiclear (CSRC, RI = 1,45). Den primära skillnaden mellan dessa två lösningar är att medan CSRC krymper den klara hjärnan tillbaka till sin ursprungliga storlek, gör RC-lösningen inte det, vilket gör det rensade provet något svullet. Förkortning: RI = brytningsindex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsrensningsmetoder utgör ett revolutionerande verktyg inom hjärnforskningen och inbjuder till frågor som inte tidigare kunde ha ställts. Från att rikta in sig på egenskaperna hos en liten grupp celler, en enda cell eller till och med en enda synaps, möjliggör CLARITY nu inriktning på totala cellpopulationer eller långväga anslutningsfunktioner genom att använda relevanta fluoroforer.
Resultatet av kombinationen av fluoroforuttryck och CLARITY-procedur är inte binärt; många faktorer kan störa förfarandet som leder till suboptimala resultat. Först måste fluoroforuttrycket verifieras i förväg. Eftersom CLARITY-förfarandet orsakar viss informationsförlust är tillräckligt fluoroforproteinuttryck avgörande för bildens giltighet i slutet av CLARITY-processen. För det andra måste den transkraniella perfusionen hanteras noggrant, vilket säkerställer att allt blod lämnar hjärnan, eftersom blodets autofluorescens kommer att leda till opålitliga data i tjocka skivor. För det tredje måste alla parametrar som diskuteras i protokollet hanteras i varje steg i rensningsprocessen med precision, t.ex.O2-rester i HS före polymerisation eller temperaturocision i varje steg kommer att förhindra att den kemiska reaktionen mellan de aktiva materialen uppstår.
Tidigare protokoll17,22 rekommenderar olika koncentrationer av akrylamid i HS. Det primära syftet med akrylamid är att bättre fixera molekylerna med aminrester (proteiner och nukleinsyror). Små förändringar i koncentrationen påverkar i hög grad hela rensningsprocessen: om fixeringen är för kompakt kommer lipidmolekylerna inte att koppla bort från vävnaden, och rensningsprocessen kommer att bli onödigt långvarig eller resultera i ogenomskinliga hjärnor. Lägre koncentrationer av akrylamid kommer emellertid inte att upprätthålla hjärnstrukturen tillräckligt när den saknar lipider. I detta protokoll är akrylamidprocenten inställd för att ge den känsliga balansen mellan fixerad men ändå klar vävnad.
Det mesta av rensningsprocessen sker i CS2, och vävnadens klarhetsnivå bör testas dagligen. PBST-sanering är ett viktigt steg mellan Clearing-lösningarna och brytningsindexmatchningslösningarna eftersom det rengör de återstående SDS-molekylerna, som kan interagera med RIMS. Det är också möjligt att hålla den klara vävnaden i PBST (0,5%) på obestämd tid om kammarberedning ännu inte behövs.
När man placerar hjärnan i RIMS bör man bekanta sig med fördelarna och begränsningarna med lösningarna. Till exempel kommer RapiClear att orsaka fullständig transparens även i nästan rensade vävnader, men kommer också att orsaka viss svullnad, vilket inte bör försummas vid analys av data. Tidigare mätningar9 tyder på lika expansion längs alla axlar (dvs. dorsoventrala, främre-bakre och laterala mediala axlar), vilket gör det möjligt att beräkna svullnadsindexet jämfört med tunna skivor från samma hjärnregion. Användning av CLARITY-specific RapiClear eliminerar svullnaden; Men om några SDS-rester finns kvar i vävnaden kommer de att aggregeras till icke-transparenta massor.
En annan fördel med detta modifierade protokoll är dess kostnad. Tidigare protokoll föreslår olika limtyper för att skapa en kammare som kan hålla hjärnan i RIMS. I detta protokoll använder vi helt enkelt hett lim. Det reagerar inte med lösningarna, finns att köpa överallt, är lätt att använda och är betydligt billigare än de lim som föreslagits tidigare.
Data som erhållits från avbildning av tjocka hjärnprover kan beskriva hela cellpopulationer, anslutning över hjärnstrukturer eller spårning av en enda axon över stora avstånd (Video 3). Även om frågor om dessa egenskaper har ställts tidigare, förbättras giltigheten av de data som nu kan uppnås med hjälp av tjocka hjärnskivor avsevärt jämfört med tidigare, misstagsbenägna metoder för tunn skiva bildöverlagring.
CLARITY-processen ger framgångsrik och enhetlig rensning av tjocka skivor - från flera millimeter till full hjärnavbildning. Den passiva rensningen (dvs. att inte använda ETC) minskar risken för skador på vävnaden och den tid under vilken proverna är nedsänkta i rensningslösningar så att det inte påverkar den höga effektiviteten av proteinbevarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Projektet har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 803589), Israel Science Foundation (ISF-anslag nr 1815/18) och Kanada-Israel-bidragen (CIHR-ISF, anslag nr 2591/18). Vi tackar Nechama Novick för att han kommenterade hela manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
