Name: Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprende el método CLARITY para visualizar astrocitos y neuronas en hipocampo de ratón con resolución celular. Esta técnica permite analizar más de 300 células simultáneamente y estudiar sus relaciones espaciales en tejido cerebral transparente.

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Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 803589), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención ISF n.º 1815/18) y las subvenciones Canadá-Israel (CIHR-ISF, subvención n.º 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo el manuscrito.

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea y cumplieron con las pautas de la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Transducción de vectores virales
NOTA: La transducción de vectores virales se utiliza para expresar fluoróforos en el cerebro.
<ol><li>Utilice un atlas (por ejemplo, Allen Brain Atlas) para localizar la coordinación relevante del área objetivo. NOTA: Los atlas 3D se pueden encontrar en línea (por ejemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Usando cirugía estereotáctica, inyecte los vectores virales en la estructura cerebral relevante. Véase9 para un protocolo detallado.</li>
	<li>Espere de 3 a 6 semanas para la expresión de fluoróforos. NOTA: Un corto período de tiempo es suficiente si solo es necesario marcar los cuerpos celulares. Se necesitará un largo período de tiempo si las proyecciones axonales son relevantes para la pregunta, ya que los fluoróforos tardan más en expresarse en axones, que pueden tener varios milímetros de largo.</li>
	<li>Validar previamente la especificidad y penetrancia de la expresión de fluoróforos (tanto de la expresión viral como de los animales TG) (Figura 1A). Antes de continuar con el procedimiento CLARITY, designe al menos un cerebro para rebanadas delgadas y asegúrese de que la expresión del fluoróforo sea fuerte y específica para la característica de la célula objetivo.</li>
</ol>2. CLARIDAD
NOTA: Este método hace que el cerebro sea transparente dentro de 2-6 semanas.
<ol><li>Realizar perfusión transcraneal en animales utilizando solución salina tamponada con fosfato en frío (PBS) seguida de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Retire el cerebro y manténgalo en PFA durante la noche a 4 ° C en un tubo de 50 ml o un recipiente similar. NOTA: Antes de realizar la perfusión transcraneal, el animal debe ser anestesiado profundamente. En los ejemplos presentados en este protocolo, todos los animales fueron anestesiados usando ketamina y xilazina (90% y 10%, respectivamente).</li>
	<li>Sustituir el PFA por una solución de hidrogel (SA; véase el cuadro 1) durante 48 h a 4 °C. NOTA: No permita que los materiales se calienten más que la temperatura de refrigeración (4-8 ° C) en esta etapa, o el hidrogel se polimerizará. El HS utilizado en este protocolo contiene 2% de acrilamida, a diferencia de los protocolos anteriores que sugieren 4%22 o 1%17. El beneficio del 2% se detalla en la sección de discusión. Al preparar el HS, trabaje en una superficie helada. Guárdelo a -20 °C.</li>
	<li>Desgasificación NOTA: El propósito de esta etapa es eliminar todo el oxígeno libre del tejido, ya que el O2 interfiere con el proceso de polimerización. Se puede utilizar cualquier gas nonO2 (por ejemplo, N2, CO2); Se recomienda N2 .<ol>
<li>Transfiera el N2 desde el tanque a través de un tubo flexible de 5 mm (interno), conectado a una aguja de 19 G en su extremo (Figura 1B).</li>
		<li>Haga dos pequeños orificios (anchos con aguja) en la tapa del tubo: uno para introducir el gas y el otro para permitir que el aire salga del tubo (Figura 1C).</li>
		<li>Conecte la tubería del gas N2 al tubo y reemplace los gases durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Retire la tubería e inmediatamente selle los orificios con arcilla de modelado en cada tubo (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera los tubos sellados desgasificados a un baño de 37 °C durante 3,5 h para polimerizar el HS, que se convertirá en un gel. Tenga cuidado de no agitar los tubos (Figura 1E).</li>
	<li>Extraiga el cerebro del tubo y retire suavemente el gel polimerizado de su alrededor usando toallitas de laboratorio. Asegúrese de que no quede gel residual adherido a la superficie del tejido, ya que podría reaccionar con la solución en los siguientes pasos, inhibiendo el proceso de limpieza del tejido (Figura 1F). NOTA: Debido a que el gel contenía PFA, la extracción debe realizarse bajo una campana de humos.</li>
	<li>Corta el cerebro si la pregunta en cuestión requiere solo una parte de él. Divídalo por la mitad o en rodajas muy gruesas que contengan todas las áreas de interés (Figura 1G).</li>
	<li>Coloque las rodajas en la Primera Solución de Limpieza (CS1, ver Tabla 2) en un recipiente nuevo y agite a 70 rpm durante 24 h a 37 °C.</li>
	<li>Siga los pasos que se describen a continuación para transferir el cerebro de CS1 a la segunda solución de compensación (CS2, consulte la Tabla 2).<ol>
<li>Prepare un tubo perforado para el cerebro con anticipación (Figura 1H).</li>
		<li>Precaliente CS2 a 40-45 °C en un vaso de precipitados lo suficientemente grande como para contener el tubo. Haga esto en una placa caliente con un agitador. Asegúrese de que la temperatura no alcance los 55 °C para evitar el blanqueamiento de las proteínas expresadas.</li>
		<li>Coloque el vaso de precipitados lleno de CS2 y el tubo perforado en un dispositivo de agitación (un vaso de precipitados de 2 L en la Figura 1I). Establezca una velocidad de agitación moderada que hará que el líquido fluya sin distorsionar el tejido. NOTA: Dentro de 2-6 semanas, el tejido se volverá transparente (el proceso comienza en la periferia y se mueve hacia adentro hacia las estructuras centrales del cerebro). La decisión de cuándo el tejido es "lo suficientemente claro" depende del juicio personal. El cerebro debe ser lo suficientemente transparente para obtener imágenes bajo el microscopio sin interferencia (la Figura 1J no es lo suficientemente clara; Figura 1K suficientemente clara). Superar el punto en el que el tejido es lo suficientemente claro puede causar pérdida de rigidez tisular.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferencia de CS2 a PBST (0,5% Triton X-100 en PBS, ver Tabla 2) en un nuevo recipiente a 37 °C con agitación leve (70 rpm) durante 24 h. NOTA: En el PBST, el tejido se volverá blanquecino (Figura 1L). La claridad volverá (y mejorará) cuando se integre en la solución de coincidencia de índice de refracción (RIMS, consulte el paso 2.14).</li>
	<li>Reemplace el PBST por el nuevo PBST. Mantener en las mismas condiciones (37 °C con agitación leve) durante otras 24 h.</li>
	<li>Reemplace PBST nuevamente con PBST nuevo y manténgalo en RT durante 24 h.</li>
	<li>Transferencia a PBS en RT durante 24 h.</li>
	<li>Reemplace el PBS y déjelo en RT durante 24 horas adicionales.</li>
	<li>Retire el cerebro de PBS y transfiéralo a RIMS a 37 ° C durante la noche. NOTA: Inicialmente, las ondas en el RIMS pueden rodear el cerebro. Este protocolo fue diseñado y validado utilizando dos RIMS comerciales específicos (ver Tabla 3). Sin embargo, el protocolo no debe diferir cuando se utilizan otros RIMS (comerciales o de fabricación propia).</li>
	<li>Mantenga el tejido en RT durante otras 24 h o hasta que la solución alcance el equilibrio total, es decir, cuando el tejido se vuelva transparente y la solución ya no contenga ondulaciones visibles (Figura 1M).</li>
	<li>Si el tejido es transparente, proceda a la preparación de la cámara. Si en este punto, el tejido se vuelve blanco en lugar de transparente (debido a agregados de moléculas residuales de SDS), limpie la muestra nuevamente repitiendo los pasos 2.9 y 2.10, y transfiera el tejido a CS2 (paso 2.8) durante unos días, seguido de todos los pasos hasta el paso 2.15.</li>
</ol>3. Preparación de la Cámara
NOTA: Cada muestra requiere una diapositiva con una cámara de imagen en la que se colocará la muestra.
<ol><li>Coloque la muestra en el centro de la diapositiva.</li>
	<li>Usando una pistola de pegamento caliente, cree paredes en los bordes de la diapositiva, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio (aproximadamente 5 mm) en una de las esquinas (Figura 2A, B).</li>
	<li>Aplique 1-2 gotas del RIMS en la muestra para mantener la superficie superior húmeda y evitar que se formen burbujas entre la cubierta y el tejido.</li>
	<li>Inmediatamente después de aplicar las gotas RIMS, agregue la última capa de pegamento caliente a las paredes (para que alcancen la altura del cerebro / rebanada) y progrese inmediatamente (mientras el pegamento caliente todavía está líquido) al paso 3.5.</li>
	<li>Selle la parte superior con una funda, colocándola de la manera más uniforme posible en la parte superior de la capa de pegamento caliente aún caliente (Figura 2C).</li>
	<li>Llene la cámara con el RIMS a través del espacio dejado en las paredes de pegamento caliente (Figura 2D, E).</li>
	<li>Cierre el espacio con pegamento caliente. No dejar aire en el interior (Figura 2F).</li>
	<li>Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la diapositiva, corte los bordes extensibles (Figura 2G).</li>
	<li>Si el objetivo utilizado para la obtención de imágenes está sumergido, agregue otros 2-3 mm de pegamento a las paredes sobre el deslizamiento para que la solución de inmersión dure un período más largo (Figura 2H).</li>
</ol>4. Imágenes (confocales o de dos fotones)
<ol><li>Compruebe si el escenario puede contener la cámara, ya que el grosor de la cámara puede alcanzar varios milímetros. NOTA: Por ejemplo, el microscopio confocal (ver la Tabla de Materiales) utilizado en este protocolo está equipado con varias etapas (por ejemplo, circular, rectangular). Cualquiera que sea la etapa elegida para sostener la cámara es irrelevante siempre que sus parámetros se ajusten a los tamaños de la cámara.</li>
	<li>Trabaje con un objetivo con una distancia de trabajo suficiente, es decir, una distancia de trabajo mínima ≥3 mm, ya que la región cerebral de interés puede tener unos pocos milímetros de profundidad, y el cobertor puede no ser completamente recto ya que se colocó manualmente. NOTA: Como demostración, los resultados presentados en la Figura 1, Video 1 y Video 2 se obtuvieron bajo un microscopio de dos fotones utilizando un objetivo de inmersión en agua 16x con una distancia de trabajo de 3 mm y un aumento de 2.4 para obtener un campo de visión de 652 x 483 μm y una pila z con intervalos de 0.937 μm entre los planos.</li>
	<li>Realice imágenes de áreas múltiples, que pueden tardar unas horas o incluso días. Asegúrese de que haya un amplio almacenamiento gratuito en la computadora, ya que el tamaño de cada imagen puede alcanzar hasta decenas de gigabits. NOTA: Las imágenes CLARITY pueden dar lugar a un número significativamente mayor de secciones de imagen en profundidad. Por lo tanto, las intensidades utilizadas para capturar la expresión deben ser relativamente bajas para evitar la sobreexpresión durante la suma de la imagen.</li>
	<li>Para los objetivos de inmersión, revise el líquido de forma rutinaria mientras toma imágenes y complemente con líquido adicional si es necesario. NOTA: Durante la toma de imágenes de los datos presentados en el Video 3, se agregó agua a la superficie de la cámara cada 6-8 h para combatir la evaporación.</li>
	<li>Una vez adquirida la imagen, visualícela y analícela utilizando varios paquetes de software diferentes. NOTA: El software recomendado incluye Imaris y SyGlass tanto para visualización como para análisis. La tubería precisa para la reconstrucción optimizada de astrocitos utilizando el software Imaris se ha descrito anteriormente9. En resumen, las características de Imaris utilizadas en este estudio fueron Filamentos para reconstruir completamente las estructuras celulares y Manchas para extraer la posición en el espacio de todos los somata.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Los métodos de limpieza de tejidos presentan una herramienta revolucionaria en la investigación del cerebro, invitando a preguntas que antes no se podrían haber hecho. A partir de apuntar a las propiedades de un pequeño grupo de células, una sola célula o incluso una sola sinapsis, CLARITY ahora permite la orientación de poblaciones celulares totales o características de conectividad de largo alcance mediante el uso de fluoróforos relevantes.
El resultado de la combinación de la expresión del ...

En los últimos años, el conocimiento de la función de los astrocitos y cómo interactúan con los circuitos neuronales ha aumentado dramáticamente. Los astrocitos pueden influir en la plasticidad 1,2, ayudar en la recuperación neuronal postinjuria 3,4 e incluso inducir la potenciación neuronal de novo, con estudios recientes que muestran la importancia de los astrocitos en la adquisición y recompensa de la memoria, anteriormente consideradas como funciones puramente neuronales 5,6,7 . Una característica de particular interés en la investigación de astrocitos es la disposición espacial de las células, que mantienen organizaciones espaciales únicas en el hipocampo y otras estructuras cerebrales 8,9,10. A diferencia de las dendritas neuronales que se entrelazan entre los somata celulares, los astrocitos del hipocampo habitan territorios visualmente distinguibles con ligera superposición entre sus procesos, creando dominios distintos 8,11,12,13. La evidencia que apoya la participación de los astrocitos en los circuitos neuronales no apoya la falta de una descripción anatómica detallada de tales poblaciones y las neuronas en sus dominios14.
Los procedimientos de transducción de vectores virales, junto con los animales transgénicos (TG), se han popularizado como un conjunto de herramientas para investigar las estructuras cerebrales, las funciones y las interacciones celulares15,16. La utilización de diferentes promotores permite la focalización de células específicas según sus propiedades genéticas, niveles de activación17,18 u objetivos de proyección. Diferentes virus pueden expresar fluoróforos de diferentes colores en diferentes poblaciones. Un virus se puede combinar con la expresión endógena de fluoróforos en TG, o se pueden usar animales TG sin la necesidad de virus. Estas técnicas son ampliamente utilizadas para el marcado neuronal, y algunos laboratorios han comenzado a utilizarlas con modificaciones especializadas para dirigirse a otros tipos de células, como los astrocitos 5,9,19.
La técnica CLARITY, descrita por primera vez en 201320,21, permite el estudio de rebanadas gruesas de cerebro al hacer que todo el cerebro sea transparente mientras deja intactas las estructuras microscópicas. Al combinar los dos métodos, la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos, ahora está disponible la opción de examinar las interacciones espaciales entre diferentes poblaciones de tipos celulares. La mayoría de los estudios de interacción astrocito-neurona se realizaron en rebanadas delgadas de cerebro, lo que resultó en imágenes de astrocitos incompletos debido a sus grandes dominios, lo que restringió radicalmente el número de células analizadas. El uso de la técnica CLARITY permite la caracterización de resolución de una sola célula de poblaciones celulares en volúmenes a gran escala simultáneamente. La obtención de imágenes de poblaciones celulares marcadas fluorescentemente en cerebros claros no proporciona resolución sináptica, pero permite una caracterización exhaustiva de las interacciones espaciales entre los astrocitos y una variedad de tipos de células neuronales.
Por esa razón, aprovechamos estas técnicas de vanguardia para investigar las propiedades de los astrocitos en todo el CA1 dorsal, obteniendo imágenes de toda la lámina (Estrato Radiatum, capa piramidal y Estrato Oriens). Medimos decenas de miles de astrocitos (con penetrancia viral de >96%5), analizando así la información de toda la población astrocítica alrededor de CA1. Con una penetrancia eficiente de los marcadores neuronales, pudimos registrar las interacciones entre toda la población de astrocitos CA1 y los cuatro tipos de células neuronales: parvalbúmina (PV), somatostatina (SST), neuronas inhibidoras VIP y células piramidales excitatorias9.
Se realizaron varios experimentos utilizando una combinación de fluorescencia de animales TG y vectores virales de diferentes colores (todas células inhibitorias), mientras que otros (excitatorios) utilizaron dos vectores virales que expresan diferentes fluoróforos bajo diferentes promotores9. Este artículo presenta un protocolo detallado, que incluye el etiquetado de las células deseadas en el cerebro, haciendo que el cerebro sea transparente utilizando un procedimiento CLARITY modificado, así como imágenes y análisis de estructuras cerebrales completas, utilizando varios procedimientos y software.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vector viral utilizado para detectar astrocitos</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vector viral utilizado para detectar neuronas</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vector viral utilizado para detectar núcleos neuronales</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td> vector <td>viral utilizado para detectar neuronas</td></tr><tr><td>Acrilamida (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilamida (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>Peso molecular: 61,83 g/mol</td></tr><tr><td>Microscopio confocal, de escaneo, FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x objetivo (UPlanSApo, 0.16 NA)</td></tr><tr><td>Software</td> <td>ImarisBitplane, Reino Unido</td><td></td><td>Un software que permite el análisis 3D de imágenes</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> SyGlass <td>Un software que permite el análisis 3D de imágenes utilizando realidad virtual</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Peso molecular - 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Ti:láser de zafiro (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubos fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro de paso de banda (Semrock), objetivo de inmersión en agua 16x (Nikon, 0.8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 Iniciador</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos utilizando el método CLARITY permite investigar simultáneamente varios tipos de células cerebrales y sus interacciones. La transducción de vectores virales permite el marcado de diversos tipos de células en diferentes colores de fluorescencia dentro del mismo tejido. Las células pueden ser identificadas genéticamente por actividad o proyección. Utilizando un protocolo CLARITY modificado, el tamaño potencial de la muestra de astrocitos y neuronas ha crecido en 2-3 órdenes de magnitud. El uso de CLARITY permite la obtención de imágenes de astrocitos completos, que son demasiado grandes para caber en su totalidad en rodajas, y el examen de los somata con todos sus procesos. Además, brinda la oportunidad de investigar la interacción espacial entre los astrocitos y los diferentes tipos de células neuronales, a saber, el número de neuronas piramidales en cada dominio astrocítico o la proximidad entre los astrocitos y las poblaciones específicas de neuronas inhibitorias. Este documento describe, en detalle, cómo se deben aplicar estos métodos.

La limpieza exitosa de rebanadas gruesas de tejido cerebral da como resultado una nueva gama de preguntas que se pueden hacer con respecto a las propiedades de las poblaciones de células grandes en comparación con las propiedades de las células individuales o grupos vecinos de células. Para lograr resultados exitosos, uno debe adherirse estrictamente al protocolo CLARITY, ya que hay una amplia gama de parámetros que deben considerarse para reducir la varianza entre muestras (por ejemplo, porcentaje de claridad, informaci...

La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza cerebral utilizando el método CLARITY permite la investigación de un gran número de neuronas y astrocitos simultáneamente.

Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

La técnica de claridad descrita por primera vez en 2013 es una técnica de limpieza de tejidos que permite el muestreo de grandes cantidades de células, vasos sanguíneos, por lo que incluso proteínas como una resolución de una sola célula en rodajas gruesas de cerebro. Esta técnica permite el estudio de estructuras microscópicas intactas haciendo que todo el cerebro sea transparente. Este protocolo es un chip simple y una tubería directa para la limpieza de tejidos.Esta técnica se puede utilizar para limpiar tejidos en otros sistemas además de los tejidos cerebrales. Para comenzar, selle el tubo y la tapa con parafilm y perfore dos orificios en la tapa. Luego transfiera el gas nitrógeno del tanque utilizando una tubería flexible con cinco milímetros de diámetro interno y una aguja de calibre 19 conectada en su extremo.Comience a desgasificar conectando la tubería al tubo y permitiendo el intercambio de gases durante 30 minutos a temperatura ambiente. Separe la tubería e inmediatamente selle los orificios con arcilla de modelado. Luego transfiera los tubos sellados de desgasificación a un baño de 37 grados Celsius durante 3 1/2 horas para polimerizar la solución de hidrogel.Saque el cerebro del tubo. Usando toallitas de laboratorio, retire el hidrogel polimerizado alrededor del cerebro asegurándose de que no quede gel residual adherido a la superficie del cerebro. Divida el cerebro en rebanadas gruesas que contengan todas las áreas de interés.Coloque las rodajas en la primera solución de limpieza e incube a 37 grados centígrados con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Mientras tanto, prepare un tubo perforado para colocar el cerebro. Coloque el tubo perforado en un vaso de precipitados lleno de una segunda solución de limpieza en un dispositivo de agitación.Luego coloque el cerebro en el vaso de precipitados y séllelo con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento. Después de que el tejido se vuelva transparente, transfiera el cerebro a PBST en incubación a 37 grados Celsius con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Reemplace la solución con PBST fresco y continúe la incubación durante otras 24 horas.Luego transfiera el cerebro a PBS a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro de PBS y transfiéralo a la solución de coincidencia de índice de refracción. Incubar el cerebro a 37 grados centígrados durante la noche.Primero, coloque la muestra en el centro de la diapositiva. Usando pegamento caliente, cree paredes en los bordes del portaobjetos, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio en una de las esquinas.A medida que la capa de pegamento caliente se acerca a la altura de la rebanada cerebral, aplique una o dos gotas de la solución de coincidencia de índice de refracción en la muestra para humedecer la superficie superior y evitar la formación de burbujas. Mientras el pegamento caliente todavía es líquido, selle la parte superior con un deslizamiento de cubierta, colocándolo de la manera más uniforme posible y luego llene la cámara con la solución de coincidencia de índice de refracción. Cierre el espacio con pegamento caliente.Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la diapositiva, corte los bordes que se extienden. Si se utiliza un objetivo de inmersión en aceite para la obtención de imágenes, agregue otros dos o tres milímetros de pegamento a las paredes sobre el deslizamiento de la cubierta para retener la solución de inmersión. Después de este protocolo, el tejido cerebral será eliminado.Se prepararon cortes cerebrales claros utilizando este protocolo para visualizar poblaciones de astrocitos y neuronas en la región CA1 del hipocampo de ratón. Todos los astrocitos expresaron tdTomato y las neuronas excitadoras expresaron H2B-GFP en sus núcleos. La cámara preparada para el tejido clarificado fue óptima para la obtención de imágenes bajo un microscopio de dos fotones o confocal.Usando un microscopio de dos fotones, se observaron más de 300 astrocitos en una sección despejada de la región CA1 del hipocampo del ratón. Los astrocitos del hipocampo en células rojas y piramidales, somata en verde eran visibles y el tejido grueso y transparente representaba la proximidad espacial entre estos dos tipos de células. Usando un microscopio confocal láser de barrido, se rastrearon haces axonales de neuronas excitatorias a través de todo un hemisferio.Se trazaron haces verdes desde el hipocampo dorsal hacia los cuerpos súper mamiles. Los haces rojos fueron trazados desde los cuerpos milares hacia su origen en el hipocampo de ventilación. Factores como la temperatura, las concentraciones y el tiempo de incubación influyeron en el resultado del procedimiento de claridad.Por lo tanto, la precisión en cada paso del protocolo es vital para el éxito de lograr un tejido claro. Usando esta técnica, medimos las distancias entre las neuronas y los astrocitos en varias estructuras cerebrales. Este protocolo permitió el análisis de dos a tres órdenes de magnitud más células que en estudios anteriores.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Este video ilustra un método para establecer un cocultivo indirecto neurona-astrocito utilizando un enfoque compartimentado. En esta configuración, las neuronas y los astrocitos están separados espacialmente, pero comparten un medio condicionado. Los factores neurotróficos liberados por los astrocitos promueven la diferenciación neuronal y la formación de conexiones sinápticas, lo que sugiere interacciones neurona-glía.

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Fuente: Refaeli, R., et al., Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados. J. Vis. Exp. (2022) El video muestra la preparación de una cámara y la neuroimagen del tejido del hipocampo de ratón aclarado mediante microscopía de dos fotones para visualizar las interacciones espaciales entre los astrocitos marcados con fluorescencia y las neuronas excitadoras.

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Los astrocitos en el SNC cambian sus propiedades funcionales y estructurales en respuesta a estímulos dañinos. Este informe presenta un protocolo para la evaluación de la morfología tridimensional de los astrocitos en condiciones de enfermedad o después de intervenciones terapéuticas.

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La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la organización de redes astrocytic. El método descrito minimiza el sesgo para proporcionar medidas descriptivas de estas redes como recuento de células, el tamaño, zona y posición dentro de un núcleo. Anisotropía es evaluada con un análisis vectorial.

Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.

Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

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Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

Aprende el método CLARITY para visualizar astrocitos y neuronas en hipocampo de ratón con resolución celular. Esta técnica permite analizar más de 300 células simultáneamente y estudiar sus relaciones espaciales en tejido cerebral transparente.

Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados

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