Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados
31 de marzo de 2022
La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza cerebral utilizando el método CLARITY permite la investigación de un gran número de neuronas y astrocitos simultáneamente.
La técnica de claridad descrita por primera vez en 2013 es una técnica de limpieza de tejidos que permite el muestreo de grandes cantidades de células, vasos sanguíneos, por lo que incluso proteínas como una resolución de una sola célula en rodajas gruesas de cerebro. Esta técnica permite el estudio de estructuras microscópicas intactas haciendo que todo el cerebro sea transparente. Este protocolo es un chip simple y una tubería directa para la limpieza de tejidos.
Esta técnica se puede utilizar para limpiar tejidos en otros sistemas además de los tejidos cerebrales. Para comenzar, selle el tubo y la tapa con parafilm y perfore dos orificios en la tapa. Luego transfiera el gas nitrógeno del tanque utilizando una tubería flexible con cinco milímetros de diámetro interno y una aguja de calibre 19 conectada en su extremo.
Comience a desgasificar conectando la tubería al tubo y permitiendo el intercambio de gases durante 30 minutos a temperatura ambiente. Separe la tubería e inmediatamente selle los orificios con arcilla de modelado. Luego transfiera los tubos sellados de desgasificación a un baño de 37 grados Celsius durante 3 1/2 horas para polimerizar la solución de hidrogel.
Saque el cerebro del tubo. Usando toallitas de laboratorio, retire el hidrogel polimerizado alrededor del cerebro asegurándose de que no quede gel residual adherido a la superficie del cerebro. Divida el cerebro en rebanadas gruesas que contengan todas las áreas de interés.
Coloque las rodajas en la primera solución de limpieza e incube a 37 grados centígrados con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Mientras tanto, prepare un tubo perforado para colocar el cerebro. Coloque el tubo perforado en un vaso de precipitados lleno de una segunda solución de limpieza en un dispositivo de agitación.
Luego coloque el cerebro en el vaso de precipitados y séllelo con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento. Después de que el tejido se vuelva transparente, transfiera el cerebro a PBST en incubación a 37 grados Celsius con rotación a 70 RPM durante 24 horas. Reemplace la solución con PBST fresco y continúe la incubación durante otras 24 horas.
Luego transfiera el cerebro a PBS a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro de PBS y transfiéralo a la solución de coincidencia de índice de refracción. Incubar el cerebro a 37 grados centígrados durante la noche.
Primero, coloque la muestra en el centro de la diapositiva. Usando pegamento caliente, cree paredes en los bordes del portaobjetos, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio en una de las esquinas.
A medida que la capa de pegamento caliente se acerca a la altura de la rebanada cerebral, aplique una o dos gotas de la solución de coincidencia de índice de refracción en la muestra para humedecer la superficie superior y evitar la formación de burbujas. Mientras el pegamento caliente todavía es líquido, selle la parte superior con un deslizamiento de cubierta, colocándolo de la manera más uniforme posible y luego llene la cámara con la solución de coincidencia de índice de refracción. Cierre el espacio con pegamento caliente.
Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la diapositiva, corte los bordes que se extienden. Si se utiliza un objetivo de inmersión en aceite para la obtención de imágenes, agregue otros dos o tres milímetros de pegamento a las paredes sobre el deslizamiento de la cubierta para retener la solución de inmersión. Después de este protocolo, el tejido cerebral será eliminado.
Se prepararon cortes cerebrales claros utilizando este protocolo para visualizar poblaciones de astrocitos y neuronas en la región CA1 del hipocampo de ratón. Todos los astrocitos expresaron tdTomato y las neuronas excitadoras expresaron H2B-GFP en sus núcleos. La cámara preparada para el tejido clarificado fue óptima para la obtención de imágenes bajo un microscopio de dos fotones o confocal.
Usando un microscopio de dos fotones, se observaron más de 300 astrocitos en una sección despejada de la región CA1 del hipocampo del ratón. Los astrocitos del hipocampo en células rojas y piramidales, somata en verde eran visibles y el tejido grueso y transparente representaba la proximidad espacial entre estos dos tipos de células. Usando un microscopio confocal láser de barrido, se rastrearon haces axonales de neuronas excitatorias a través de todo un hemisferio.
Se trazaron haces verdes desde el hipocampo dorsal hacia los cuerpos súper mamiles. Los haces rojos fueron trazados desde los cuerpos milares hacia su origen en el hipocampo de ventilación. Factores como la temperatura, las concentraciones y el tiempo de incubación influyeron en el resultado del procedimiento de claridad.
Por lo tanto, la precisión en cada paso del protocolo es vital para el éxito de lograr un tejido claro. Usando esta técnica, medimos las distancias entre las neuronas y los astrocitos en varias estructuras cerebrales. Este protocolo permitió el análisis de dos a tres órdenes de magnitud más células que en estudios anteriores.
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Descripción general
Este estudio utiliza el método CLARITY combinado con transducción de vectores virales para explorar las relaciones espaciales entre neuronas y astrocitos en el hipocampo del ratón. Al hacer que el tejido sea transparente, esta técnica permite a los investigadores investigar una mayor cantidad de células, revelando información sobre la organización e interacciones celulares.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de aclaramiento de tejidos
- Imágenes celulares
Antecedentes
- La técnica CLARITY permite la visualización del tejido cerebral a nivel celular.
- Permite el análisis de grandes poblaciones de neuronas y astrocitos en tejidos intactos.
- Este método mejora la claridad de las gruesas secciones cerebrales en comparación con los métodos de imagenología tradicionales.
- El estudio enfatiza el papel de la transparencia del tejido en la comprensión de la arquitectura neuronal.
Propósito del estudio
- Investigar las relaciones estructurales entre astrocitos y neuronas en el hipocampo del ratón.
- Medir las distancias entre diferentes tipos de células en varias estructuras cerebrales.
- Demostrar la eficacia del método CLARITY para la imagenología celular.
Métodos utilizados
- El estudio utilizó la técnica CLARITY para el aclaramiento del tejido en secciones cerebrales.
- Se utilizó tejido hipocampal de ratón para visualizar astrocitos y neuronas excitadoras.
- No se mencionaron flujos de trabajo de multiómicos.
- Los pasos clave incluyeron la desgasificación, la polimerización de hidrogel y la incubación en soluciones de aclaramiento.
- El tejido se visualizó utilizando microscopía de dos fotones y confocal.
Resultados principales
- Se visualizaron más de 300 astrocitos en secciones hipocampales claras.
- Se estableció el contexto espacial de los astrocitos y las neuronas excitadoras, mostrando su proximidad.
- Se observaron observaciones significativas de haces axónicos entre poblaciones neuronales en tejidos aclarados.
- Varios factores afectaron la claridad de los tejidos, lo que destaca la necesidad de una metodología precisa.
Conclusiones
- Este estudio demuestra que el método CLARITY puede mejorar significativamente la visualización de las relaciones celulares en el cerebro.
- Los hallazgos permiten una mejor comprensión de la organización espacial de las neuronas y las células gliales.
- Los conocimientos obtenidos con este método pueden tener implicaciones para la investigación en mecanismos neuronales y modelos de enfermedades potenciales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
