Summary
我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其分化为骨骼肌谱系的方案。
Abstract
探索间充质干细胞的治疗潜力取决于分离的难易程度，分化的效力以及来源的可靠性和稳健性。我们在这里描述了一种逐步方案，用于从人脐带组织（uMSCs）中分离间充质干细胞，其免疫表型以及这种培养物在几段传代中的繁殖。在这个过程中，uMSCs的存活率很高，因为没有酶消化。此外，去除血管，包括脐带动脉和静脉，确保内皮来源的细胞没有污染。使用流式细胞术，分离时的 uMSC 为 CD45−CD34−，表明造血谱系中没有细胞。重要的是，它们表达了关键的表面标记，CD105，CD90和CD73。在建立培养物后，本文描述了一种诱导这些uMSC分化成骨骼肌谱系的有效方法。对分化 uMSC 中肌源性进展的详细分析显示，uMSCs 表达 Pax7（分化初始阶段肌源祖细胞的标志物），其次是 MyoD 和 Myf5 的表达，最后是终末分化标志物肌球蛋白重链 （MyHC）。
Introduction
人类脐带被认为具有强大的间充质干细胞库，由于其强大的增殖和分化速率，免疫调节特性以及从所有三个胚层生成细胞的能力，目前正在探索再生疗法1。脐带组织由多个区室组成，如脐带血、脐静脉内皮下和沃顿果冻（WJ），其本身包括三个模糊区域 - 血管周围区，血管间区和羊膜下或脐带衬里（CL）2。虽然uMSC可以从所有这些不同的区域中分离出来，并广泛地表达关键的MSC标记物，但这些区室是否包含相同的uMSC群体或显示其分化效力的差异尚不清楚3。因此，uMSC的隔离方案需要在其隔离模式和区域中具有更高的精度，对分化电位进行可靠的表征，最后需要对脐带的不同隔室进行比较分析。
在这种情况下，很少有研究表明，脐带不同部位之间的uMSC增殖和鉴别电位存在差异。其中，从CL和WJ区域分离的uMSC之间的比较分析显示，CL衍生的uMSCs3，4具有更大的增殖潜力。在另一项研究中，与血管周围细胞（HUCPV）相比，WJ衍生的uMSCs在增殖测定中表现更好5。在检查脐带血来源的uMSCs和没有血管污染的脐带组织来源的umMSC之间的差异时，报告了两个区室之间关键MSC标志物的差异表达，以及脐带组织来源的umSCCs6的增殖速率增加。
在几项研究 uMSC 主要在中胚层谱系组织（如成骨性、脂肪原性和软骨成因谱系）中的分化潜力的研究中，很少有研究提供肌源分化和后续表征的详细方案，以及各种脐带区室之间的比较分析。在这种情况下，我们开发了一种强大的肌肉分化方案，并观察到与脐带血6相比，脐带组织衍生的uMSC显示出优越的肌源分化能力。在这里，详细描述了从整个脐带组织中分离uMSCs的逐步方案，这些组织没有与脉管系统相关的细胞，它们的表征以及它们分化成肌源谱系。
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Protocol
本研究中脐带组织的使用得到了干细胞研究机构委员会（IC-SCR），机构伦理委员会，转化健康科学与技术研究所（IEC-THSTI），哈里亚纳邦古尔冈市公民医院机构伦理委员会和机构生物安全委员会THSTI的批准。在出生时从足月分娩中采集人脐带组织样本。从受试者那里获得知情书面同意。所有方法均按照相关准则和规定进行。
1. 从脐带组织中分离间充质干细胞
- 在分娩时，切下至少5厘米的脐带，最好靠近胎盘，并通过用70%乙醇擦拭外表面来消毒脐带。将脐带组织块从一个含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的50mL收集管依次转移到另一个含有相同盐水的50mL收集管中。在1小时内将带有冰上受试者姓名的收集管运输到实验室。
注意：对于大型研究，对样本进行条形码以使其能够在整个研究中进行跟踪可能很有用。重要的是，所有处理人体组织的人员都应获得乙型肝炎疫苗的完整方案。 - 在实验室中，在BSL-2罩中打开紫外线25分钟，以便在使用前对高压灭菌的仪器和移液器进行灭菌。
- 将脐带组织片从收集管转移到10cm2 组织培养处理的培养皿中，其中含有富含5g / L葡萄糖，50μg/ mL庆大霉素，2.5μg/ mL两性霉素B，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的PBS（ 图1中的示意图）。
- 使用手术刀，沿其纵轴垂直切开脊髓组织，以获得两个半圆柱形的碎片。由于脐带扭转和粘液表面，用另一只手握住的一对镊子固定组织。
- 此时，观察脐动脉和静脉，并使用手术刀从表面沿一个方向刮掉血管，以去除血管。在PBS中再次冲洗脐带组织，以除去与组织相关的所有残留血液。确保刮擦是温和的，以保持血管周围WJ中细胞的完整性。
- 将每半根脐带组织切成0.5厘米3 大小的碎片，并将碎片放在培养皿上，腔面朝下。将培养皿在含有5%CO 2的37°C加湿室中短暂孵育10分钟。
- 孵育后，用20mL含有MEM Alpha修饰的培养基浸入含有脐带组织片的培养皿中，不含L-谷氨酰胺，核糖核苷和脱氧核糖核苷，15%胎牛血清（未热灭活）和50μg/ mL庆大霉素。沿侧面轻轻添加生长培养基，以防止组织外植体从其方向上移位。加入多余的培养基以占在孵育期间将被组织外植体吸收的部分。
- 孵育3天后，向培养物中加入新鲜培养基。确保培养物在处理培养物时免受外植体的冲击和移动。
- 1周后，使用无菌镊子单独去除组织碎片，并使用适当的生物危害袋丢弃以进行处理。保留现有培养基并加入10 mL新鲜生长培养基。每4天更换一次生长培养基，直到单个菌落达到70%的汇合度。
注意：细胞可能不会均匀分布在整个培养皿中，因为需要监测单个增殖集落是否与时间汇合。通常，在一个月内，一个10厘米2 的培养皿会产生足够的细胞，可以分成一个单独的培养皿。 - 使用胰蛋白酶/ EDTA溶液（1x 0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA在Hanks平衡盐溶液[HBSS]中）收获贴壁细胞。在25°C下以470× g 离心细胞悬浮液5分钟，并将细胞沉淀重悬于生长培养基中。
2. uMSCS的免疫表型和传播
- 一旦贴壁细胞达到50%-60%汇合度并充分扩散，继续进行免疫表型分析。不要对完全融合的培养物进行MSC标志物分析，因为这往往会导致关键MSC标志物的下调。
- 胰蛋白酶消化后，将1×106 个细胞/ mL的细胞悬液分布在FACS管（1×10个5 个细胞/管）中，并用适当的荧光团连接抗体（均为1：50稀释）组合染色：未染色;CD105 + CD90;CD105 + CD73;CD105;CD90;CD73;CD34 + CD45（普通荧光基团）;每个荧光基团的同种型对照。在流式细胞仪上记录至少10，000个事件总数，以便进一步分析。
注意：由于细胞是针对每个表面标记物单独分析的，因此不需要对细胞亚群进行门控。 - 除上述标志物外，确认由单个脐带组织样品产生的uMSC系中存在阳性和阴性表面标记物（表1）。
- 通过流式细胞术分析标记的细胞，并确定CD105 + CD90 + 和CD105 + CD73 +细胞的 百分比。分别分析CD105+ 和CD34−CD45− 细胞。
3. uMSCs分化为骨骼肌
- 在PBS中用0.01%胶原蛋白和20μg/ mL层粘连蛋白涂覆组织培养板。在室温下涂覆这些板至少4小时。
- 在生长培养基中以10，000个细胞/ cm2 的密度平板uMSCs。
- 当细胞汇合70%时，吸出生长培养基并用PBS冲洗培养物2倍。向 uMSC 中加入包含 DMEM + 5% 马血清 + 0.1 μM 地塞米松 + 50 μM 氢化可的松的肌源分化培养基 （M1）。为了确定肌源进展的动力学，每隔一天向培养物中加入M1培养基。
- 为了确定肌源性进展的动力学，分别在2天，4-5天，6-7天和10-14天分析uMSCs的Pax7，MyoD，Myogenin和MyHC表达。
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Representative Results
从脐带组织中分离 uMSC 的成功率>95%，这与全脐带血的成功率很低。成功分离uMSCs后，FACS分析显示所有细胞均为CD34−CD45−CD105+CD90+。然而，在比较分析中，从脐带血中分离出的uMSCs显示异质群体，其中一定比例的细胞显示CD34 + CD45 + CD105 + （〜15%）。此外，双阳性CD105 + CD90 + 的数量较少（约5%）（补充图S1）。这导致uMSCs与脐带血的肌源性分化水平降低，因为诱导肌发生需要CD105和CD90表达。uMSC还显示 表1中列出的标记的表达式。如果脐带血来源的uMSC受到污染，则还会存在CD34 + CD45 + 细胞。这导致用于接种肌源分化的假细胞计数。>90%的细胞对CD105和CD90表达呈双重阳性的迹象是，uMSCs没有承诺任何中胚层谱系并继续保持多能，因为CD105和CD90的表达在分化时都下调。必须使用多个标记物来确认 uMSC 表型，因为没有单一的确定性 uMSC 标记。在这项分析中，我们评估了实验室中建立的每个uMSC线的 表1 中列出的所有标记物的存在。此外，我们确定了CD105和CD90（图2A）以及CD105和CD73（图2B）的双阳性状态，确保uMSC表达多个关键标记。这是必要的，以避免污染数量小于0.05%的单阳性细胞。
图1：显示从脐带组织中逐步分离和表征uMSC的示意图。 缩写：uMSCs =来自人类脐带组织的间充质干细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图2：脐带组织衍生的uMSC中的MSC标记物分析（A）uMSCs显示CD105和CD90的表达，并且不表达造血标志物CD34和CD45。图中显示了三条 uMSC 线（UCT15、UCT18 和 UCT26）的代表性 FACS 图（N = 16）。顶行面板显示所有三个 uMSC 系中 CD105 和 CD90 表达呈 Q2 象限阳性的细胞。底部一排面板显示Q1象限中的细胞CD105表达阳性，CD34和CD45表达阴性。（B）uMSCs显示MSC标记CD73（N = 16）的表达。缩写：uMSCs =来自人类脐带组织的间充质干细胞。请点击此处查看此图的大图。
| uMSC 阳性标志物 | uMSC 阴性标志物 |
| CD105 | CD34型 |
| CD90型 | CD45型 |
| CD73型 | CD106型 |
| CD29型 | HLA DR |
| CD44型 | CD31型 |
| HLA ABC | CD14型 |
| CD49e | CD49e |
| CD54型 | |
| CD13型 |
表1：uMSC的阳性和阴性标记列表。 缩写：uMSCs =来自人类脐带组织的间充质干细胞。
对于uMSCs分化为肌源谱系，uMSCs通常表达Pax7，Pax7是M1添加后的前2天内前体细胞的标志物，然后在M1添加的前4天内表达MyoD（图3）。在分化6天时，细胞表达肌原蛋白，随后在诱导分化的10天至14天之间表达肌球蛋白重链（MyHC）。我们使用RNA测序，流式细胞术，免疫细胞化学，RT-PCR和蛋白质印迹分析更详细地表征了肌源性表达的动力学，以记录肌源性标志物的分阶段表达，证实了该方案的稳健性。未分化的uMSCs和分化为骨骼肌的umSC之间的全基因组转录组学测序揭示了907个基因响应于诱导肌源分化而上调（图4）。
图3：uMSCs分化为骨骼肌。 uMSCs在M1培养基中培养2天，4天，7天和10天，并评估（A）2天后的Pax7，（B）4天后的MyoD，（C）来自不同umsC系的肌原蛋白表达，7天后用T8，T12，T14和T25表示，以及（D）10天后的MyHC。比例尺 = （B， D） 50 μm。缩写：uMSCs =来自人类脐带组织的间充质干细胞;GAPDH = 甘油醛 3-磷酸脱氢酶;MyoD = 肌母细胞测定蛋白1;MyHC = 肌球蛋白重链;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;Mb = 肌母细胞;MT = 肌管。 请点击此处查看此图的大图。
图4：来自脐带血和区分为骨骼肌的脐带组织的uMSCs的比较转录组学分析。 对照uMSCs和uMSC之间907个基因的归一化计数的热图，从脐带血和脐带组织中分化为骨骼肌7天。维恩图（左）显示，与脐带血来源的uMSC相比，在脐带组织衍生的uMSCs中上调的肌源基因数量更多。下表显示了在脐带组织和脐带血中上调的常见肌源基因。这个数字来自Mishra等人6。缩写：1，2 =生物重复;CB1，2 =来自脐带血uMSCs的肌源细胞;CT1，2 =来自脐带组织uMSCs的肌源性细胞;coB1，2 = 对照脐带血中未分化的 uMSC;coT1， 2 = 对照未分化的 uMSC 与脐带组织。 请点击此处查看此图的大图。
为了进行比较分析，我们比较了从脐带血和脐带组织中分离的uMSCs。RNA测序数据显示，来自脐带组织衍生的肌原细胞的uMSCs中上调的肌源基因比来自脐带血的肌源基因更多（图4）。用于支持这项研究的RNA测序数据被上传到NCBI（SRA加入是GSE147114）。简而言之，使用PANTHER GO-slim数据库进行组织特异性转录组学分析，确定了与肌动蛋白结合和肌节组装（TPM2， LDB3， PDLIM3， FHL1， NEXN， MYOM1）转运蛋白相关的细胞骨架蛋白与收缩功能（RTN2， SLC19A2， ACHE， SCN1B， SLC19A2， JPH2， KCNJ12， ANKRD1），肌肉质量维持（FBXO32， TRIM16L， GHR），钙信号传导（FKBP5）和酶功能（COX7A1， PDK4）（图4）。总而言之，这些数据表明，脊髓组织衍生的uMSC代表了一个显示出强大的肌源潜力的区室。
由于uMSC系之间的个体差异可能是由孤立的效率，uMSC区室内的异质性，母亲的年龄以及母亲的健康状况（包括其营养水平）引起的，因此已建立的umSC系之间的增殖速率和肌源电位可能存在差异。然而，尽管表达动力学存在差异，但随着肌源标志物的分阶段表达，肌源性增加的总体趋势得以维持。
补充图S1：脐带血来源的uMSC中的MSC标志物分析。uMSCs显示CD105和造血标志物CD34和CD45的表达。对CD105 + 群体的分析表明，这些细胞中只有一小部分共表达CD90（N = 5）。缩写：uMSCs =来自人类脐带组织的间充质干细胞。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
关键步骤
该方案的一个关键步骤是在无菌条件下收集组织，从递送时间到维持无菌培养物，持续整个繁殖期。在脐带收集过程中，脐带必须不接触任何未灭菌的表面，并在收集到含有补充抗生素的PBS的管中之前用70%乙醇进行外部拭子。重要的是要限制脐带收集和组织处理之间的时间，以进行uMSC分离。如果需要将组织从收集部位运输到实验室，必须注意将组织保持在含抗生素的缓冲液中并将其储存在冰上。
方法的修改和故障排除
该方案中诱导uMSCs肌源分化的关键修饰是用0.01%的1型胶原蛋白和20μg/ mL层粘连蛋白包被培养皿。我们观察到，当粘附条件也受到调节时，在M1培养基存在下uMSCs的肌源性进展增强。使用其他优越的，尽管昂贵的矩阵，如Matrigel，是否会进一步改善该协议，需要测试。单个样品之间产量的变化可能导致某些组织产生较低的细胞计数。在这种情况下，可能更可取地收集更长的>5厘米的脐带组织。在这种情况下，很少有报告使用10厘米的脐带组织来提高uMSC的产量。大多数描述从脐带组织中分离uMSCs的报告都利用细胞外基质降解酶来增加细胞从脐带基质的释放3，5，7，8。包括本报告在内的一些研究使用外植体培养物不断证明细胞活力增加，产量为6，9，10。此外，无需执行细胞分选来纯化细胞群，这通常包含在从脐带血中纯化uMSC中，从而增加了细胞数量和完整性。
方法的局限性
该方法的一个关键限制是从单个脐带组织样品中完全建立uMSC线所需的时间。通常，使用此协议生成每个 uMSC 线路需要 3 周时间。在此之后，需要2周才能完全分化肌源性分化。在检查不同参与者的uMSC分化潜力的大型队列中，这种延长的研究持续时间可能很麻烦，目的是获得有关宫内环境的信息或预测后代器官代谢参数，如身体成分。第二个限制是脐带组织基质内的异质性，其可能具有各种uMSC区室之间的内在表型差异，并且可能导致不同来源之间的分化电位。例如，与CL衍生的uMSCs11相比，来自WJ的uMSCs显示出更低的成骨潜力。因此，这种方法没有描述脐带组织本身内不同区室之间固有的差异。
该方法相对于现有方法的重要性
使用该协议，我们能够从单个脐带组织样品中获得1×104 至1×106 uMSC的细胞计数。这些 uMSC 细胞系可以可靠地用于至少 6-8 次传代的检测。尽管人类典型细胞表型存在很大差异，但在我们来自印度北部的15名女性队列中观察到的uMSCs的平均倍增时间不到2天6。使用掺入5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）对其增殖速率的分析表明，至少80%的细胞在6小时6的时间内经历了S期。此外，来自脐带组织的uMSC也显示出低衰老率，表明这种分离方法的鲁棒性6。我们之前比较了使用该协议的uMSCs中的肌源诱导程度与用于诱导人和小鼠多能干细胞发生肌生成的诱导程度6，12。我们发现，与现有方案相比，该方案是更有效的肌源分化诱导剂。
方法和应用的重要性
成功的细胞和再生疗法取决于细胞的活力和产量，需要大量的早期传代细胞。因此，该方法为临床应用提供了方便的替代方法。本报告中提供的强大肌源分化方案以及在我们的工作中使用该方案对肌源性进展的深入分子表征补充了概括胎儿肌发生的努力，并且可以用作模拟宫内环境和反映产后代谢的模型。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢Ojas Tikoo先生在拍摄和视频制作方面的帮助。我们还感谢GURGRAM Civil Hospital的GARBH-Ini（跨学科高级研究和分娩结果小组-DBT India）工作人员，护士和高级研究官员以及Pallavi Kshetrapal博士在后勤方面的帮助。这项工作得到了印度生物技术部向Suchitra Gopinath提供的赠款的支持（BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018）.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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