Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Fremstilling af mikromønstret chip med kontrolleret tykkelse til kryogen elektronmikroskopi med høj kapacitet

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

En nyudviklet mikromønstret chip med grafenoxidvinduer fremstilles ved anvendelse af mikroelektromekaniske systemteknikker, der muliggør effektiv og høj kapacitet kryogen elektronmikroskopibilleddannelse af forskellige biomolekyler og nanomaterialer.

Abstract

En væsentlig begrænsning for effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse af biomolekyler ved hjælp af kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er vanskeligheden ved at forberede kryo-EM-prøver med kontrolleret istykkelse på nanoskala. Den silicium (Si) -baserede chip, som har et regelmæssigt udvalg af mikrohuller med grafenoxid (GO) vindue mønstret på en tykkelsesstyret siliciumnitrid (SixNy) film, er udviklet ved at anvende mikroelektromekaniske system (MEMS) teknikker. UV-fotolitografi, kemisk dampaflejring, våd og tør ætsning af tyndfilmen og dropstøbning af 2D nanoarkmaterialer blev brugt til masseproduktion af de mikromønstrede chips med GO-vinduer. Dybden af mikrohullerne reguleres for at kontrollere istykkelsen efter behov, afhængigt af størrelsen på prøven til kryo-EM-analyse. Den gunstige affinitet af GO mod biomolekyler koncentrerer biomolekylerne af interesse i mikrohullet under kryo-EM-prøveforberedelse. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer muliggør cryo-EM-billeddannelse med høj kapacitet af forskellige biologiske molekyler såvel som uorganiske nanomaterialer.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er udviklet til at løse den tredimensionelle (3D) struktur af proteiner i deres oprindelige tilstand 1,2,3,4. Teknikken indebærer fastgørelse af proteiner i et tyndt lag (10-100 nm) glasagtig is og erhvervelse af projektionsbilleder af tilfældigt orienterede proteiner ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM), hvor prøven opretholdes ved flydende nitrogentemperatur. Tusinder til millioner af projektionsbilleder erhverves og bruges til at rekonstruere en 3D-struktur af proteinet ved hjælp af beregningsalgoritmer 5,6. For en vellykket analyse med cryo-EM er kryoprøveforberedelsen blevet automatiseret ved at fastfryse det udstyr, der styrer blottingforholdene, fugtigheden og temperaturen. Prøveopløsningen lægges på et TEM-gitter med en hullet carbonmembran, der successivt blottes for at fjerne overskydende opløsning, og derefter dyppes med flydende ethan for at producere tynd glasagtig is 1,5,6. Med fremskridtene inden for cryo-EM og automatiseringen af prøveforberedelse7 er cryo-EM i stigende grad blevet brugt til at løse strukturen af proteiner, herunder kuvertproteiner til vira og ionkanalproteiner i cellemembranen 8,9,10. Strukturen af kuvertproteiner af patogene viruspartikler er vigtig for at forstå virusinfektionspatologi samt udvikle diagnosesystemet og vaccinerne, f.eks. SARS-CoV-211, som forårsagede COVID-19-pandemien. Desuden er cryo-EM-teknikker for nylig blevet anvendt til materialevidenskab, såsom til billeddannelse af strålefølsomme materialer, der anvendes i batteri 12,13,14 og katalytiske systemer14,15 og analyse af uorganiske materialers struktur i opløsningstilstand16.

På trods af mærkbar udvikling inden for cryo-EM og relevante teknikker findes der begrænsninger i kryoprøveforberedelse, hvilket forhindrer 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Forberedelse af en glasagtig isfilm med optimal tykkelse er især vigtig for at opnå 3D-strukturen af biologiske materialer med atomopløsning. Isen skal være tynd nok til at minimere baggrundsstøj fra elektroner spredt af isen og til at forhindre overlapninger af biomolekyler langs elektronstrålevejen 1,17. Men hvis isen er for tynd, kan det få proteinmolekyler til at justere i foretrukne retninger eller denaturere 18,19,20. Derfor bør tykkelsen af glasagtig is optimeres afhængigt af størrelsen af det materiale, der er af interesse. Desuden er der typisk behov for en omfattende indsats for prøveforberedelse og manuel screening af is- og proteinintegritet på de forberedte TEM-net. Denne proces er ekstremt tidskrævende, hvilket hindrer dens effektivitet til 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Derfor vil forbedringer i pålideligheden og reproducerbarheden af kryo-EM-prøveforberedelse forbedre udnyttelsen af cryo-EM i strukturel biologi og kommerciel lægemiddelopdagelse samt til materialevidenskab.

Heri introducerer vi mikrofabrikationsprocesser til fremstilling af en mikromønstret chip med grafenoxid (GO) vinduer designet til cryo-EM med høj kapacitet med kontrolleret istykkelse21. Den mikromønstrede chip blev fremstillet ved hjælp af mikroelektromekaniske systemteknikker (MEMS), som kan manipulere chippens struktur og dimensioner afhængigt af billeddannelsesformålene. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer har en mikrobrøndstruktur, der kan fyldes med prøveopløsningen, og dybden af mikrobrønden kan reguleres for at kontrollere tykkelsen af glaslegemeisen. Den stærke affinitet af GO for biomolekyler forbedrer koncentrationen af biomolekyler til visualisering, hvilket forbedrer effektiviteten af strukturanalysen. Desuden består den mikromønstrede chip af en Si-ramme, som giver høj mekanisk stabilitet for gitteret19, hvilket gør den ideel til håndtering af chippen under prøveforberedelsesprocedurer og cryo-EM-billeddannelse. Derfor giver en mikromønstret chip med GO-vinduer fremstillet af MEMS-teknikker pålidelighed og reproducerbarhed af kryo-EM-prøveforberedelse, som kan muliggøre effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse baseret på cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af mikromønstret chip med GO-vinduer (figur 1)

  1. Aflejr siliciumnitrid.
    1. Aflejring af siliciumnitrid med lav spænding (SixNy) på begge sider af Si-waferen (4 tommer diameter og 100 μm tykkelse) ved hjælp af kemisk dampaflejring ved lavt tryk (LPCVD) ved 830 ° C og et tryk på 150 mTorr under en strøm på 170 sccm dichlorsilan (SiH2Cl2, DCS) og 38 sccm ammoniak (NH3).
    2. Ved hjælp af en aflejringshastighed på ~ 30 Å / min kontrolleres SixNy tykkelsen til at være inden for 25-100 nm ved at variere aflejringstiden.
      BEMÆRK: Der skal udvises ekstrem forsigtighed ved håndtering af Si wafer, fordi waferen er meget tynd og skrøbelig. Pas på ikke at bøje waferen under håndtering eller lastning i udstyret.
  2. Mønster fotoresisten.
    1. Påfør en hexamethyldisilazanopløsning (HMDS) på SixNy-deponeret Si-wafer med tilstrækkelig volumen til at dække hele overfladen af waferen, drej pelsen med en spincoater ved 3.000 o / min i 30 s, og bages ved 95 ° C i 30 s på en kogeplade for at gøre waferoverfladen hydrofob og dermed sikre en god belægningsydelse med fotoresist (PR).
    2. Påfør positiv PR (Table of Materials) med tilstrækkelig volumen til at dække hele overfladen af waferen, drej belægningen ved 3.000 o / min i 30 s, og bages ved 100 ° C i 90 s på en kogeplade. Spin-coated PR har en tykkelse på 500 nm.
    3. Udsæt den PR-belagte wafer med ultraviolet lys (365 nm bølgelængde og 20 mW / cm2 intensitet) i 5 s gennem en krommaske (figur 2A-D) ved hjælp af en aligner.
    4. Udvikl PR'en i 1 minut ved hjælp af en udvikler (Materialetabel) og skyl waferen ved at nedsænke den i deioniseret (DI) vand 2x. Tør den PR-mønstrede wafer helt ved at blæse N2-gas på waferoverfladen.
      BEMÆRK: Der skal udvises ekstrem forsigtighed, når du blæser N2-gas på Si-waferen, fordi waferen er meget tynd og skrøbelig. Blæs ikkeN2-gas med højt tryk i en retning vinkelret på waferen, da dette kan få waferen til at bryde.
  3. Mønster SixNy.
    1. Æts den eksponerede SixNy efter mønsteret af PR ved hjælp af en laboratoriebygget reaktiv ionætser (RIE) med 3 sccm svovlhexafluorid (SF6) gas ved en radiofrekvens (RF) effekt på 50 W. Ætsningshastigheden med disse indstillinger er ~ 6 Å / s. Indstil ætsningstiden afhængigt af tykkelsen af det aflejrede SixNy-lag .
      BEMÆRK: Ætsningshastigheden kan variere og kræver optimering i laboratoriet afhængigt af specifikationerne for det anvendte RIE-udstyr.
    2. Eliminer PR ved at nedsænke SixNy mønstret wafer i acetone ved stuetemperatur i 30 minutter, efterfulgt af skylning af waferen ved at nedsænke den i DI-vand 2x. Tør waferen helt ved at blæseN2-gas på waferoverfladen.
      BEMÆRK: Der skal udvises ekstrem forsigtighed, når du nedsænker eller tager waferen ud af opløsningerne, fordi waferen kan brydes af opløsningens overfladespænding. Waferen må ikke nedsænkes eller tages ud parallelt med opløsningens overflade. Brug præcision wafer håndtering pincet med kulfiber tips. Tag ikke stærkt fat i waferen med pincetten; løft den ene side af waferen, indtil waferen vipper til en vinkel, hvor den kan tages ud af opløsningen. Waferen kan knække, når den bøjes på grund af det faste greb under løft.
  4. Æts Si.
    1. Der fremstilles en 1,5 M kaliumhydroxidopløsning (KOH) ved at opløse KOH-pulveret i DI-vand ved 80 °C.
    2. Nedsænk SixNy mønstret wafer i KOH-opløsning for at ætse den udsatte Si. Lad waferen være i opløsningen under omrøring, indtil de fritstående SixNy vinduer kan observeres på den modsatte side af den mønstrede SixNy.
      BEMÆRK: Den våde ætsningstid kan variere afhængigt af tykkelsen af Si; for en 100 μm tyk wafer tager våd ætsning normalt flere timer. Indstil ikke omrøringshastigheden for højt under Si-ætsning, da de fritstående SixNy-vinduer er meget tynde og kan brydes af væskestrømmen. I dette eksperiment blev omrøringshastigheden indstillet til 250 o / min.
    3. Rengør den ætsede wafer ved at dyppe den flere gange i et DI-vandbad for at fjerne ætsningsrester. Tør waferen i luften.
      BEMÆRK: Der skal udvises ekstrem forsigtighed, når du nedsænker eller tager Si-mønstret wafer ud af opløsningerne, fordi de fritstående SixNy-vinduer er meget tynde og skrøbelige og kan brydes af opløsningens overfladespænding. Waferen skal nedsænkes eller tages ud i en vinkel, således at kanten af waferen først går ind og ud af opløsningen.
  5. Eliminer KOH-ætsningsresterne.
    1. Tryk let på grænserne for chiparrayet med en pincet for at opnå en række chips, der vil være mikromønstret (figur 1B).
    2. 1,5 M KOH-opløsning fremstilles ved 80 °C under omrøring.
    3. Spånarrayet nedsænkes i KOH-opløsning i 30 s og skylles ved at dyppe det i DI-vand 2x. Tør chipsene helt ved at blæseN2-gas .
      BEMÆRK: Der skal udvises ekstrem forsigtighed, mens du dypper chipsene i opløsninger og føntørrer dem med N2-gas , fordi de fritstående SixNy-vinduer er meget tynde og skrøbelige. Mens chippen er nedsænket i KOH-opløsning, skal omrøring stoppes. Chipsene skal dyppes med deres kanter først i retningen vinkelret på opløsningen og blæses medN2-gas i parallel retning.
    4. Tør chiparrayet helt i luften i mindst 1 time.
  6. Mønster PR.
    1. Forbered en tom 525 μm Si wafer som fast støtte. Drej siskiven med HMDS og positiv PR, som beskrevet ovenfor, men fastgør chiparrayet (med den fritstående SixNy vinduesside opad) på Si-waferen, inden du bager PR. PR fungerer som et klæbemiddel mellem waferen og chiparrayet. Bag Si-waferen fastgjort med chiparrayet ved 100 ° C i 90 s på en kogeplade.
    2. Spin coat chipsættet med HMDS og positiv PR, som beskrevet ovenfor.
    3. Udsæt chipsættet med ultraviolet lys (365 nm bølgelængde; 20 mW /cm2 intensitet) i 5 s gennem en krommaske (figur 2E, F) ved hjælp af en aligner.
    4. Udvikl PR'en ved hjælp af en udvikler i 15 s, skyl chipsættet ved at dyppe det i DI-vand 2x, og tør det PR-mønstrede chipsæt helt ved at blæse N2-gas .
  7. Forbered den mikromønstrede SixNy.
    1. Etch SixNy efter PR-mønsteret ved hjælp af en laboratoriebygget RIE med 3 sccm SF6 gas ved RF-effekt på 50 W. Kontroller ætsningstiden afhængigt af tykkelsen af SixNy-laget .
  8. Fjern PR.
    1. Eliminer PR ved at nedsænke den mønstrede chipsæt i 1-methyl-2-pyrrolidinon (NMP) opløsning ved 60 ° C og lade den stå natten over. Skyl chipsættet ved at dyppe det i DI-vand 2x, og tør det mønstrede chipsæt helt ved at blæse N2-gas .
    2. Eliminer PR-resterne med en O2 plasmaproces ved hjælp af 100 sccm O2 gas ved RF-effekt på 150 W i 1 min med den laboratoriebyggede RIE.
  9. Skyl den mikromønstrede chip.
    1. 1,5 M KOH-opløsning fremstilles ved 80 °C.
    2. Nedsænk de mikromønstrede chips i KOH-opløsning i 30 s for helt at eliminere PR-resterne og skyl chipsene ved at nedsænke dem i DI-vand 2x. Tør chipsene helt ved at blæseN2-gas .
    3. Tør chipsene i luften helt i mindst 1 time.
  10. Overfør grafenoxid (GO) ved dråbestøbningsmetoden.
    1. Fortynd GO-opløsning (2 mg / ml) til 0,2 mg / l med DI-vand og sonikat i 10 minutter for at nedbryde aggregater af GO-ark. Centrifuger den fortyndede GO-opløsning ved 300 x g i 30 s.
    2. Glød aflade den si-ætsede side af den mikromønstrede chip for at gengive spånoverfladen med positiv ladning ved hjælp af en glødeudladning (Materialetabel) ved 15 mA i 1 min.
    3. Slip 3 μL af GO-opløsningen på den glødeafladede side af den mikromønstrede chip, og lad dråben stå på chippen i 1 minut. Efter 1 min tørres den overskydende GO-opløsning væk på chippen med filterpapir.
    4. Vask den GO-overførte chip med DI-vanddråber fremstillet på paraffinfilm, og fjern DI-vandet på chippen med filterpapir. Gentag denne procedure 2x på GO-overført side og 1x på den modsatte side. Tør den GO-overførte chip ved stuetemperatur natten over.
    5. Vask den mikromønstrede chip med GO-vinduer ved at nedsænke den i DI-vandet og føntørre chippen med N2-gas .

2. Cryo-EM-billeddannelse

  1. Forbered kryoprøven.
    1. Forbered kryoprøven ved hjælp af en mekanisk kryo-kastemaskine (Table of Materials), som styrer temperatur, fugtighed, blottingtid og kraft. Når du har lagt blottingpuden på blotterne, skal du sikre dig, at fugtigheden og temperaturen i kammeret holdes på henholdsvis 100% og 15 °C.
    2. Tag den mikromønstrede chip op med en typisk kryo-pincet, og læg pincetten på kryo-kastemaskinen. Rør 3 μL prøveopløsning på den mikromønstrede chip på den hulmønstrede side med GO-vinduer i bunden. Kontroller blottingtid og kraft afhængigt af prøveopløsningen.
      BEMÆRK: Her blev biologiske prøver, nemlig human immundefektvirus (HIV-1), ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartikler og tau filamentproteiner anvendt til kryo-EM-billeddannelse. Derudover blev forskellige typer uorganiske materialer, såsom Fe2O3 nanopartikler (NP), Au nanopartikler, Au nanoroder og silica nanopartikler, brugt til cryo-EM billeddannelse. Den ønskede blottingtid og kraft blev indstillet på cryo-stemplet til forskellige typer prøver.
    3. Efter blottingprocessen skal du straks nedfryse den prøvebelastede chip i flydende ethan. Overfør chippen til gitterboksen i flydende nitrogen (LN2), og opbevar den i LN2 før kryo-EM-billeddannelse.
  2. Udfør cryo-EM-billeddannelse.
    1. Cryo-prøven hældes i en cryo-EM-holder med temperaturen fastholdt på -180 °C.
    2. Læg kryo-EM-holderen i en TEM, og overhold prøverne med tilstanden minimumdosissystem (MDS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En mikromønstret chip med GO-vinduer blev fremstillet af MEMS-fabrikation og 2D GO nanoarkoverførsel. Chips til mikromønstre blev masseproduceret, med ca. 500 chips fremstillet af en 4 i wafer (figur 1B og figur 2A, B). Designet af de mikromønstrede chips kan manipuleres ved hjælp af forskellige designs af krommasken (figur 2) under fotolitografiproceduren. De fremstillede mikromønstrede chips havde kontrollerede antal og dimensioner af fritstående SixNy-membraner. Antallet af fritstående SixNy-membraner blev styret fra 48 (6 x 8) til 50 (5 x 10) og dimensionerne fra 50 x 40 μm2 til 250 x 40 μm2 (figur 3A, B, F, G). Hver fritstående SixNy-membran kan have titusinder til hundredvis af mikrohuller med tilpassede diametre, der spænder fra 2-3 μm med forskellig hulafstand. Fabrikerede mikromønstrede chips har op til ~ 25.000 GO-suspenderede huller, mens antallet af hullerne også kan styres (figur 3B-D og figur 3G-I). Eksistensen af det tynde GO-lag over hullet blev bekræftet af Raman-spektroskopi og elektrondiffraktion. Raman-spektret ved GO-vinduet viste repræsentative toppe af GO, nemlig D- og G-bånd på henholdsvis 1360 cm-1 og 1590 cm-1, henholdsvis22 (figur 3E). De multiplikationsorienterede sekskantede diffraktionsmønstre indikerer, at vinduerne består af flerlags GO (figur 3J).

Den mikromønstrede chip med GO-vinduer blev fremstillet i tre repræsentative måldybder (25 nm, 50 nm og 100 nm) ved at kontrollere aflejringstykkelsen af SixNy på Si-waferen under LPCVD-processen for at bekræfte muligheden for at regulere dybden af mikrohullerne. For at evaluere strukturen og tykkelsen af mikrohullerne med GO-vinduer blev der opnået 40 ° vippede og tværsnitsscanningselektronmikroskop (SEM) og atomkraftmikroskopi (AFM) billeder af den mikromønstrede chip med GO-vinduer. Mikrohullets veltypestruktur med et GO-vindue blev tydeligt observeret, idet dybden af mikrohullet svarede til den målrettede dybde (figur 4). Resultaterne bekræfter, at det er muligt at kontrollere antallet og designet af den mikromønstrede chip med GO-vinduer.

For at demonstrere brugen af den mikromønstrede chip til kryo-EM-billeddannelse blev forskellige kryoprøver af biomolekyler og uorganiske NP'er fremstillet ved hjælp af den mikromønstrede chip. For biologiske prøver blev HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartikler og tau filamentproteiner afbildet med cryo-EM ved hjælp af den mikromønstrede chip med GO-vinduer (figur 5A-F). Udover biomolekyler blev uorganiske materialer såsom Fe2 O3NP'er, Au NP'er, Au nanoroder og silica NP'er også observeret af cryo-EM ved hjælp af mikromønstrede chips (figur 5G-J).

Figure 1
Figur 1: Skemaer og billeder af fabrikationsproceduren for den nyudviklede mikromønstrede chip med GO-vinduer til cryo-EM. (A) Skemaer over fremstillingsprocessen og tværsnit af den mikromønstrede chip med GO-vinduer under fremstillingsprocessen. (B) Billeder af fremstillingsprodukterne på hvert fabrikationstrin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kort illustration af de krommasker, der anvendes til fotolitografiprocessen. (A, B) Maskedesign til masseproduktion af chips til en 4 i Si wafer (24 x 24 array af chips), (C, D) design af 2 x 2 array chips og (E, F) design af mikrohulmønstre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Struktur af de mikromønstrede chips med GO-vinduer. (A,F) Optiske mikroskopibilleder af hele mikromønstrede chips, (B,G) SEM-billeder af enkelte mikromønstrede SixNy-membraner , (C,H) SEM-billeder af mikromønstre og (D,I) SEM-billeder af enkelte mikrohuller med GO-vinduer. (E,J) Bekræftelse af GO ved mikrohullet gennem (E) Raman-spektret og (J) det valgte områdeelektrondiffraktionsmønster (SAED) i GO-vinduet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Mikrohullets brøndstruktur og dybde med GO-vinduer. (A-C) 40° vippede SEM-billeder af et enkelt mikrohul med et GO-vindue og (D-F) tværsnits-SEM-billede af den mikromønstrede chip med GO-vinduer i forskellige dybder (25 nm, 50 nm og 100 nm). (G) Atomic force microscopy (AFM) 3D rendering image, (H) AFM deflection image og (I) linjeprofil langs den røde linje i (H), der viser dybden af den mikromønstrede chip med GO vinduer fremstillet med 100 nm SixNy membran. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Cryo-EM-billeder af biomaterialer af forskellig størrelse og uorganiske nanomaterialer, der anvender den mikromønstrede chip med GO-vinduer. (A) HIV-1-viruspartikel, (B) ferritin, (C) proteasom 26S, (D) groEL, (E) apoferritin, (F) tau-protein (pile, der angiver fibrilleret tau-protein), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod og (J) silica NP. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofabrikationsprocesserne til fremstilling af mikromønstrede chips med GO-vinduer introduceres her. Den fremstillede mikromønstrede chip er designet til at regulere tykkelsen af det glasagtige islag ved at kontrollere dybden af mikrohullet med GO-vinduer afhængigt af størrelsen på det materiale, der skal analyseres. En mikromønstret chip med GO-vinduer blev fremstillet ved hjælp af en række MEMS-teknikker og en 2D nanoarkoverførselsmetode (figur 1). Den største fordel ved at bruge MEMS-fremstillingsteknikken er dens evne til masseproduktion og muligheden for at manipulere mikrochipets struktur og dimensioner ved at bruge forskellige designs af krommasken under fotolitografi (figur 2). Det LPCVD-deponerede SixNy-lag med lav belastning sikrer stabiliteten af de titusinder af nanometer tykke fritstående SixNy 23,24,25,26. Imidlertid er det fritstående SixNy-lag i nanometerskala stadig sårbart over for kræfter i vinkelret retning27. Derfor er ekstrem forsigtighed nødvendig under håndtering af den mikromønstrede chip, såsom ved dypning i opløsning eller føntørring. Derudover bruger fremstillingsprocessen for den mikromønstrede chip 100 μm Si-waferen, som sikrer kompatibilitet med de fleste cryo-EM-prøveholdere og autoloadere. Der er dog behov for forsigtighed under fremstillingsprocesserne for at forhindre, at den skrøbelige wafer brister.

Mikronskalaens regelmæssige udvalg af brøndtypestrukturer med GO-vinduer blev bekræftet med et optisk mikroskop og en SEM (figur 3 og figur 4). Desuden muliggør dropstøbningsmetoden til overførsel af GO GO-aflejring med høj fladhed og uden mærkbare rynker (figur 3D, E, I, J). Den mikromønstrede chip er velegnet til indlæsning i cryo-EM autoloaderen, og titusinder af mikron-skala huller i et almindeligt array tillader automatiseret indsamling af store billeddata til enkeltpartikelanalyse. Desuden kan antallet og morfologien af SixNy-membraner og GO-understøttede mikrohuller let manipuleres i MEMS-fabrikationsprocessen, hvilket giver mulighed for enkeltpartikelanalyse med høj kapacitet og andre cryo-EM-billeddannelseseksperimenter afhængigt af forskningsformålene. Desuden kan udvidede anvendelser af mikromønstrede chips med kontrolleret tykkelse lettes ved fremstilling af chips, der har huller mønstret på nanometerskalaen. Nanomønstre, der er udviklet i halvlederindustrien, kan anvendes til fremstilling af disse chips 28,29,30.

Evnen til at regulere dybden af mikrohullerne er her blevet demonstreret ved at fremstille mikromønstrede chips med GO-vinduer i tre repræsentative måldybder: 25 nm, 50 nm og 100 nm. Forskellige dybder af mikrobrøndstrukturen blev opnået ved at kontrollere aflejringstiden for SixNy-laget på Si-waferen (figur 4). Til evaluering af morfologien og tykkelsen af den mikromønstrede chip med GO-vinduer blev tværsnit af enhederne opnået fra fokuseret ionstråle (FIB) sektionering observeret med SEM, og dybdeprofilen blev målt med AFM (figur 4). Mikrohullets brøndstruktur med GO-vindue blev tydeligt vist på SEM- og AFM-billederne, hvilket bekræfter en vellykket kontrol af dybden af SixN y-mikrohullet og overførsel af GO-vinduet. Brugen af den tilpassede mikromønstrede chip med GO-vinduer vil sandsynligvis sikre en høj succesrate i produktionen af områder med optimal istykkelse til cryo-EM-billeddannelse.

Da de materialer, der skal observeres med cryo-EM, har forskellige størrelser, kan fremstilling af glasagtig is med en passende tykkelse sikre forbedret kontrastopløsning, en bred orienteringsdækning og reduceret denaturering af strukturen under cryo-EM-billeddannelse. For at demonstrere brugen af cryo-EM-billeddannelsesprocessen til biologiske anvendelser blev forskellige biologiske prøver af forskellig størrelse, herunder HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritin og tau-protein, afbildet ved hjælp af den mikromønstrede chip med GO-vinduer. Biomolekylerne blev tydeligt observeret ved hjælp af den mikromønstrede chip med GO-vinduer (figur 5A-F). Udover biomolekyler blev der også observeret forskellige typer uorganiske nanomaterialer, såsom Fe2O3 NP'er, Au NP'er, Au nanoroder og silica NP'er, ved hjælp af den mikromønstrede chip med GO-vinduer (figur 5G-J). Den mikromønstrede chip og fabrikationsmetode viser kompatibilitet til kryo-billeddannelse af forskellige materialer. Således giver den nyudviklede mikromønstrede chip med GO-vinduer en pålidelig og reproducerbar prøveforberedelsesstrategi til effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse med cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra Institut for Grundvidenskab (bevillingsnr. IBS-R006-D1). S.K., M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra Creative-Pioneering Researchers Program gennem Seoul National University (2021) og NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1A2C2101871 og NRF-2021M3A9I4022936). M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra POSCO Science Fellowship fra POSCO TJ Park Foundation og NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. anerkender den økonomiske støtte fra NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1A6C101A183) og de tværfaglige forskningsinitiativer programmer fra College of Engineering og College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. anerkender den økonomiske støtte fra NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Forfatterne takker personalet og besætningen på Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) for deres utrættelige indsats og udholdenhed med cryo-EM-eksperimenterne. Forfatterne takker S. J. Kim fra National Center for Inter-university Research Facilities for hjælp med FIB-SEM-eksperimenterne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Ingeniørarbejde udgave 182 kryogen-elektronmikroskop mikroelektromekaniske systemer grafenoxid glasagtig istykkelse virus protein nanomaterialer
Fremstilling af mikromønstret chip med kontrolleret tykkelse til kryogen elektronmikroskopi med høj kapacitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter