Summary
Недавно разработанный микроструктурированный чип с окнами оксида графена изготовлен с применением методов микроэлектромеханической системы, что позволяет эффективно и высокопроизводительно криогенную электронную микроскопию визуализировать различные биомолекулы и наноматериалы.
Abstract
Основным ограничением для эффективного и высокопроизводительного структурного анализа биомолекул с использованием криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) является сложность подготовки крио-ЭМ образцов с контролируемой толщиной льда на наноуровне. Микросхема на основе кремния (Si), которая имеет регулярный массив микроотверстей с окном оксида графена (GO), узорчатым на пленке нитрида кремния с контролируемой толщиной (SixNy), была разработана с применением методов микроэлектромеханической системы (MEMS). УФ-фотолитография, химическое осаждение из паровой фазы, мокрое и сухое травление тонкой пленки, капельное литье 2D нанолистовых материалов использовались для массового производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Глубина микроотверстей регулируется для контроля толщины льда по требованию, в зависимости от размера образца для крио-ЭМ-анализа. Благоприятное сродство GO к биомолекулам концентрирует биомолекулы, представляющие интерес, в микро-отверстии во время крио-ЭМ пробоподготовки. Микроструктурированный чип с окнами GO обеспечивает высокопроизводительную крио-ЭМ визуализацию различных биологических молекул, а также неорганических наноматериалов.
Introduction
Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) была разработана для разрешения трехмерной (3D) структуры белков в их родном состоянии 1,2,3,4. Метод включает фиксацию белков в тонком слое (10-100 нм) стекловидного льда и получение проекционных изображений случайно ориентированных белков с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ), при этом образец поддерживается при температуре жидкого азота. Тысячи и миллионы проекционных изображений получены и использованы для реконструкции 3D-структуры белка с помощью вычислительных алгоритмов 5,6. Для успешного анализа с помощью крио-ЭМ криоподготовка образцов была автоматизирована путем погружной заморозки оборудования, которое контролирует условия блоттинга, влажность и температуру. Образец раствора загружают на сетку ТЭМ с дырявой углеродной мембраной, последовательно промокают для удаления избытка раствора, а затем погружают-замораживают жидким этаном для получения тонкого стекловидного льда 1,5,6. С достижениями в области крио-ЭМ и автоматизации пробоподготовки7 крио-ЭМ все чаще используется для решения структуры белков, включая белки оболочки для вирусов и белки ионных каналов в клеточной мембране 8,9,10. Структура белков оболочки патогенных вирусных частиц важна для понимания патологии вирусной инфекции, а также разработки системы диагностики и вакцин, например, SARS-CoV-211, вызвавшего пандемию COVID-19. Кроме того, крио-ЭМ методы недавно были применены в материаловедении, например, для визуализации чувствительных к пучку материалов, используемых в батареях 12,13,14 и каталитических системах 14,15, и анализа структуры неорганических материалов в состоянии раствора16.
Несмотря на заметные изменения в крио-ЭМ и соответствующих методах, существуют ограничения в крио-пробоподготовке, препятствующие высокопроизводительному 3D-анализу структуры. Получение стекловидной ледяной пленки с оптимальной толщиной особенно важно для получения 3D-структуры биологических материалов с атомным разрешением. Лед должен быть достаточно тонким, чтобы минимизировать фоновый шум от электронов, рассеянных льдом, и запретить перекрытие биомолекул вдоль траектории электронного пучка 1,17. Однако, если лед слишком тонкий, это может привести к тому, что белковые молекулы выровняются в предпочтительных ориентациях или денатурируют 18,19,20. Поэтому толщина стекловидного льда должна быть оптимизирована в зависимости от размера интересующего материала. Кроме того, обычно требуются значительные усилия для подготовки образцов и ручного скрининга целостности льда и белка на подготовленных сетках ТЕА. Этот процесс чрезвычайно трудоемкий, что снижает его эффективность для высокопроизводительного анализа 3D-структур. Таким образом, повышение надежности и воспроизводимости крио-ЭМ пробоподготовки улучшит использование крио-ЭМ в структурной биологии и коммерческом открытии лекарств, а также в материаловедении.
Здесь мы вводим процессы микрофабрикации для изготовления микроструктурированного чипа с окнами оксида графена (GO), предназначенного для высокопроизводительной крио-ЭМ с контролируемой толщиной льда21. Микроструктурный чип был изготовлен с использованием методов микроэлектромеханической системы (MEMS), которые могут манипулировать структурой и размерами чипа в зависимости от целей визуализации. Микроструктурированный чип с окнами GO имеет структуру микролунки, которая может быть заполнена раствором образца, а глубина микролунки может регулироваться для контроля толщины стекловидного льда. Сильное сродство GO к биомолекулам повышает концентрацию биомолекул для визуализации, повышая эффективность структурного анализа. Кроме того, микроструктурированный чип состоит из Si-кадра, который обеспечивает высокую механическую стабильность сетки19, что делает его идеальным для обработки чипа во время процедур подготовки образцов и крио-ЭМ визуализации. Таким образом, микроструктурированный чип с окнами GO, изготовленными по методам MEMS, обеспечивает надежность и воспроизводимость крио-ЭМ пробоподготовки, что может обеспечить эффективный и высокопроизводительный анализ структуры на основе крио-ЭМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 1)
- Нанесите нитрид кремния.
- Нанесите низконапряженный нитрид кремния (SixNy) на обе стороны кремниевой пластины (диаметр 4 дюйма и толщина 100 мкм) с использованием химического осаждения из паровой фазы низкого давления (LPCVD) при 830 °C и давлении 150 мТорр, под потоком 170 sccm дихлорсилана (SiH2Cl2, DCS) и 38 sccm аммиака (NH3).
- Используя скорость осаждения ~30 Å/мин, контролируйте толщину SixNy в пределах 25-100 нм, изменяя время осаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с кремниевой пластиной следует проявлять крайнюю осторожность, потому что пластина очень тонкая и хрупкая. Следите за тем, чтобы не согнуть пластину во время ее обработки или загрузки в оборудование.
- Рисунок фоторезиста.
- Нанесите раствор гексаметилдисилазана (HMDS) на sixNy-осажденную кремниевую пластину с достаточным объемом, чтобы покрыть всю поверхность пластины, отжимное покрытие со спин-коатером при 3000 об/мин в течение 30 с и выпекать при 95°C в течение 30 с на горячей плите, чтобы сделать поверхность пластины гидрофобной и, таким образом, обеспечить хорошую производительность покрытия с фоторезистом (PR).
- Нанесите положительный PR (Таблица материалов) с достаточным объемом, чтобы покрыть всю поверхность пластины, открутите покрытие со скоростью 3000 об/мин в течение 30 с и выпекайте при 100 °C в течение 90 с на конфорке. Спин-покрытие PR имеет толщину 500 нм.
- Экспонируйте пластину с PR-покрытием ультрафиолетовым светом (длина волны 365 нм и интенсивность 20 мВт/см2) в течение 5 с через хромовую маску (рисунок 2A-D) с помощью элайнера.
- Разработайте PR на 1 мин с помощью разработчика (Таблица материалов) и промойте пластину, погрузив ее в деионизированную (DI) воду 2x. Полностью высушите пластину с PR-узором, выдувая газ N2 на поверхность пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при надавливании газаN2 на пластину Si, потому что пластина очень тонкая и хрупкая. Не выдувайте газN2 с высоким давлением в направлении, перпендикулярном пластине, так как это может привести к разрушению пластины.
- Шаблон SixNy.
- Травите экспонированный SixNy по схеме PR с помощью лабораторного реакционноспособного ионного травильного устройства (RIE) с газом гексафторида серы (SF6) 3 sccm при радиочастотной (RF) мощности 50 Вт. Скорость травления с этими настройками составляет ~6 Å/s. Установите время травления в зависимости от толщины нанесенного слоя SixNy .
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость травления может варьироваться и нуждаться в лабораторной оптимизации в зависимости от спецификаций используемого оборудования RIE. - Устраните PR, погрузив пластину с узором SixNy в ацетон комнатной температуры на 30 минут с последующим ополаскиванием пластины, погружая ее в воду DI 2x. Полностью высушите пластину, выдув газ N2 на поверхность пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении или извлечении пластины из растворов, поскольку пластина может быть разрушена поверхностным натяжением раствора. Не погружайте и не вынимайте пластину параллельно поверхности раствора. Используйте прецизионные пинцеты для обработки пластин с наконечниками из углеродного волокна. Не сильно хватайте пластину пинцетом; поднимите одну сторону пластины до тех пор, пока пластина не наклонится под углом, где ее можно вынуть из раствора. Пластина может сломаться, когда она сгибается из-за твердого захвата во время подъема.
- Травите экспонированный SixNy по схеме PR с помощью лабораторного реакционноспособного ионного травильного устройства (RIE) с газом гексафторида серы (SF6) 3 sccm при радиочастотной (RF) мощности 50 Вт. Скорость травления с этими настройками составляет ~6 Å/s. Установите время травления в зависимости от толщины нанесенного слоя SixNy .
- Выгравируйте Si.
- Приготовьте 1,5 М раствора гидроксида калия (KOH), растворив порошок KOH в воде DI при 80 °C.
- Погрузите пластину с узором SixNy в раствор KOH для травления открытого Si. Оставьте пластину в растворе с перемешиванием до тех пор, пока отдельно стоящие окна SixNy не будут наблюдаться на противоположной стороне узорчатого SixNy.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время влажного травления может отличаться в зависимости от толщины Si; для пластины толщиной 100 мкм влажное травление обычно занимает несколько часов. Не устанавливайте слишком высокую скорость перемешивания во время травления Si, потому что отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и могут быть разрушены потоком жидкости. В этом эксперименте скорость перемешивания была установлена на 250 об/мин. - Очистите травленую пластину, окунув ее несколько раз в водяную баню DI, чтобы устранить остатки травления. Высушите пластину на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении или извлечении кремниевой узорчатой пластины из растворов, поскольку отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и хрупкие и могут быть разрушены поверхностным натяжением раствора. Пластину следует погружать или вынимать под углом, чтобы край пластины входил и выходил из раствора первым.
- Удалите остатки травления KOH.
- Слегка нажмите на границы массива микросхем пинцетом, чтобы получить массив чипов, которые будут микроструктурированными (рисунок 1B).
- Приготовьте 1,5 М КОН раствора при 80 °C с перемешиванием.
- Погрузите массив микросхем в раствор KOH на 30 с и промойте его, окунув в воду DI 2x. Полностью высушите стружку путем выдувания газа N2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении стружки в растворы и сушке их феном с помощью газа N2, потому что отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и хрупкие. Пока чип погружен в раствор KOH, перемешивание следует прекратить. Стружку следует опускать своими краями сначала в направлении, перпендикулярном раствору, и продувать газомN2 в параллельном направлении. - Полностью высушите массив микросхем в воздухе в течение не менее 1 ч.
- Шаблон PR.
- Подготовьте пустую пластину Si 525 мкм в качестве твердой подложки. Spin покройте Кремниевую пластину шлемами и положительным PR, как описано выше, но прикрепите массив чипов (с отдельно стоящей стороной окна SixNy вверх) на пластину Si перед выпечкой PR. PR действует как клей между пластиной и массивом чипов. Выпекайте Кремниевую пластину, прикрепленную к массиву микросхем, при 100 °C в течение 90 с на конфорке.
- Спин-покрытие чипсета HMDS и положительным PR, как описано выше.
- Экспонируйте чипсет ультрафиолетовым светом (длина волны 365 нм; интенсивность 20 мВт/см2) в течение 5 с через хромовую маску (рисунок 2E,F) с помощью элайнера.
- Разработайте PR с использованием разработчика в течение 15 с, промойте чипсет, окунув его в воду DI 2x, и полностью высушите чипсет с шаблоном PR, выдувая газ N2 .
- Подготовьте микроструктурированный SixNy.
- Травление SixNy по шаблону PR с использованием лабораторного RIE, с 3 sccm SF6 газа при мощности RF 50 Вт. Контролируйте время травления в зависимости от толщины слоя SixNy .
- Исключите PR.
- Устраните PR, погрузив набор микросхем с узорчатым рисунком в раствор 1-метил-2-пирролидинона (NMP) при 60 °C и оставив его на ночь. Промойте чипсет, окунув его в воду DI 2x, и полностью высушите узорчатый чипсет путем выдувания газа N2 .
- Устраните остатки PR с помощью плазменного процесса O2 с использованием газа 100 sccm O2 при мощности ВЧ 150 Вт в течение 1 мин с помощью лабораторного RIE.
- Промойте микроструктурированный чип.
- Готовят 1,5 М КОН раствора при 80 °C.
- Погрузите микроструктурированные чипы в раствор KOH на 30 с, чтобы полностью устранить остатки PR и промыть чипы, погружая их в воду DI 2x. Полностью высушите стружку путем выдувания газа N2 .
- Полностью высушите стружку на воздухе не менее 1 ч.
- Перенос оксида графена (GO) методом капельного литья.
- Разбавляйте раствор ГО (2 мг/мл) до 0,2 мг/л водой DI и ультразвуком в течение 10 мин для расщепления агрегатов листов ГО. Центрифугировать разбавленный раствор ГО при 300 х г в течение 30 с.
- Тлеющий разряд Si-травленой стороны микроструктурированного чипа для визуализации поверхности чипа с положительным зарядом с помощью тлеющего разряда (Таблица материалов) при 15 мА в течение 1 мин.
- Опустите 3 мкл раствора GO на светящуюся разряженную сторону микроструктурированного чипа и оставьте каплю на чипе в течение 1 минуты. Через 1 мин смойте лишний раствор GO на чипе фильтровальной бумагой.
- Промыть чип, перенесенный GO, каплями воды DI, приготовленными на парафиновой пленке, и смыть воду DI на чипе фильтровальной бумагой. Повторите эту процедуру 2x на передаваемой стороне GO и 1x на противоположной стороне. Высушите ГО-переносной стружки при комнатной температуре в течение ночи.
- Вымойте микроструктурированный чип с помощью окон GO, погрузив его в воду DI, и высушите чип газом N2 .
2. Крио-ЭМ визуализация
- Подготовьте криоблик.
- Подготовьте криообразец с помощью механической криокоотопляющей машины (Таблица материалов), которая контролирует температуру, влажность, время промокания и силу. После загрузки прокладки на блоттеры убедитесь, что влажность и температура в камере поддерживаются на уровне 100% и 15 °C соответственно.
- Возьмите микроструктурированный чип с типичным крио-пинцетом и загрузите пинцет в крио-погружную машину. Пипетируйте 3 мкл раствора образца на микроструктурированный чип со стороны с рисунком отверстия, с окнами GO внизу. Контролируйте время и силу промокания в зависимости от образца раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для крио-ЭМ визуализации использовались биологические образцы, а именно вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ферритин, протеасома 26S, groEL, частицы белка апоферритина и белки тау-нитей. Кроме того, различные типы неорганических материалов, такие как наночастицы Fe2O3 (NP), наночастицы Au, наностержни Au и наночастицы кремнезема, использовались для крио-ЭМ визуализации. Нужное время и сила промокания были установлены на криокливне для различных типов образцов. - После процесса промокания немедленно заморозьте чип, загруженный образцом, в жидком этане. Перенесите чип в сетку в жидком азоте (LN2) и сохраните его в LN2 перед крио-ЭМ-визуализацией.
- Проводите крио-ЭМ визуализацию.
- Загрузите криообразец в крио-ЭМ-держатель с температурой-180 °C.
- Загрузите держатель крио-ЭМ в ТЕА и наблюдайте за образцами в режиме системы минимальной дозы (MDS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен путем изготовления MEMS и передачи нанолиста 2D GO. Чипы для микроструктурирования производились серийно, причем около 500 чипов производились из одной пластины 4 (рисунок 1B и рисунок 2A, B). Конструкциями микроструктурированных чипов можно манипулировать, используя различные конструкции хромовой маски (рисунок 2) во время процедуры фотолитографии. Изготовленные микроструктурированные чипы имели контролируемые числа и размеры отдельно стоящих мембран SixNy. Количество отдельно стоящих мембран SixNy контролировалось от 48 (6 x 8) до 50 (5 x 10) и размеры от 50 x 40мкм2 до 250 x 40мкм2 (рисунок 3A,B,F,G). Каждая отдельно стоящая мембрана SixNy может иметь от десятков до сотен микроотверстик с настраиваемыми диаметрами от 2 до 3 мкм с различным расстоянием между отверстиями. Изготовленные микроструктурированные чипы имеют до ~ 25 000 GO-подвесных отверстий, в то время как количество отверстий также контролируется (рисунок 3B-D и рисунок 3G-I). Существование тонкого слоя GO через дырку было подтверждено рамановской спектроскопией и электронной дифраксией. Рамановский спектр в окне GO показал репрезентативные пики GO, а именно диапазоны D и G при 1360 см-1 и 1590 см-1 соответственно22 (рисунок 3E). Многократно ориентированные гексагональные дифракционные паттерны указывают на то, что окна состоят из многослойного GO (рисунок 3J).
Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен на трех репрезентативных целевых глубинах (25 нм, 50 нм и 100 нм) путем контроля толщины осаждения SixNy на кремниевой пластине во время процесса LPCVD для подтверждения возможности регулирования глубины микроотверсов. Для оценки структуры и толщины микроотвершин с окнами GO были получены изображения 40°-наклонного и поперечного сканирующего электронного микроскопа (SEM) и атомно-силовой микроскопии (AFM) микроструктурного чипа с окнами GO. Отчетливо наблюдалась структура микроотверлия с окном GO, причем глубина микроотверливания соответствовала заданной глубине (рис. 4). Результаты подтверждают, что управление количеством и конструкцией микрошайкового чипа с окнами GO возможно.
Чтобы продемонстрировать использование микроструктурированного чипа для криоЭМ-визуализации, с использованием микроструктурированного чипа были подготовлены различные криоблики биомолекул и неорганических NP. Для биологических образцов ВИЧ-1, ферритин, протеасома 26S, groEL, частицы белка апоферритина и белки тау-нитей были визуализированы с помощью крио-ЭМ с использованием микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 5A-F). Помимо биомолекул, неорганические материалы, такие как Fe2O3 NP, Au NPs, Наностержни Au и кремнеземные NP, также наблюдались крио-ЭМ с использованием микроструктурированных чипов (рисунок 5G-J).
Рисунок 1: Схемы и изображения процедуры изготовления недавно разработанного микроструктурированного чипа с окнами GO для крио-ЭМ. (A) Схемы процесса изготовления и поперечные сечения микроструктурированного чипа с окнами GO во время процесса изготовления. (B) Изображения продукции изготовления на каждом этапе изготовления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Краткая иллюстрация хромовых масок, используемых для процесса фотолитографии. (A,B) Дизайн маски для массового производства чипов для пластины 4 в Si (массив чипов 24 x 24), (C,D) конструкции массива чипов 2 x 2 и (E,F) конструкции микро-дырочных узоров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Структура микроструктурированных чипов с окнами GO. (A,F) Изображения оптической микроскопии целых микроструктурных чипов, (B,G) SEM изображения одиночных микроструктурных sixNy мембран, (C,H)SEM изображения микромоделей и (D,I) SEM изображения одиночных микроотверсов с окнами GO. (Э,Дж) Подтверждение GO в микроотвернителе через (E) рамановский спектр и (J) диаграмму дифракции электронов выбранной области (SAED) окна GO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Структура скважины и глубина микроотверлия с окнами GO. (A-C) 40° наклоненные SEM изображения одного микро-отверстия с окном GO и (D-F) поперечное SEM изображение микро-узорчатого чипа с go-окнами на разной глубине (25 нм, 50 нм и 100 нм). (G) Атомно-силовая микроскопия (AFM) 3D-рендеринг изображения, (H) изображение отклонения AFM и (I) профиль линии вдоль красной линии в (H), показывающий глубину микроструктурированного чипа с окнами GO, изготовленными с мембраной SixNy 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Крио-ЭМ изображения биоматериалов различных размеров и неорганических наноматериалов с использованием микроструктурированного чипа с окнами GO. (A) вирусная частица ВИЧ-1, (B) ферритин, (C) протеасома 26S, (D) groEL, (E) апоферритин, (F) тау-белок (стрелки, указывающие на фибриллизованный тау-белок), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au нанород и (J) кремнезем NP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлены процессы микрофабрикации для производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Изготовленный микроструктурированный чип предназначен для регулирования толщины стекловидного слоя льда путем контроля глубины микроотверстия с помощью окон GO в зависимости от размера анализируемого материала. Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен с использованием серии методов MEMS и метода передачи 2D-нанолистов (рисунок 1). Основным преимуществом использования метода изготовления MEMS является его способность к массовому производству и возможность манипулирования структурой и размерами микрочипа с использованием различных конструкций хромовой маски во время фотолитографии (рисунок 2). LPCVD-осажденный слой SixNy с низким напряжением обеспечивает стабильность десятков нанометров толщиной в отдельно стоящий SixNy 23,24,25,26. Однако нанометровый отдельно стоящий слой SixNy по-прежнему уязвим для сил в перпендикулярном направлении27. Поэтому при обращении с микроструктурированным чипом необходима крайняя осторожность, например, при погружении в раствор или сушке феном. Кроме того, в процессе изготовления микроструктурированного чипа используется пластина Si 100 мкм, которая обеспечивает совместимость с большинством держателей образцов крио-ЭМ и автозагрузчиками. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность во время процессов изготовления, чтобы предотвратить разрыв хрупкой пластины.
Микронный регулярный массив структур скважинного типа с окнами GO был подтвержден оптическим микроскопом и SEM (рисунок 3 и рисунок 4). Кроме того, метод капельного литья для переноса GO позволяет наносить GO с высокой плоскостью и без заметных морщин (рисунок 3D,E,I,J). Микроструктурированный чип подходит для загрузки в крио-ЭМ автозагрузчик, а десятки тысяч микронных отверстий в обычном массиве позволяют автоматически собирать большие данные изображения для анализа отдельных частиц. Кроме того, количеством и морфологией мембран SixNy и микроотверстий, поддерживаемых GO, можно легко манипулировать в процессе изготовления MEMS, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ одиночных частиц и другие эксперименты по крио-ЭМ-визуализации в зависимости от целей исследования. Кроме того, расширенное применение микроструктурированных чипов с контролируемой толщиной может быть облегчено изготовлением чипов, которые имеют отверстия с узором в нанометровом масштабе. Методы наноструктурирования, разработанные в полупроводниковой промышленности, могут быть приняты при изготовлении этих чипов 28,29,30.
Способность регулировать глубину микроотверстей была продемонстрирована здесь путем изготовления микроструктурированных чипов с окнами GO на трех репрезентативных целевых глубинах: 25 нм, 50 нм и 100 нм. Различные глубины структуры микролунки были достигнуты путем контроля времени осаждения слоя SixNy на кремниевой пластине (рисунок 4). Для оценки морфологии и толщины микроструктурированного чипа с окнами GO с помощью SEM наблюдали поперечные сечения устройств, полученные из сечения сфокусированного ионного пучка (FIB), а профиль глубины измеряли с помощью AFM (рисунок 4). На снимках SEM и AFM была четко показана структура микроотверсти с окном GO скважины, подтверждающая успешный контроль глубины микроотверождения SixNy и перенос окна GO. Использование настраиваемого микроструктурированного чипа с окнами GO, вероятно, обеспечит высокий уровень успеха в производстве областей оптимальной толщины льда для крио-ЭМ-визуализации.
Поскольку материалы, подлежащие наблюдению с помощью крио-ЭМ, имеют разные размеры, получение стекловидного льда с соответствующей толщиной может обеспечить улучшенное контрастное разрешение, широкий охват ориентации и уменьшенную денатурацию структуры во время крио-ЭМ-визуализации. Чтобы продемонстрировать использование процесса крио-ЭМ-визуализации для биологических применений, различные биологические образцы разных размеров, включая ВИЧ-1, ферритин, протеасому 26S, groEL, апоферритин и тау-белок, были сфотографированы с использованием микроструктурированного чипа с окнами GO. Биомолекулы были четко замечены с помощью микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 5A-F). Помимо биомолекул, различные типы неорганических наноматериалов, такие как Fe2O 3 NP, AuNPs, Au nanorods и кремнеземные NP, также наблюдались с использованием микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 5G-J). Микроструктурированный чип и метод изготовления демонстрируют совместимость для крио-визуализации различных материалов. Таким образом, недавно разработанный микроструктурированный чип с окнами GO обеспечивает надежную и воспроизводимую стратегию подготовки образцов для эффективного и высокопроизводительного анализа структуры с помощью крио-ЭМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
M.-H.K., S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Института фундаментальных наук (грант No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Creative-Pioneering Researchers Program через Сеульский национальный университет (2021) и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Грант Nos. NRF-2020R1A2C2101871 и NRF-2021M3A9I4022936). M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2017R1A5A1015365). J.P. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта NRF-2020R1A6C101A183) и междисциплинарные исследовательские инициативные программы Инженерного колледжа и Медицинского колледжа Сеульского национального университета (2021). M.-H.K. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2020R1I1A1A0107416612). Авторы благодарят сотрудников и экипаж Центра макромолекулярной и клеточной визуализации Сеульского национального университета (SNU CMCI) за их неустанные усилия и настойчивость в крио-ЭМ-экспериментах. Авторы благодарят S. J. Kim из Национального центра межуниверситетских исследовательских учреждений за помощь в экспериментах FIB-SEM.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
Acetone | |||
AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).