Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

שבב מיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות תחמוצת גרפן מיוצר על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית, המאפשרות הדמיה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה של ביומולקולות וננו-חומרים שונים.

Abstract

מגבלה מרכזית לניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) היא הקושי להכין דגימות cryo-EM עם עובי קרח מבוקר בקנה מידה ננומטרי. השבב מבוסס הסיליקון (Si), בעל מערך קבוע של מיקרו-חורים עם חלון תחמוצת גרפן (GO) המעוצב על סרט סיליקון ניטריד מבוקר עובי (Six Ny), פותח על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית (MEMS). פוטוליתוגרפיה של UV, תצהיר אדים כימיים, תחריט רטוב ויבש של הסרט הדק, ויציקת טיפות של חומרי ננו-יריעה דו-ממדיים שימשו לייצור המוני של השבבים בעלי התבניות הזעירות עם חלונות GO. עומק החורים הזעירים מווסת כדי לשלוט בעובי הקרח לפי דרישה, בהתאם לגודל הדגימה לצורך ניתוח cryo-EM. הזיקה החיובית של GO לביו-מולקולות מרכזת את הביומולקולות המעניינות בתוך החור המיקרו במהלך הכנת דגימת cryo-EM. השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO מאפשר הדמיית cryo-EM בתפוקה גבוהה של מולקולות ביולוגיות שונות, כמו גם ננו-חומרים אנאורגניים.

Introduction

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) פותחה כדי לפתור את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) של חלבונים במצבם הטבעי 1,2,3,4. הטכניקה כוללת קיבוע חלבונים בשכבה דקה (10-100 ננומטר) של קרח זגוגי ורכישת תמונות הקרנה של חלבונים בעלי אוריינטציה אקראית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), כאשר הדגימה נשמרת בטמפרטורת חנקן נוזלי. אלפי עד מיליוני תמונות הקרנה נרכשות ומשמשות לשחזור מבנה תלת-ממדי של החלבון על ידי אלגוריתמים חישוביים 5,6. לצורך ניתוח מוצלח עם cryo-EM, הכנת דגימת cryo הפכה לאוטומטית על ידי הקפאת הציוד השולט בתנאי הכתם, הלחות והטמפרטורה. תמיסת הדגימה מועמסת על רשת TEM עם ממברנת פחמן חורית, מוכתמת ברצף כדי להסיר את התמיסה העודפת, ולאחר מכן צוללת-קפואה עם אתאן נוזלי כדי לייצר קרח דק וזגוגי 1,5,6. עם ההתקדמות ב- cryo-EM והאוטומציה של הכנת דגימה7, cryo-EM שימש יותר ויותר לפתרון מבנה החלבונים, כולל חלבוני מעטפת עבור וירוסים וחלבוני תעלת יונים בקרום התא 8,9,10. המבנה של חלבוני מעטפת של חלקיקים נגיפיים פתוגניים חשוב להבנת הפתולוגיה של זיהומים נגיפיים, כמו גם לפיתוח מערכת האבחון והחיסונים, למשל SARS-CoV-211, שגרמו למגפת COVID-19. יתר על כן, טכניקות cryo-EM יושמו לאחרונה במדעי החומרים, כגון עבור הדמיה של חומרים רגישים לאלומה המשמשים בסוללה 12,13,14 ובמערכותקטליטיות 14,15 וניתוח המבנה של חומרים אנאורגניים במצב פתרון16.

למרות התפתחויות בולטות ב- cryo-EM ובטכניקות רלוונטיות, קיימות מגבלות בהכנת דגימת cryo, מה שמפריע לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. הכנת סרט קרח זגוגי בעובי אופטימלי חשובה במיוחד לקבלת המבנה התלת-ממדי של חומרים ביולוגיים ברזולוציה אטומית. הקרח חייב להיות דק מספיק כדי למזער את רעשי הרקע מאלקטרונים המפוזרים על ידי הקרח ולאסור על חפיפה של ביו-מולקולות לאורך נתיב קרן האלקטרונים 1,17. עם זאת, אם הקרח דק מדי, הוא עלול לגרום למולקולות חלבון להתיישר בכיוונים מועדפים או לנטרל 18,19,20. לכן, עובי הקרח הזגוגי צריך להיות מותאם בהתאם לגודל החומר המעניין. יתר על כן, בדרך כלל נדרש מאמץ נרחב להכנת דגימה ולסינון ידני של שלמות הקרח והחלבון ברשתות ה-TEM המוכנות. תהליך זה גוזל זמן רב, מה שמעכב את יעילותו לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. לכן, שיפורים באמינות ובשכפול של הכנת דגימות cryo-EM ישפרו את השימוש ב- cryo-EM בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות מסחריות, כמו גם במדע החומרים.

כאן, אנו מציגים תהליכי מיקרו-פבריקציה ליצירת שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות תחמוצת גרפן (GO) המיועדים לקריו-EM בתפוקה גבוהה עם עובי קרח מבוקר21. השבב בעל התבנית הזעירה יוצר באמצעות טכניקות של מערכת מיקרו-אלקטרומכנית (MEMS), שיכולה לתמרן את המבנה והממדים של השבב בהתאם למטרות ההדמיה. לשבב המיקרו-תבניתי עם חלונות GO יש מבנה מיקרווול שניתן למלא בתמיסת הדגימה, וניתן לווסת את עומק המיקרווול כדי לשלוט בעובי הקרח הזגוגי. הזיקה החזקה של GO לביומולקולות מגבירה את ריכוז הביומולקולות להדמיה, ומשפרת את היעילות של ניתוח המבנה. יתר על כן, השבב בעל התבנית הזעירה מורכב ממסגרת Si, המספקת יציבות מכנית גבוהה עבור הרשת19, מה שהופך אותה לאידיאלית לטיפול בשבב במהלך הליכי הכנת דגימה והדמיית cryo-EM. לכן, שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO המיוצרים על ידי טכניקות MEMS מספק אמינות ושכפול של הכנת דגימת cryo-EM, אשר יכול לאפשר ניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה המבוסס על cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור שבב עם מיקרו-דפוס עם חלונות GO (איור 1)

  1. להפקיד את הסיליקון ניטריד.
    1. הפקדת סיליקון ניטריד במתח נמוך (SixNy) משני צידי פרוסת Si (קוטר 4 אינץ ' ועובי של 100 מיקרומטר) באמצעות תצהיר אדים כימי בלחץ נמוך (LPCVD) בטמפרטורה של 830 °C ולחץ של 150 mTorr, תחת זרימה של 170 sccm dichlorosilane (SiH2Cl2, DCS) ו 38 sccm אמוניה (NH3).
    2. באמצעות קצב תצהיר של ~30 Å/min, שלוט בעובי SixNy כדי להיות בטווח של 25-100 ננומטר על ידי שינוי זמן התצהיר.
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בוופל Si מכיוון שהופל דק מאוד ושברירי. היזהרו שלא לכופף את הוופל במהלך הטיפול או ההעמסה שלו בציוד.
  2. תבנית את הפוטורסיסט.
    1. יש למרוח תמיסת הקסמתילדיזילאזאן (HMDS) על פרוסת SixNעם נפח מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של הוופל, סובבו ציפוי עם מעיל ספין ב-3,000 סל"ד למשך 30 שניות, ואופים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות על צלחת חמה כדי להפוך את משטח הוופל להידרופובי ובכך להבטיח ביצועי ציפוי טובים עם פוטורסיסט (PR).
    2. יש למרוח יחסי ציבור חיוביים (טבלת חומרים) עם נפח מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של הוופל, לסובב את הפרווה ב-3,000 סל"ד למשך 30 שניות, ולאפות ב-100 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות על צלחת חמה. ליח"צ מצופה ספין יש עובי של 500 ננומטר.
    3. חשוף את הוופל המצופה PR באור אולטרה סגול (אורך גל של 365 ננומטר ועוצמה של 20 mW/cm2) במשך 5 שניות דרך מסכת כרום (איור 2A-D) באמצעות יישור שיניים.
    4. פתחו את יחסי הציבור למשך דקה אחת באמצעות מפתח (טבלת חומרים) ושטפו את הוופל על ידי טבילתו במים שעברו דה-יוניזציה (DI) פי 2. ייבשו לחלוטין את הוופל בדוגמת PR על ידי נשיפת גז N2 על משטח הוופל.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת נשיפת גז N2 על פרוסת Si מכיוון שהופל דק מאוד ושברירי. אין לפוצץ גז N2 בלחץ גבוה בכיוון הניצב לוופל, שכן הדבר עלול לגרום לוופל להישבר.
  3. תבנית Sixny.
    1. חרטו את ה-Six nN y שנחשף בעקבות התבנית של ה-PR באמצעות תחריט יונים תגובתי שנבנה במעבדה (RIE), עם גז הקספלואוריד גופריתי של 3 sccm (SF6) בהספק גלי רדיו (RF) של 50 W. קצב התחריט עם הגדרות אלה הוא ~ 6 Å /s. הגדר את זמן החריטה בהתאם לעובי של שכבת SixNy שהופקדה.
      הערה: קצב התחריט עשוי להשתנות ולדרוש אופטימיזציה במעבדה בהתאם למפרטים של ציוד ה- RIE המשמש.
    2. בטל את יחסי הציבור על ידי טבילת הוופל בדוגמת SixNy באצטון בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפת הוופל על ידי טבילתו במי DI 2x. ייבשו את הוופל באופן מלא על ידי נשיפת גז N2 על משטח הוופל.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת טבילה או הוצאת הוופל מהתמיסות מכיוון שהופל יכול להישבר על ידי מתח הפנים של התמיסה. אין לטבול או להוציא את הוופל המקביל לפני השטח של התמיסה. השתמשו בפינצטה לטיפול בפרוסות מדויקות עם קצוות מסיבי פחמן. אין לתפוס בחוזקה את הוופל עם הפינצטה; הרימו צד אחד של הוופל עד שהופל יטה לזווית, שם ניתן להוציא אותו מהתמיסה. הוופל עלול להישבר כאשר הוא מתכופף עקב האחיזה האיתנה במהלך ההרמה.
  4. תחרוט את הסי.
    1. הכינו תמיסת אשלגן הידרוקסיד (KOH) של 1.5 מ' על ידי המסת אבקת KOH במי DI בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
    2. טבלו את הוופל בדוגמת SixNy בתמיסת KOH כדי לחרוט את Si. השאירו את הוופל החשוף בתמיסה עם ערבוב עד שניתן יהיה לצפות בחלונות SixNy העומדים בפני עצמם בצד הנגדי של Six Ny התבניתי.
      הערה: זמן החריטה הרטוב עשוי להשתנות בהתאם לעובי ה- Si; עבור פרוסה בעובי 100 מיקרומטר, תחריט רטוב בדרך כלל לוקח מספר שעות. אין להגדיר את מהירות הערבוב גבוהה מדי במהלך תחריט Si מכיוון שחלונות SixNy העומדים בפני עצמם דקים מאוד ועלולים להישבר על ידי זרימת הנוזל. בניסוי זה נקבע קצב הערבוב ל-250 סל"ד.
    3. נקו את הוופל החרוט על ידי טבילתו מספר פעמים באמבט מים DI כדי למנוע שאריות תחריט. מייבשים את הוופל באוויר.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת טבילה או הוצאה של פרוסת תבנית Si מהתמיסות מכיוון שחלונות SixNy העומדים בפני עצמם הם דקים מאוד ושבריריים ויכולים להישבר על ידי מתח הפנים של התמיסה. יש לטבול את הוופל או להוציא אותו בזווית, כך שקצה הוופל נכנס ויוצא מהתמיסה תחילה.
  5. בטל את שאריות התחריט של KOH.
    1. לחץ קלות על גבולות מערך השבבים באמצעות פינצטה כדי להשיג מערך של שבבים שיהיו בעלי תבנית מיקרו (איור 1B).
    2. הכינו תמיסת KOH של 1.5 M בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עם ערבוב.
    3. טבלו את מערך השבבים בתמיסת KOH למשך 30 שניות ושטפו אותו על ידי טבילתו במי DI 2x. ייבשו את השבבים במלואם על ידי ניפוח גז N2 .
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת טבילת השבבים בתמיסות וייבושם בגז N2 מכיוון שחלונות SixNy העומדים בפני עצמם דקים ושבריריים מאוד. בעוד השבב שקוע בתמיסת KOH, יש להפסיק את הערבוב. את השבבים יש לטבול עם הקצוות שלהם תחילה בכיוון הניצב לתמיסה ולפוצץ בגז N2 בכיוון המקביל.
    4. ייבשו באופן מלא את מערך השבבים באוויר למשך שעה אחת לפחות.
  6. תבנית יחסי הציבור.
    1. הכן פרוסת Si 525 μm ריקה כתמיכה מוצקה. ספין מצפה את פרוסת Si עם HMDS ויח"צ חיובי, כמתואר לעיל, אך חבר את מערך השבבים (עם צד החלון SixNy העומד בפני עצמו כלפי מעלה) על פרוסת Si לפני אפיית יחסי הציבור. יחסי הציבור משמשים כדבק בין הוופל למערך השבבים. יש לאפות את פרוסת ה-Si המחוברת למערך השבבים בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות על גבי צלחת חמה.
    2. ספין מצפה את ערכת השבבים עם HMDS ויח"צ חיובי, כפי שתואר לעיל.
    3. חשוף את ערכת השבבים באור אולטרה סגול (אורך גל של 365 ננומטר; עוצמה של 20 mW/cm2) במשך 5 שניות דרך מסכת כרום (איור 2E,F) באמצעות יישור שיניים.
    4. לפתח את יחסי הציבור באמצעות מפתח במשך 15 שניות, לשטוף את ערכת השבבים על ידי טבילתו במי DI 2x, ולייבש באופן מלא את השבב בדוגמת PR שנקבע על ידי ניפוח גז N2 .
  7. הכן את ה- Six ny בעל התבנית הזעירה.
    1. Etch SixNy בעקבות דפוס ה- PR באמצעות RIE שנבנה במעבדה, עם גז SF6 של 3 sccm בהספק RF של 50 W. שלוט בזמן התחריט בהתאם לעובי שכבת SixNy .
  8. לחסל את יחסי הציבור.
    1. בטל את יחסי הציבור על ידי טבילת השבב המעוצב שנקבע בתמיסת 1-מתיל-2-פירולידיינון (NMP) ב-60 מעלות צלזיוס והשארתו למשך הלילה. שטפו את ערכת השבבים על ידי טבילתו במי DI 2x, ויבשו לחלוטין את השבב המעוצב שנקבע על ידי ניפוח גז N2 .
    2. בטל את שאריות ה- PR עם תהליך פלזמה O2 באמצעות גז 100 sccm O2 בהספק RF של 150 W למשך דקה אחת עם RIE שנבנה במעבדה.
  9. יש לשטוף את השבב בעל התבנית הזעירה.
    1. הכן פתרון KOH של 1.5 M בטמפרטורה של 80 °C (80 °F).
    2. טבלו את השבבים בעלי התבניות הזעירות בתמיסת KOH במשך 30 שניות כדי לחסל לחלוטין את שאריות היח"צ ולשטוף את השבבים על ידי טבילתם במי DI 2x. ייבשו את השבבים במלואם על ידי ניפוח גז N2 .
    3. ייבשו לחלוטין את השבבים באוויר במשך שעה אחת לפחות.
  10. העברת תחמוצת גרפן (GO) בשיטת יציקת הטיפה.
    1. דיללו את תמיסת GO (2 מ"ג/מ"ל) ל-0.2 מ"ג/ל' עם מי DI וסוניקאט במשך 10 דקות כדי לפרק אגרגטים של יריעות GO. צנטריפוגה את פתרון GO מדולל ב 300 x g עבור 30 s.
    2. זוהר פורק את הצד החרוט Si של השבב בעל התבנית הזעירה כדי להפוך את משטח השבב עם מטען חיובי באמצעות פורק זוהר (טבלת חומרים) ב-15 mA למשך דקה אחת.
    3. שחררו 3 μL של תמיסת ה-GO על הצד הנקי הזוהר של השבב בעל התבנית הזעירה והשאירו את הטיפה על השבב למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, הכתימו את תמיסת GO העודפת על השבב עם נייר סינון.
    4. שטפו את השבב המועבר על ידי GO עם טיפות מים DI שהוכנו על סרט פרפין והכתימו את מי ה-DI על השבב עם נייר מסנן. חזור על הליך זה 2x בצד שהועבר GO ו- 1x בצד הנגדי. מייבשים את השבב המועבר על ידי GO בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
    5. שטפו את השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO על ידי טבילתו במי ה-DI וייבשו את השבב בגז N2 .

2. הדמיית Cryo-EM

  1. הכינו את דוגמת הקריו.
    1. הכינו את דגימת הקריו באמצעות מכונת צניחת קריו מכנית (טבלת חומרים), השולטת בטמפרטורה, בלחות, בזמן הכתם ובכוח. לאחר העמסת כרית הכתם על הכתמים, ודא כי הלחות והטמפרטורה בתא נשמרות על 100% ו -15 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
    2. הרימו את השבב בעל התבנית הזעירה עם פינצטה אופיינית וטענו את הפינצטה למכונת הצלילה של cryo. Pipet 3 μL של תמיסת דגימה על שבב מיקרו-תבניתי בצד בדוגמת חור, עם חלונות GO בתחתית. שלוט בזמן הכתם ובכוח בהתאם לתמיסת המדגם.
      הערה: כאן, דגימות ביולוגיות, כלומר נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), פריטין, פרוטאזום 26S, groEL, חלקיקי חלבון אפופריטין וחלבוני חוטי טאו שימשו להדמיית cryo-EM. בנוסף, סוגים מגוונים של חומרים אנאורגניים, כגוןFe 2O3 ננו-חלקיקים (NP), ננו-חלקיקי Au, ננו-חלקיקי Au, וננו-חלקיקי סיליקה, שימשו להדמיית cryo-EM. זמן הכתם והכוח הרצויים נקבעו על בוכנת הקריו לסוגים שונים של דגימות.
    3. לאחר תהליך ההדבקה, להקפיא-להקפיא את השבב הטעון דגימה מיד באתאן נוזלי. העבירו את השבב לתיבת הרשת בחנקן נוזלי (LN2) ואחסנו אותו ב-LN2 לפני הדמיית cryo-EM.
  2. בצע הדמיית cryo-EM.
    1. טען את דגימת ה- cryo למחזיק cryo-EM עם הטמפרטורה שנשמרה ב - 180 ° צלזיוס.
    2. טען את מחזיק ה- cryo-EM לתוך TEM והתבונן בדגימות עם מצב מערכת המינון המינימלי (MDS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שבב בדוגמת מיקרו עם חלונות GO יוצר על ידי ייצור MEMS והעברת ננו-יריעות GO דו-ממדיות. שבבים למיקרו-דפוסים יוצרו בייצור המוני, עם כ-500 שבבים שהופקו מתוך פרוסה אחת של 4 אינץ' (איור 1B ואיור 2A,B). ניתן לתפעל את העיצובים של השבבים בעלי התבניות הזעירות באמצעות עיצובים שונים של מסכת הכרום (איור 2) במהלך הליך הפוטוליתוגרפיה. השבבים המפוברקים בעלי התבניות הזעירות היו בעלי מספרים וממדים מבוקרים של ממברנות SixNy העומדות בפני עצמן. המספרים של ממברנות SixNy העומדות בפני עצמן נשלטו מ-48 (6 x 8) ל-50 (5 x 10) והממדים מ-50 x 40 מיקרומטר2 עד 250 x 40 מיקרומטר2 (איור 3A,B,F,G). כל קרום SixNy העומד בפני עצמו יכול להכיל עשרות עד מאות מיקרו-חורים בקטרים הניתנים להתאמה אישית הנעים בין 2-3 מיקרומטר עם מרווחי חורים שונים. שבבים מפוברקים בעלי תבנית מיקרו כוללים עד כ-25,000 חורים תלויי GO, בעוד שמספר החורים ניתן לשליטה גם הוא (איור 3B-D ואיור 3G-I). קיומה של שכבת ה-GO הדקה על פני החור אושר על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן ועיפת אלקטרונים. ספקטרום הראמן בחלון GO הראה פסגות מייצגות של GO, כלומר רצועות D ו-G ב-1360 ס"מ-1 ו-1590 ס"מ-1, בהתאמה22 (איור 3E). תבניות עקיפה משושה מוכוונות כפל מצביעות על כך שהחלונות מורכבים מ-GO רב-שכבתי (איור 3J).

השבב בעל המיקרו-תבנית עם חלונות GO יוצר בשלושה עומקי מטרה מייצגים (25 ננומטר, 50 ננומטר ו-100 ננומטר) על ידי שליטה בעובי התצהיר של SixNy על פרוסת Si במהלך תהליך ה-LPCVD כדי לאשר את ההיתכנות של ויסות עומק המיקרו-חורים. כדי להעריך את המבנה והעובי של המיקרו-חורים עם חלונות GO, התקבלו תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם הטיית 40 מעלות וחתך רוחב ותמונות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) של השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO. מבנה מסוג טוב של המיקרו-חור עם חלון GO נצפה בבירור, כאשר עומק המיקרו-חור מתאים לעומק הממוקד (איור 4). התוצאות מאשרות כי שליטה במספר ובתכנון של השבב המיקרו-תבניתי עם חלונות GO אפשרית.

כדי להדגים את השימוש בשבב המיקרו-תבניתי להדמיית cryo-EM, הוכנו דגימות קריו שונות של ביו-מולקולות ו-NPs אנאורגניים באמצעות השבב בעל התבנית הזעירה. עבור דגימות ביולוגיות, HIV-1, פריטין, פרוטאזום 26S, groEL, חלקיקי חלבון אפופריטין וחלבוני חוטי טאו צולמו עם cryo-EM באמצעות שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO (איור 5A-F). מלבד ביו-מולקולות, חומרים אנאורגניים כגון Fe2O3 NPs, Au NPs, ננורודים Au ו-NPs סיליקה נצפו גם על-ידי cryo-EM באמצעות שבבים בעלי תבנית מיקרו (איור 5G-J).

Figure 1
איור 1: סכמות ותמונות של הליך הייצור של השבב בעל הדוגמאות הזעירות שפותח לאחרונה עם חלונות GO עבור cryo-EM. (A) סכמות של תהליך הייצור וחתכים של השבב בעל המיקרו-דפוס עם חלונות GO במהלך תהליך הייצור. (B) תמונות של מוצרי הייצור בכל שלב ייצור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: המחשה קצרה של מסכות הכרום המשמשות לתהליך הפוטוליתוגרפיה. (A,B) תכנון מסכה לייצור המוני של שבבים עבור פרוסת Si 4 ב-Si (מערך שבבים בגודל 24 x 24), (C,D) תכנון של 2 x 2 מערך שבבים, ועיצובים (E,F) של תבניות מיקרו-חורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מבנה השבבים בעלי התבניות הזעירות עם חלונות GO. (A,F) תמונות מיקרוסקופיה אופטית של שבבים שלמים בעלי תבנית מיקרו, (B,G) תמונות SEM של ממברנות SixNy בעלות תבנית מיקרו בודדת, (C,H) תמונות SEM של מיקרו-תבניות, ו-(D,I) תמונות SEM של מיקרו-חורים בודדים עם חלונות GO. (ה,י) אישור GO במיקרו-חור דרך (E) ספקטרום ראמאן ו-(J) תבנית עקיפת אלקטרונים בשטח שנבחר (SAED) של חלון GO. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מבנה טוב ועומק של החור המיקרו עם חלונות GO. (A-C) תמונות SEM מוטות ב-40° של מיקרו-חור יחיד עם חלון GO, ותמונת SEM חתך (D-F) של השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO בעומקים שונים (25 ננומטר, 50 ננומטר ו-100 ננומטר). (G) מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) תמונת עיבוד תלת-ממדית, (H) תמונת סטייה של AFM, ופרופיל קו (I) לאורך הקו האדום ב-(H) המציג את עומק השבב בעל המיקרו-תבנית עם חלונות GO המיוצרים עם קרום SixNy של 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות Cryo-EM של ביו-חומרים בגדלים שונים וננו-חומרים אנאורגניים באמצעות השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO. (A) חלקיק נגיף HIV-1, (B) פריטין, (C) פרוטאזום 26S, (D) groEL, (E) אפופריטין, (F) חלבון טאו (חיצים המציינים חלבון טאו פרפור), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod, ו-(J) סיליקה NP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תהליכי המיקרו-פבריקציה לייצור שבבים עם מיקרו-תבניות עם חלונות GO מוצגים כאן. השבב המיקרו-תבניתי המפוברק נועד לווסת את עובי שכבת הקרח הזגוגית על ידי שליטה בעומק המיקרו-חור באמצעות חלונות GO בהתאם לגודל החומר שיש לנתח. שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות GO יוצר באמצעות סדרה של טכניקות MEMS ושיטת העברת יריעות ננו-יריעה דו-ממדית (איור 1). היתרון העיקרי של השימוש בטכניקת ייצור MEMS הוא היכולת שלה לייצור המוני וההיתכנות של מניפולציה של המבנה והממדים של השבב על ידי שימוש בעיצובים שונים של מסכת הכרום במהלך פוטוליתוגרפיה (איור 2). שכבת SixNy שהופקדה על ידי LPCVD עם מתח נמוך מבטיחה את היציבות של עשרות הננומטרים העבים העומדים החופשיים SixNy23,24,25,26. עם זאת, שכבת Six Ny העומדת בקנה מידה ננומטרי עדיין פגיעה לכוחות בכיוון הניצב27. לכן, נדרשת זהירות רבה בעת הטיפול בשבב המיקרו-תבניתי, כגון בעת טבילה בתמיסה או ייבוש מכה. בנוסף, תהליך הייצור של השבב בעל הדוגמאות הזעירות משתמש בפרשת Si של 100 מיקרומטר, המבטיחה תאימות לרוב מחזיקי הדגימות והטעינים האוטומטיים של cryo-EM. עם זאת, נדרשת זהירות במהלך תהליכי הייצור כדי למנוע את שבירת הוופל השברירי.

המערך הרגיל בקנה מידה מיקרוני של מבנים מסוג טוב עם חלונות GO אושר באמצעות מיקרוסקופ אופטי ו-SEM (איור 3 ואיור 4). חוץ מזה, שיטת יציקת הטיפה להעברת GO מאפשרת תצהיר GO עם שטוחות גבוהה וללא קמטים בולטים (איור 3D,E,I,J). השבב בעל התבנית הזעירה מתאים לטעינה במטען האוטומטי cryo-EM, ועשרות אלפי חורים בקנה מידה של מיקרון במערך רגיל מאפשרים איסוף אוטומטי של נתוני תמונה גדולים לניתוח חלקיקים בודדים. יתר על כן, ניתן לתפעל בקלות את המספר והמורפולוגיה של ממברנות SixNy ומיקרו-חורים הנתמכים על ידי GO בתהליך ייצור MEMS, מה שמאפשר ניתוח חלקיקים בודדים בתפוקה גבוהה וניסויי הדמיה אחרים של cryo-EM בהתאם למטרות המחקר. יתר על כן, יישומים מורחבים של שבבים עם מיקרו-תבניות בעובי מבוקר יכולים להיות מקלים על ידי ייצור שבבים בעלי חורים המעוצבים בקנה מידה ננומטרי. ניתן לאמץ טכניקות ננו-דפוס שפותחו בתעשיית המוליכים למחצה בייצור שבבים אלה 28,29,30.

היכולת לווסת את עומק המיקרו-חורים הודגמה כאן על ידי ייצור שבבים בעלי תבנית מיקרו עם חלונות GO בשלושה עומקי יעד מייצגים: 25 ננומטר, 50 ננומטר ו-100 ננומטר. עומקים שונים של מבנה המיקרווול הושגו על ידי שליטה בזמן התצהיר של שכבת SixNy על פרוסת Si (איור 4). לצורך הערכת המורפולוגיה והעובי של השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO, נצפו חתכים של המכשירים שהתקבלו מחיתוך קרן יונים ממוקדת (FIB) באמצעות SEM, ופרופיל העומק נמדד באמצעות AFM (איור 4). המבנה הסוגי היטב של המיקרו-חור עם חלון GO הוצג בבירור בתמונות SEM ו- AFM, ואישר שליטה מוצלחת על עומק המיקרו-חור SixNy והעברת חלון GO. השימוש בשבב המיקרו-תבניתי הניתן להתאמה אישית עם חלונות GO עשוי להבטיח שיעור הצלחה גבוה בייצור אזורים בעלי עובי קרח אופטימלי להדמיית cryo-EM.

מאחר שהחומרים שיש לצפות בהם עם cryo-EM הם בגדלים שונים, הפקת קרח זגוגי בעובי מתאים יכולה להבטיח רזולוציית ניגודיות משופרת, כיסוי כיוון רחב ודנטורציה מופחתת של המבנה במהלך הדמיית cryo-EM. כדי להדגים את השימוש בתהליך ההדמיה של cryo-EM עבור יישומים ביולוגיים, דגימות ביולוגיות שונות בגדלים שונים, כולל HIV-1, פריטין, פרוטאזום 26S, groEL, apoferritin וחלבון טאו, צולמו באמצעות שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO. הביומולקולות נצפו בבירור באמצעות השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO (איור 5A-F). מלבד ביו-מולקולות, נצפו גם סוגים מגוונים של ננו-חומרים אנאורגניים, כגון Fe2O3 NPs, Au NPs, ננו-רודים Au ו-NPs סיליקה, באמצעות שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות GO (איור 5G-J). שיטת השבב והייצור המיקרו-תבניתית מראים תאימות להדמיית קריו של חומרים שונים. לפיכך, השבב המיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות GO מספק אסטרטגיית הכנת דגימה אמינה וניתנת לשחזור לניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה עם cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של המכון למדע בסיסי (מענק מס' IBS-R006-D1). S.K., M.L., ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של תוכנית החוקרים החלוצים היצירתיים דרך האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021) ומענק ה- NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; גרנט מס' NRF-2020R1A2C2101871, ו- NRF-2021M3A9I4022936). M.L. ו- J.P. מכירים בתמיכה הכספית של מלגת POSCO Science של קרן POSCO TJ Park ומענק NRF הממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2017R1A5A1015365). J.P. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2020R1A6C101A183), ותוכניות יוזמות המחקר הבין-תחומיות של המכללה להנדסה והמכללה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית של סיאול (2021). M.-H.K. מכיר בתמיכה הכספית ממענק ה-NRF שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT; מענק מס' NRF-2020R1I1A1A0107416612). המחברים מודים לצוות ולצוות של המרכז האוניברסיטאי הלאומי בסיאול להדמיית מקרומולקולרית ותא (SNU CMCI) על מאמציהם הבלתי נלאים וההתמדה שלהם בניסויי cryo-EM. המחברים מודים לס.ג'יי קים מהמרכז הלאומי למתקני מחקר בין-אוניברסיטאיים על הסיוע בניסויי FIB-SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

הנדסה גיליון 182 מיקרוסקופ קריוגני-אלקטרונים מערכות מיקרואלקטרומכניות תחמוצת גרפן עובי קרח זגוגי וירוס חלבון ננו-חומרים
ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter