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Artículo de método

Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

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DOI:

10.3791/63744

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12 de mayo de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

En este artículo

Resumen

Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.

Resumen

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la incidencia de muchos tipos de cáncer sigue aumentando. Se ha avanzado mucho en términos de detección, prevención y tratamiento; Sin embargo, todavía faltan modelos preclínicos que predigan el perfil de quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer. Para llenar este vacío, se desarrolló y validó un modelo de xenoinjerto derivado del paciente in vivo . El modelo se basó en embriones de pez cebra (Danio rerio) a los 2 días después de la fertilización, que se utilizaron como receptores de fragmentos de xenoinjerto de tejido tumoral tomados de la muestra quirúrgica de un paciente.

También vale la pena señalar que las muestras biópticas no fueron digeridas o desagregadas, con el fin de mantener el microambiente tumoral, lo cual es crucial en términos de analizar el comportamiento tumoral y la respuesta a la terapia. El protocolo detalla un método para establecer xenoinjertos derivados de pacientes (zPDX) a base de pez cebra a partir de la resección quirúrgica de tumor sólido primario. Después de la detección por un anatomopatólogo, la muestra se disecciona con una hoja de bisturí. El tejido necrótico, los vasos o el tejido graso se extraen y luego se cortan en trozos de 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm.

Las piezas se marcan con fluorescencia y se xenotrasplantan en el espacio perivitelino de los embriones de pez cebra. Se puede procesar un gran número de embriones a bajo costo, lo que permite análisis in vivo de alto rendimiento de la quimiosensibilidad de zPDX a múltiples medicamentos contra el cáncer. Las imágenes confocales se adquieren rutinariamente para detectar y cuantificar los niveles apoptóticos inducidos por el tratamiento de quimioterapia en comparación con el grupo control. El procedimiento de xenoinjerto tiene una ventaja de tiempo significativa, ya que se puede completar en un solo día, proporcionando una ventana de tiempo razonable para llevar a cabo un cribado terapéutico para ensayos coclínicos.

Introducción

Uno de los problemas de la investigación clínica del cáncer es que el cáncer no es una sola enfermedad, sino una variedad de enfermedades diferentes que pueden evolucionar con el tiempo, requiriendo tratamientos específicos dependiendo de las características del propio tumor y del paciente1. En consecuencia, el desafío es avanzar hacia la investigación oncológica orientada al paciente, con el fin de identificar nuevas estrategias personalizadas para la predicción temprana de los resultados del tratamiento del cáncer2. Esto es particularmente relevante para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), ya que se considera un cáncer difícil de tratar, con una tasa de supervivencia a 5 años del 11%3.

El diagnóstico tardío, la progresión rápida y la falta de terapias efectivas siguen siendo los problemas clínicos más apremiantes de PDAC. El principal desafío es, por lo tanto, modelar al paciente e identificar biomarcadores que puedan ser aplicados en la clínica para seleccionar la terapia más efectiva en línea con la medicina personalizada 4,5,6. Con el tiempo, se han propuesto nuevos enfoques para modelar enfermedades cancerosas: organoides derivados del paciente (PDO) y xenoinjertos derivados de pacientes de ratón (mPDX) se originaron a partir de una fuente de tejido tumoral humano. Se han utilizado para reproducir la enfermedad para estudiar la respuesta y la resistencia a la terapia, así como la recurrencia de la enfermedad 7,8,9.

Del mismo modo, el interés en los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (zPDX) basados en pez cebra ha aumentado, gracias a sus características únicas y prometedoras10, lo que representa una herramienta rápida y de bajo costo para la investigación del cáncer11,12. Los modelos zPDX requieren solo un tamaño de muestra tumoral pequeño, lo que hace factible el cribado de quimioterapia de alto rendimiento13. La técnica más común utilizada para los modelos zPDX se basa en la digestión completa de la muestra y la implantación de las poblaciones de células primarias, que reproduce parcialmente el tumor, pero tiene las desventajas de la falta de microambiente tumoral y la diafonía entre células malignas y sanas14.

Este trabajo muestra cómo se pueden usar las zPDX como modelo preclínico para identificar el perfil de quimiosensibilidad de pacientes con cáncer de páncreas. La valiosa estrategia facilita el proceso de xenoinjerto, ya que no hay necesidad de expansión celular, lo que permite acelerar el cribado de quimioterapia. La fortaleza del modelo es que todos los componentes del microambiente se mantienen tal como están en el tejido canceroso del paciente, porque, como es bien sabido, el comportamiento del tumor depende de su interacción15,16. Esto es altamente favorable sobre los métodos alternativos en la literatura, ya que es posible preservar la heterogeneidad tumoral y contribuir a mejorar la previsibilidad del resultado del tratamiento y la recaída de una manera específica del paciente, lo que permite que el modelo zPDX se utilice en ensayos coclínicos. Este manuscrito describe los pasos involucrados en la elaboración del modelo zPDX, comenzando con una parte de la resección del tumor del paciente y tratándola para analizar la respuesta a la quimioterapia.

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Protocolo

El Ministerio de Salud Pública italiano aprobó todos los experimentos con animales descritos, de conformidad con la Directiva 2010/63/UE sobre el uso y cuidado de animales. El Comité de Ética local aprobó el estudio, con el número de registro 70213. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados. Antes de comenzar, se deben preparar todas las soluciones y el equipo (sección 1) y se deben cruzar los peces (sección 2).

1. Preparación de soluciones y equipos

NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer las soluciones y los medios que deben prepararse.

  1. Soporte de gel de agarosa
    1. Pesar el polvo de agarosa en un matraz para microondas y disolverlo en un volumen dado de medio de pez cebra E3 para hacer un gel al 1%. Calentar en un microondas hasta que la agarosa se haya disuelto por completo.
      NOTA: No hierva demasiado la solución.
    2. Vierta la agarosa derretida en una placa de Petri y espere hasta que el gel se haya solidificado por completo.
    3. Haga pequeños cilindros de agarosa (~ 5 mm de alto) usando una pipeta de plástico Pasteur con la punta cortada. Una vez preparado, conservar en una placa de Petri a 4 °C envuelto en papel de aluminio.
  2. Microagujas de vidrio
    1. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato con un extractor para obtener agujas finas (ajustes: HEAT 990, PULL 550).
      NOTA: A partir de un capilar, es posible obtener dos agujas finas con un diámetro de punta de 10 μm.

2. Cruce de peces y recolección de huevos

  1. Transfiera peces adultos en tanques de reproducción 3 días antes de la implantación del tejido, según lo descrito por Avdesh et al.17.
  2. NOTA: Se recomienda una proporción de 1:1 o 2:3 hombres a mujeres. La densidad de peces debe ser de un máximo de cinco peces por litro de agua. Mantenga a los machos y hembras separados con una barrera durante la noche.
  3. Al día siguiente, retire la barrera y permita que los peces se apareen.
  4. Retire los peces de los tanques de cría y devuélvalos a sus tanques de alojamiento.
  5. Vierta el agua del tanque de cría a través de una red de malla fina. Transfiera los huevos fertilizados a una placa de Petri con medio de pez cebra E3.
  6. Revise la placa de Petri con un microscopio estereoscópico y deseche los huevos turbios. Mantener los huevos fertilizados en medio fresco de pez cebra E3 a 28 °C.

3. Recolección de muestras

NOTA: Pinzas de autoclave y mango de bisturí.

  1. Procesamiento inmediato
    1. Recoger la muestra quirúrgica del tumor en 10 ml de medio tumoral a 4 °C (muestra tumoral de 5 mm a 10 mm de diámetro). Transfiera la muestra a 4 °C desde el lugar deseado para su procesamiento inmediato.
  2. Almacenamiento durante la noche (opcional)
    1. Recoger la muestra quirúrgica del tumor en 10 ml de medio tumoral y almacenar la muestra durante la noche a 4 °C.
  3. Almacenamiento a -80 °C (opcional, menos recomendado)
    1. Almacene la muestra a -80 °C en un vial criogénico con medio tumoral suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%.

4. Procesamiento de muestras

NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.

  1. Lave todo el tejido tumoral con 5 ml de medio tumoral fresco, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta plástica Pasteur. Aspirar y desechar el medio de lavado. Repita este paso 3 veces.
    NOTA: Evite la aspiración del tejido tumoral, ya que podría permanecer unido a la pipeta plástica Pasteur.
  2. Transfiera la muestra en una placa de Petri y sumérjala en 1-2 ml de medio tumoral fresco. Corte la muestra del tumor en trozos pequeños (1-2 mm3) con una hoja de bisturí y colóquelos en un tubo plástico estéril de 5 ml con medio tumoral.
  3. Ajuste el picador de tejidos McIlwain a 100 μm de espesor. Coloque los fragmentos de la muestra en la mesa circular de plástico del helicóptero y córtelos. Gire la mesa 90° y repita el picado.
  4. Centrifugar los fragmentos a 300 × g durante 3 min. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo.
  5. Incubar los fragmentos con un seguidor celular fluorescente, CM-DiI (concentración final de 10 μg/ml en solución salina tamponada con fosfato [DPBS] de Dulbecco), Deep Red (concentración final de 1 μL/ml en DPBS) o CellTrace (concentración final de 5 μM en DPBS) durante 30 min, colocando el tubo en un baño maría a 37 °C.
  6. Resuspenda los fragmentos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos.
    NOTA: En el caso de CellTrace, agregue un medio que contenga al menos un 1% de proteína al final de la incubación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Centrifugar a 300 x g durante 3 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso 3 veces con 1 ml de DPBS para eliminar el tinte no incorporado.
  8. Suspender los fragmentos en 5 mL de DPBS en una placa de Petri de 60 mm.
    NOTA: Asegúrese de que el tejido no se seque.

5. Creación de zPDX

NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.

  1. Anestesiar los embriones 2 días después de la fertilización (dpf) con 0,16 mg/ml de tricaína en medio de pez cebra E3.
  2. Coloque tres cilindros de agarosa (paso 1.1.3) en una placa de Petri y coloque un embrión de pez cebra en un cilindro, exponiendo un lado. Retire el exceso de solución para mantener el embrión en una película delgada.
  3. Transfiera el pedazo de tejido teñido con pinzas estériles de la placa de Petri al soporte de agarosa al 1% donde yace el embrión. Recoger el tejido, colocarlo encima de la yema del embrión y, a continuación, introducirlo en el espacio perivitelino utilizando la microaguja de vidrio tirada térmicamente (paso 1.2.1).
  4. Agregue suavemente algunas gotas de E3 1% penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) al embrión para devolverlo al líquido.
  5. Repita los pasos 5.2-5.4 para todos los embriones y, finalmente, retire los soportes de agarosa de la placa de Petri e incube los embriones a 35 ° C.
  6. Compruebe los embriones para los xenoinjertos correctos (tinción positiva) 2 h después de la implantación utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Deseche los embriones con fragmentos tumorales que no estén completamente dentro del espacio perivitelino, así como los embriones muertos. Distribuir aleatoriamente los embriones en seis placas multipocillos (máximo n = 20 embriones/pocillo), divididos equitativamente en grupos según el plan experimental (p. ej., control y FOLFOXIRI).

6. Tratamiento

  1. Diluir el fármaco (por ejemplo, 5-fluorouracilo, oxaliplatino, irinotecán) en E3 1% Pen-Strep, mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Según lo propuesto por Usai et al.12, utilizar una dilución quíntuple del fármaco en el agua de los peces, con respecto a la concentración plasmática equivalente (CPE).
  2. Mezcle los medicamentos para preparar el cóctel (por ejemplo, FOLFOXIRI).
  3. Retire los medios de cada pocillo y agregue el cóctel de medicamentos 2 h después de la implantación.
  4. Tratar los embriones durante 3 días. Renueve el cóctel de drogas todos los días.

7. Tinción inmunofluorescente de montaje completo

NOTA: Antes de empezar, colocar la acetona a -20 °C y preparar las soluciones enumeradas en la Tabla 1.

  1. Día 1:
    1. Fijar las larvas con 1 ml de paraformaldehído al 4% en viales de vidrio a 4 °C durante la noche.
  2. Día 2:
    1. Lave las larvas 3 x 5 min con 1 mL de PBS, agitando suavemente en un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    2. Almacenar en 1 ml de metanol al 100% a -20 °C durante la noche (o para almacenamiento a largo plazo).
    3. Rehidratar 3 x 10 min con 1 mL de PTw (0,1% de tween en PBS), agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    4. Permeabilizar con 1 mL de 150 mM de Tris-HCl a pH 8.8 durante 5 min a RT, seguido de calentamiento durante 15 min a 70 °C.
    5. Lavar 2 x 10 min con 1 ml de PTw, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    6. Lavar 2 x 5 min con 1 mL dedH2O, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    7. Permeabilizar con 1 ml de acetona helada durante 20 min a -20 °C.
    8. Lavar 2 x 5 min con 1 mL dedH2O, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    9. Lavar 2 x 5 min con 1 ml de PTw, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    10. Incubar las larvas en 1 ml de tampón de bloqueo durante 3 h a 4 °C, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    11. Coloque las larvas en placas de pocillos divididas por grupo de la siguiente manera: 10 larvas en 50 μL de volumen/pocillo en una placa de 96 pocillos o 20 larvas en 100 μL de volumen/pocillo en una placa de 48 pocillos.
    12. Deseche el tampón de bloqueo, incube las larvas con solución de anticuerpos primarios (por ejemplo, caspasa-3 hendida antihumana de conejo, 1:250) diluida en tampón de incubación durante la noche a 4 °C en la oscuridad, y meca suavemente en una placa agitadora (400 rpm). Consulte el paso 7.2.11 para ver los volúmenes recomendados.
  3. Día 3:
    1. Lavar las larvas secuencialmente 3 x 1 h con 1 mL de PBS-TS (10% suero de cabra, 1% Triton X-100 en PBS) y luego, con 2 x 10 min con 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 en PBS) y 2 x 1 h con 1 mL de PBS-TS. En cada lavado, agite suavemente las placas que contienen las larvas en una placa agitadora (400 rpm).
    2. Incubar las larvas con anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente (p. ej., anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-conejo IgG [H+L], Alexa Fluor 647, 1:500) y 100 μg/ml Hoechst 33258 diluido en tampón de incubación en la oscuridad durante la noche a 4 °C, con agitación suave en una placa agitadora (400 rpm). Ver paso 7.2.11 para ver los volúmenes recomendados de solución de anticuerpos secundarios.
  4. Día 4:
    1. Lavar 3 x 1 h con 1 mL de PBS-TS y 2 x 1 h con 1 mL de PTw, con agitación suave en una placa agitadora (400 rpm).
    2. Cree una capa circular con el esmalte (grosor de ~0.5-1 mm) en portaobjetos de microscopio. Deje que el esmalte se seque y coloque las larvas en el centro de la capa circular, exponiendo el lado del xenoinjerto.
    3. Seque el exceso de solución y monte el cubreobjetos de vidrio con un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente.

8. Imágenes

  1. Captura imágenes bajo microscopía confocal con un objetivo de 40x. Utilice los siguientes parámetros de adquisición: una resolución de 1024 x 512 píxeles con un espaciado Z de 5 μm.

9. Análisis de la apoptosis por ImageJ

  1. Cargue (Fiji Is Just) el software ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) y abra la imagen de archivo Z-stack (haga clic en Archivo | Abierto). En la ventana emergente, seleccione Visualización de pila/Hyperstack y haga clic en Aceptar.
  2. Superponga los diferentes canales seleccionando Imagen | Color | Hacer compuesto.
  3. Arrastre la barra Z en la parte inferior de la imagen para navegar por la imagen de la pila Z e identificar el área del xenoinjerto (células que son positivas para el rastreador de células fluorescentes. Ver paso 4.5) en el espacio perivitelino del pez cebra.
  4. Seleccione Point Tool y cuente el número de células humanas apoptóticas (positivo a rastreador de células fluorescentes y caspasa-3 hendida), como se muestra en el video complementario S1.
  5. Haga doble clic en el icono de la herramienta de puntos , cambie el contador y cuente el número total de núcleos de células humanas (núcleos de células CM-DiI positivas).

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Resultados

Este protocolo describe el enfoque experimental para establecer zPDX a partir del adenocarcinoma pancreático humano primario. Se recogió, picó y tiñó una muestra tumoral con tinte fluorescente, como se describe en la sección 4 del protocolo. Las zPDX se establecieron con éxito mediante la implantación de un pedazo de tumor en el espacio perivitelino de 2 embriones de pez cebra dpf, como se describe en la sección 5 del protocolo. Como se describe en la sección 6 del protocolo, las zPDX se examinaron más a fondo para ident...

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Discusión

Los modelos in vivo en la investigación del cáncer proporcionan herramientas invaluables para comprender la biología del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento del cáncer. Actualmente, se dispone de diferentes modelos in vivo , por ejemplo, animales modificados genéticamente (ratones transgénicos y knockout) o xenoinjertos derivados de pacientes a partir de células primarias humanas. A pesar de muchas características óptimas, cada una tiene varias limitaciones. En particular, los modelos antes me...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fondazione Pisa (proyecto 114/16). Los autores desean agradecer a Raffaele Gaeta de la Unidad de Histopatología de Azienda Ospedaliera Pisana por la selección de muestras de pacientes y el apoyo a la patología. También agradecemos a Alessia Galante por el apoyo técnico en los experimentos. Este artículo se basa en el trabajo de COST Action TRANSPAN, CA21116, apoyado por COST (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-fluorouraciloTeva Pharma AGSMP 1532755
48 placa multipocilloSarstedt83 3923
96 placa multipocilloSarstedt82.1581.001
AcetonaMerck179124
Agarosa en polvo MerckA9539
AnfotericinaThermo Fisher Scientific15290018
Anticuerpo Anti-Núcleos, clon 235-1MerckMAB1281 Dilución 1:200
Red de acuario QN6Penn-plax0-30172-23006-6
BSAMerckA9418
CellTraceThermo Fisher ScientificC34567
CellTracker CM-DiI Thermo Fisher ScientificC7001
CellTracker Rojo Profundo Thermo Fisher ScientificC34565
Caspasa-3 escindida (Asp175) (5A1E) Tecnologíade señalización de células9661Sdilución 1:250
Dimetilsulfóxido (DMSO) PanReac AppliChem ITW ReactivosA3672,0250
Pinzas Dumont #5World Precision Instruments501985
Ácido folínico -  LederfolinPfizer
Capilares de vidrio, 3.5"Drummond Scientific Company3-000-203-G/XDiámetro exterior = 1.14 mm. Diámetro interior = 0.53 mm.
Viales de vidrio VWR InternationalWHEAW224581
Cabra anti-Conejo  IgG  (H+L) Anticuerpo secundario con adsorción cruzada, Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-21244   Dilución 1:500
Suero de cabraThermo Fisher Scientific31872
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IrinotecanHospira
Viales para congelador de baja temperaturaVWR International479-1220
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
Mezcladorde microplacasSCILOGEX822000049999
OxaliplatinoTeva
ParaformaldehídoMerckP6148-500G
PBSThermo Fisher Scientific 14190094
Penicilina-estreptomicina Thermo Fisher Scientific 15140122
Placa de Petri 100 mmSarstedt83 3902500
Placa de Petri 60 mmSarstedt83 3901
Plástico Pipeta PasteurSarstedt86.1171.010
Poly-MountTebu-bio18606-5
Yoduro de propidioMerckP4170
RPMI-1640 medianoThermo Fisher Scientific11875093
Hoja de bisturí n.º 10 Acero inoxidable estérilVWR InternationalSWAN3001
Mango de bisturí #3World Precision Instruments500236
TricaineMerckE10521
Triton X-100 MerckT8787
Tween 20MerckP9416
Extractor de micropipeta verticalObturador instrumentoP-30 
mAb de conejo

Referencias

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