Summary
Preklinik modeller, kanser biyolojisi bilgisini ilerletmeyi ve tedavi etkinliğini öngörmeyi amaçlamaktadır. Bu yazıda, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftlerin (zPDX'ler) tümör doku fragmanları ile üretilmesi açıklanmaktadır. zPDX'ler, terapötik etkisi nakledilen dokunun hücre apoptozu açısından değerlendirilen kemoterapi ile tedavi edildi.
Abstract
Kanser, dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir ve birçok kanser türünün görülme sıklığı artmaya devam etmektedir. Tarama, önleme ve tedavi açısından çok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, kanser hastalarının kemosensitivite profilini öngören preklinik modeller hala eksiktir. Bu boşluğu doldurmak için, in vivo hasta kaynaklı bir ksenogreft modeli geliştirildi ve doğrulandı. Model, döllenmeden 2 gün sonra zebra balığı (Danio rerio) embriyolarına dayanıyordu ve bunlar bir hastanın cerrahi örneğinden alınan tümör dokusunun ksenogreft parçalarının alıcıları olarak kullanıldı.
Ayrıca, tümör davranışını ve tedaviye yanıtı analiz etmek açısından çok önemli olan tümör mikroçevresini korumak için bioptik örneklerin sindirilmediğini veya ayrıştırılmadığını da belirtmek gerekir. Protokol, primer solid tümör cerrahi rezeksiyonundan zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftler (zPDX'ler) oluşturmak için bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bir anatomopatolog tarafından tarandıktan sonra, örnek bir neşter bıçağı kullanılarak diseke edilir. Nekrotik doku, damarlar veya yağ dokusu çıkarılır ve daha sonra 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm parçalar halinde doğranır.
Parçalar daha sonra floresan olarak etiketlenir ve zebra balığı embriyolarının perivitelin boşluğuna ksenotransplante edilir. Çok sayıda embriyo düşük maliyetle işlenebilir, bu da zPDX'lerin çoklu antikanser ilaçlarına karşı kemosensitivitesinin yüksek verimli in vivo analizlerini sağlar. Konfokal görüntüler, kontrol grubuna kıyasla kemoterapi tedavisinin neden olduğu apoptotik seviyeleri tespit etmek ve ölçmek için rutin olarak edinilir. Ksenograft prosedürü önemli bir zaman avantajına sahiptir, çünkü tek bir günde tamamlanabilir ve ortak klinik çalışmalar için terapötik bir tarama yapmak için makul bir zaman aralığı sağlar.
Introduction
Klinik kanser araştırmalarının sorunlarından biri, kanserin tek bir hastalık değil, zamanla gelişebilen, tümörün kendisinin ve hastanın özelliklerine bağlı olarak spesifik tedaviler gerektiren çeşitli farklı hastalıklar olmasıdır1. Sonuç olarak, zorluk, kanser tedavisi sonuçlarının erken tahmini için yeni kişiselleştirilmiş stratejiler belirlemek amacıyla hasta odaklı kanser araştırmalarına doğru ilerlemektir2. Bu özellikle pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ile ilgilidir, çünkü 5 yıllık sağkalım oranı% 11 olan tedavisi zor bir kanser olarak kabul edilir3.
Geç tanı, hızlı ilerleme ve etkili tedavilerin eksikliği PDAK'nın en acil klinik sorunları olmaya devam etmektedir. Bu nedenle asıl zorluk, hastayı modellemek ve kişiselleştirilmiştıp 4,5,6 doğrultusunda en etkili tedaviyi seçmek için klinikte uygulanabilecek biyobelirteçleri tanımlamaktır. Zamanla, kanser hastalıklarını modellemek için yeni yaklaşımlar önerilmiştir: hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) ve fare hasta kaynaklı ksenogreftler (mPDX'ler) bir insan tümör dokusu kaynağından kaynaklanmaktadır. Hastalığın nüksünün yanı sıra tedaviye yanıtı ve direnci incelemek için hastalığı çoğaltmak için kullanılmıştır 7,8,9.
Benzer şekilde, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreft (zPDX) modellerine olan ilgi, kanser araştırmaları için hızlı ve düşük maliyetli bir aracı temsil eden benzersiz ve umut verici özelliklerisayesinde artmıştır10 11,12. zPDX modelleri sadece küçük bir tümör numune boyutu gerektirir, bu da kemoterapinin yüksek verimli taramasını mümkün kılar13. zPDX modelleri için kullanılan en yaygın teknik, tümörü kısmen yeniden üreten, ancak tümör mikroçevresi eksikliği ve malign ve sağlıklı hücreler arasındaki çapraz iletişimin dezavantajlarına sahip olan birincil hücre popülasyonlarının tam numune sindirimine ve implantasyonuna dayanır14.
Bu çalışma, zPDX'lerin pankreas kanseri hastalarının kemosensitivite profilini tanımlamak için klinik öncesi bir model olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Değerli strateji, ksenograft işlemini kolaylaştırır, çünkü hücre genişlemesine gerek yoktur, bu da kemoterapi taramasının hızlanmasına izin verir. Modelin gücü, tüm mikro çevre bileşenlerinin hasta kanser dokusunda olduğu gibi korunmasıdır, çünkü iyi bilindiği gibi, tümörün davranışı etkileşimlerine bağlıdır15,16. Bu, literatürdeki alternatif yöntemlere göre oldukça elverişlidir, çünkü tümör heterojenliğini korumak ve tedavi sonucunun ve nüksün hastaya özgü bir şekilde öngörülebilirliğinin iyileştirilmesine katkıda bulunmak mümkündür, böylece zPDX modelinin koklinik çalışmalarda kullanılmasını sağlar. Bu makalede, bir parça hasta tümör rezeksiyonu ile başlayarak ve kemoterapiye yanıtı analiz etmek için tedavi edilerek zPDX modelinin yapımında yer alan adımlar açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İtalya Halk Sağlığı Bakanlığı, hayvanların kullanımı ve bakımına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktife uygun olarak açıklanan tüm hayvan deneylerini onayladı. Yerel Etik Kurul, çalışmayı 70213 kayıt numarası altında onayladı. İlgili tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Başlamadan önce, tüm çözeltiler ve ekipmanlar hazırlanmalı (bölüm 1) ve balıklar çaprazlanmalıdır (bölüm 2).
1. Çözeltilerin ve ekipmanların hazırlanması
NOT: Hazırlanacak çözümler ve ortamlar için Tablo 1'e bakınız.
- Agarose jel desteği
- Agaroz tozunu mikrodalga fırınlanabilir bir şişede tartın ve% 1'lik bir jel yapmak için belirli bir hacimde E3 zebra balığı ortamında çözün. Agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada ısıtın.
NOT: Çözeltiyi fazla kaynatmayın. - Erimiş agarozu bir Petri kabına dökün ve jel tamamen katılaşana kadar bekleyin.
- Ucu kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanarak küçük agaroz silindirleri (~ 5 mm yüksekliğinde) yapın. Hazırlandıktan sonra, alüminyum folyoya sarılmış 4 ° C'de bir Petri kabında saklayın.
- Agaroz tozunu mikrodalga fırınlanabilir bir şişede tartın ve% 1'lik bir jel yapmak için belirli bir hacimde E3 zebra balığı ortamında çözün. Agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada ısıtın.
- Cam mikro iğneler
- İnce iğneler elde etmek için borosilikat cam kılcal damarları bir çektirme ile çekin (ayarlar: HEAT 990, PULL 550).
NOT: Bir kılcal damardan, uç çapı 10 μm olan iki ince iğne elde etmek mümkündür.
- İnce iğneler elde etmek için borosilikat cam kılcal damarları bir çektirme ile çekin (ayarlar: HEAT 990, PULL 550).
2. Balık geçişi ve yumurta toplama
- Avdesh ve ark.17 tarafından tarif edildiği gibi, yetişkin balıkları doku implantasyonundan 3 gün önce üreme tanklarına aktarın.
- NOT: 1: 1 veya 2: 3 erkeklerin kadınlara oranı önerilir. Balık yoğunluğu, litre su başına maksimum beş balık olmalıdır. Erkekleri ve dişileri gece boyunca bir bariyerle ayrı tutun.
- Ertesi gün, bariyeri kaldırın ve balığın çiftleşmesine izin verin.
- Balıkları üreme tanklarından çıkarın ve onları muhafaza tanklarına geri koyun.
- Suyu üreme tankından ince bir ağ üzerinden dökün. Döllenmiş yumurtaları E3 zebra balığı ortamına sahip bir Petri kabına aktarın.
- Petri kabını stereomikroskopla kontrol edin ve bulutlu yumurtaları atın. Döllenmiş yumurtaları taze E3 zebra balığı ortamında 28 °C'de saklayın.
3. Örnek toplama
NOT: Otoklav forseps ve neşter sapı.
- Anında işleme
- Tümörün cerrahi örneğini 4 ° C'de 10 mL tümör ortamında toplayın (çapı 5 mm ila 10 mm arasında değişen tümör örneği). Numuneyi anında işleme için istenen yerden 4 °C'de aktarın.
- Gece boyunca depolama (isteğe bağlı)
- Cerrahi tümör örneğini 10 mL tümör ortamında toplayın ve numuneyi gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
- -80 °C'de depolama (isteğe bağlı, en az önerilen)
- Numuneyi -80 ° C'de,% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tümör ortamına sahip kriyojenik bir şişede saklayın.
4. Numune işleme
NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altındaki adımları uygulayın.
- Tüm tümör dokusunu 5 mL taze tümör ortamı ile yıkayın, plastik bir Pasteur pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Yıkama ortamını aspire edin ve atın. Bu adımı 3x tekrarlayın.
NOT: Plastik Pasteur pipete bağlı kalabileceğinden tümör dokusunun aspirasyonundan kaçının. - Numuneyi bir Petri kabına aktarın ve 1-2 mL taze tümör ortamına batırın. Tümör örneğini bir neşter bıçağı kullanarak küçük parçalara (1-2 mm3) kesin ve tümör ortamına sahip steril 5 mL'lik plastik bir tüpe yerleştirin.
- McIlwain doku doğrayıcıyı 100 μm kalınlığa ayarlayın. Örnek parçalarını doğrayıcının dairesel plastik masasına yerleştirin ve doğrayın. Masayı 90° döndürün ve doğrama işlemini tekrarlayın.
- Parçaları 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.
- Parçaları floresan hücre izleyici, CM-DiI (Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde [DPBS]'de 10 μg / mL'lik son konsantrasyon), Koyu Kırmızı (DPBS'de 1 μL / mL'lik son konsantrasyon) veya CellTrace (DPBS'de 5 μM'lik son konsantrasyon) ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve tüpü 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Her 10 dakikada bir yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek parçaları yeniden askıya alın.
NOT: CellTrace durumunda, üreticinin talimatlarına göre, inkübasyonun sonuna en az% 1 protein içeren ortam ekleyin. - 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Dahil edilmemiş boyayı çıkarmak için bu adımı 3 kez 1 mL DPBS ile tekrarlayın.
- Parçaları 60 mm'lik bir Petri kabında 5 mL DPBS'de askıya alın.
NOT: Dokunun kurumadığından emin olun.
5. zPDX'in kurulması
NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altındaki adımları uygulayın.
- Döllenmeden sonraki 2 gün (dpf) embriyoları E3 zebra balığı besiyerinde 0.16 mg/mL trikain ile uyuşturun.
- Bir Petri kabına üç agaroz silindiri (adım 1.1.3) koyun ve bir tarafı açığa çıkaracak şekilde bir silindir üzerine bir zebra balığı embriyosu koyun. Embriyoyu sadece ince bir filmde tutmak için fazla çözeltiyi çıkarın.
- Steril forsepsli lekeli doku parçasını Petri kabından embriyonun yattığı %1 agaroz desteğine aktarın. Dokuyu alın, embriyo sarısının üzerine koyun ve ardından ısıl olarak çekilen cam mikroiğneyi kullanarak perivitelin boşluğuna itin (adım 1.2.1).
- Sıvıya geri getirmek için embriyoya nazikçe birkaç damla E3% 1 penisilin-streptomisin (Pen-Strep) ekleyin.
- Tüm embriyolar için 5.2-5.4 adımlarını tekrarlayın ve son olarak, agaroz desteklerini Petri kabından çıkarın ve embriyoları 35 ° C'de inkübe edin.
- Bir floresan stereomikroskop kullanarak implantasyondan 2 saat sonra embriyoları doğru ksenogreftler (pozitif boyama) için kontrol edin. Tamamen perivitelin boşluğunun içinde olmayan tümör fragmanlarına sahip embriyoları ve ölü embriyoları atın. Embriyoları, deneysel plana göre eşit olarak gruplara ayrılmış altı çok kuyucuklu plakaya (maksimum n = 20 embriyo / kuyu) rastgele dağıtın (örneğin, kontrol ve FOLFOXIRI).
6. Tedavi
- İlacı (örneğin, 5-florourasil, oksaliplatin, irinotekan) E3 %1 Pen-Strep'e seyreltin, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Usai ve ark.12 tarafından önerildiği gibi, eşdeğer plazma konsantrasyonuna (EPC) göre ilacın balık suyunda beş kat seyreltilmesini kullanın.
- Kokteyli hazırlamak için ilaçları karıştırın (örneğin, FOLFOXIRI).
- Medyayı her bir kuyucuktan çıkarın ve implantasyondan 2 saat sonra ilaç kokteylini ekleyin.
- Embriyoları 3 gün boyunca tedavi edin. İlaç kokteylini her gün yenileyin.
7. Tam montajlı immünofloresan boyama
NOT: Başlamadan önce, -20 ° C'ye aseton yerleştirin ve Tablo 1'de listelenen çözeltileri hazırlayın.
- 1. Gün:
- Larvaları bir gecede 4 ° C'de cam şişelerde 1 mL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
- 2. Gün:
- Larvaları 3 x 5 dakika 1 mL PBS ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- Gece boyunca -20 ° C'de 1 mL% 100 metanol içinde saklayın (veya uzun süreli depolama için).
- 1 mL PTw (PBS'de %0,1 ara) ile 3 x 10 dakika rehidrasyon yapın, laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- RT'de 5 dakika boyunca pH 8.8'de 1 mL 150 mM Tris-HCl ile geçirgenleştirin, ardından 70 ° C'de 15 dakika ısıtın.
- 2 x 10 dakikayı 1 mL PTw ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- 2 x 5 dakikayı 1 mL dH2O ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- -20 ° C'de 20 dakika boyunca 1 mL buz gibi soğuk aseton ile geçirgenleştirin.
- 2 x 5 dakikayı 1 mL dH2O ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- 2 x 5 dakikayı 1 mL PTw ile yıkayın, laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- Larvaları 1 mL blokaj tamponunda 4 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.
- Larvaları grup başına aşağıdaki gibi bölünmüş kuyu plakalarına yerleştirin: 96 delikli bir plakada 50 μL hacim / kuyucukta 10 larva veya 48 delikli bir plakada 100 μL hacim / kuyuda 20 larva.
- Bloke edici tamponu atın, larvaları karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon tamponunda seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi (örneğin, tavşan anti-insan parçalanmış kaspaz-3, 1:250) ile inkübe edin ve bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafifçe sallayın. Önerilen birimler için adım 7.2.11'e bakın.
- 3. Gün:
- Larvaları sırayla 3 x 1 saat 1 mL PBS-TS (% 10 keçi serumu, PBS'de% 1 Triton X-100) ve daha sonra 1 mL PBS-T (PBS'de% 1 Triton X-100) ile 2 x 10 dakika ve 1 mL PBS-TS ile 2 x 1 saat yıkayın. Her yıkamada, larvaları içeren plakaları bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafifçe çalkalayın.
- Larvaları floresan boya konjuge ikincil antikorlarla (örneğin, Goat anti-Rabbit IgG [H + L] Çapraz Adsorbe Sekonder Antikor, Alexa Fluor 647, 1:500) ve 100 μg / mL Hoechst 33258 ile inkübasyon tamponunda seyreltilmiş olarak inkübasyon tamponunda gece boyunca 4 ° C'de, bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde nazik ajitasyonla inkübe edin. Sekonder antikor çözeltisinin önerilen hacimleri için adım 7.2.11'e bakın.
- 4. Gün:
- 3 x 1 saatini 1 mL PBS-TS ile ve 2 x 1 saatini 1 mL PTw ile, bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafif çalkalama ile yıkayın.
- Mikroskop slaytlarında emaye (~ 0.5-1 mm kalınlığında) ile dairesel bir tabaka oluşturun. Emayenin kurumasına izin verin ve larvaları dairesel tabakanın ortasına yerleştirerek ksenogreftin tarafını açığa çıkarın.
- Fazla çözeltiyi kurutun ve cam kapak kapağını suda çözünür, floresan olmayan bir montaj ortamı ile monte edin.
8. Görüntüleme
- Konfokal mikroskopi altında 40x hedefle görüntü yakalayın. Aşağıdaki alma parametrelerini kullanın: 5 μm Z aralığına sahip 1024 x 512 piksel çözünürlük.
9. ImageJ ile apoptozun analizi
- ImageJ yazılımını yükleyin (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) ve Z-stack dosya görüntüsünü açın ( Dosya | Açık). Açılır pencerede, Yığın görüntüleme/Hyperstack'i seçin ve Tamam'ı tıklatın.
- Görüntü | Renk | Kompozit yapın.
- Z yığını görüntüsüne göz atmak ve ksenograft alanını (floresan hücre izleyici pozitif olan hücreler. Bkz. adım 4.5) zebra balığı perivitelin uzayında.
- Nokta Aracı'nı seçin ve Ek Video S1'de gösterildiği gibi apoptotik insan hücrelerinin sayısını (floresan hücre izleyici ve parçalanmış kaspaz-3'e pozitif) sayın.
- Nokta Aracı simgesine çift tıklayın, sayacı değiştirin ve toplam insan hücresi çekirdeği sayısını (CM-DiI pozitif hücrelerin çekirdekleri) sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, primer insan pankreas adenokarsinomundan zPDX'lerin oluşturulması için deneysel yaklaşımı açıklamaktadır. Bir tümör örneği, protokol bölüm 4'te açıklandığı gibi floresan boya kullanılarak toplandı, kıyıldı ve boyandı. zPDX'ler daha sonra, protokol bölüm 5'te açıklandığı gibi, 2 dpf zebra balığı embriyosunun perivitelin boşluğuna bir tümör parçasının implantasyonu ile başarılı bir şekilde kurulmuştur. Protokol bölüm 6'da açıklandığı gibi, zPDX'ler hasta kaynaklı kanser hücrelerinin kemoterapi duyarlılık profillerini tanımlamak için daha fazla taranmıştır. Örneğin, kemoterapi kombinasyonu FOLFOXIRI (5-florourasil, folinik asit, oksaliplatin ve irinotekan) test edildi, çünkü ileri pankreatik duktal adenokarsinom ve metastatik kolorektal kanserde birinci basamak kemoterapi olarak kullanıldı. ZPDX'lerin tüm montajlı görüntüleri konfokal mikroskopta Z-yığınları olarak elde edildi ve apoptoz indüksiyonu protokol bölüm 8 ve 9'da açıklandığı gibi analiz edildi. Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, kombine tedavi, kontrol grubuna kıyasla hücre apoptozunda bir artışa neden olmuştur. Burada bildirilen vaka çalışmasında, implante edilmiş ksenogreftlerdeki apoptotik hücrelerin fraksiyonunda, FOLFOXIRI ile tedavi edilen grup için kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edilmiştir (Şekil 1C).
| Şekil 1: FOLFOXIRI tedavisinden 3 gün sonra insan pankreatik duktal adenokarsinomundan zPDX'ler. Hücre zarları CM-DiI (kırmızı) ile boyandı ve doku 2 dpf AB vahşi tip zebra balığının perivitelin boşluğuna ksenografize edildi. Larvalar bir FOLFOXIRI kombinasyonuna (0.216 mg / mL 5-florourasil, 0.013 mg / mL folinik asit, 0.006 mg / mL oksaliplatin, 0.011 mg / mL irinotekan) maruz bırakıldı veya 3 gün boyunca maruz bırakılmadı (CTRL), parçalanmış kaspaz-3 antikoru (camgöbeği) ile sabitlendi ve immünoboyandı ve Hoechst (mavi çekirdekler) tarafından karşı boyandı. Larvalar cam mikroskop slaytlarında Aqua Poly-Mount ile monte edildi. (A1-3) Bir kontrol larvasının temsili örneği (kemoterapiye maruz kalmayan). Parçalanmış kaspaz-3-pozitif hücre gözlenmedi. (B1-3) FOLFOXIRI tedavisinden 3 gün sonra, parçalanmış kaspaz-3'ün tutarlı aktivasyonunu gösteren ksenograflı larvaların temsili örneği. Tüm montajlı görüntüler Nikon A1 konfokal mikroskopta dijital fotoğraf makinesi ile çekildi. Kesikli çizgiler ksenograft alanlarını gösterir. (C) FOLFOXIRI ile muamele edilen ksenograflı larvalarda parçalanmış kaspaz-3 ve CM-DiI çift pozitif hücrelerin SEM ± ortalama olarak çizilen CTRL ile karşılaştırıldığında nicelleştirilmesi (n ≥ 12); p < 0.001, Mann-Whitney U testi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: zPDX = zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreft; dpf = döllenmeden sonraki günler; FOLFOXIRI = 5-florourasil, folinik asit, oksaliplatin ve irinotekan; CTRL = denetim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. |
| Çözüm/ortam | Kompozisyon, yorumlar | Amaç | ||
| Tümör ortamı (1x) | RPMI-1640 ortamına penisilin-streptomisin (nihai konsantrasyon 100 U / mL) ve amfoterisin (son konsantrasyon 2.50 μg / mL) ekleyin. | |||
| E3 zebra balığı orta (1x) | Deiyonize sudaki 60x E3 embriyo ortamını (NaCl 3 M, KCl 0.1 M, CaCl 2 0.2 M, MgSO4 0.2 M) 1x'lik bir son çalışma konsantrasyonuna seyreltin. | |||
| E3 %1 Kalem Strep | 99 mL E3 zebra balığı ortamına 1 mL penisilin-streptomisin ekleyin. Ters çevirme ile karıştırın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın | |||
| Ptw | PBS'de %0,1 Ara | Tam montajlı immün boyama | ||
| Engelleme arabelleği | PTw'de %10 keçi serumu, %1 DMSO, %1 BSA, %0,8 Triton X-100 | Tam montajlı immün boyama | ||
| Kuluçka tamponu | PTw'de %1 keçi serumu, %1 DMSO, %1 BSA, %0,8 Triton X-100 | Tam montajlı immün boyama | ||
| PBS-TS | PBS'de %10 keçi serumu, %1 Triton X-100 | Tam montajlı immün boyama | ||
| PBS-T | PBS'de %1 Triton X-100 | Tam montajlı immün boyama | ||
Tablo 1: Protokolde kullanılan çözümler ve ortamlar.
Ek Şekil S1: PDAC tümör örneği DiO boyalı (yeşil) ve 2 dpf zebra balığı embriyosunun perivitelin boşluğuna ksenografize edildi . 3 günlük bir inkübasyon süresinden sonra, zPDX'lere 2 μg / mL propidyum iyodür (PI; kırmızı) enjekte edildi ve daha sonra 3D konfokal görüntülemeye tabi tutuldu. Hücre canlılığı, toplam insan hücresi sayısından PI-pozitif hücreler ölçülerek kontrol edildi (DiO pozitif). Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: PDAC = pankreatik duktal adenokarsinom; dpf = döllenmeden sonraki günler; zPDX = zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreft. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video S1: ImageJ'nin çok noktalı aracını kullanarak apoptotik insan hücresi sayımı örneği. Video, implantasyondan 3 gün sonra, parçalanmış kaspaz-3 ve Hoechst 33258 immünoboyamadan sonra elde edilen bir zPDX'in Z-yığınıdır. Kısaltmalar: zPDX = zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreft. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanser araştırmalarındaki in vivo modeller, kanser biyolojisini anlamak ve kanser tedavisi yanıtını tahmin etmek için paha biçilmez araçlar sağlar. Şu anda, farklı in vivo modeller mevcuttur, örneğin, genetiği değiştirilmiş hayvanlar (transgenik ve nakavt fareler) veya insan birincil hücrelerinden hasta kaynaklı ksenogreftler. Birçok optimum özelliğe rağmen, her birinin çeşitli sınırlamaları vardır. Özellikle, yukarıda belirtilen modeller, hastanın tümör dokusu mikroçevresini taklit etmek için güvenilir bir yoldan yoksundur.
Tümör mikroçevresinin ilaç yanıtında birçok önemli rol oynayabileceği öne sürülmüştür18. Bu nedenle, tümör dokusu mikroçevresini koruyan uygun bir hayvan modeli bulmak için, 2 dpf zebra balığı embriyosunda ksenografize edilmiş tümör dokusu parçaları kullanılarak alternatif bir PDX modeli geliştirilmiştir. Protokol, ksenogreftlerin çok sayıda embriyoda nasıl gerçekleştirileceğini açıklar ve hem tek ajanlar hem de kombinasyonlar halinde ilaçların yüksek verimli taranmasına izin verir.
Bu yenilikçi yaklaşımın kilit noktası, tek hücreli süspansiyonlara sahip yaygın olarak gerçekleştirilen zPDX'lere kıyasla hem hücre-hücre etkileşimlerini hem de tümör mikroçevresini korumasıdır. Cerrahi bir numuneden alınan PDAC derhal taze ve soğuk tümör ortamına konur ve tümör küçük parçalar halinde doğranır. zPDX modelini oluşturmak için kullanılan genel prosedür, bir hastanın tümöründen bir parçanın 2 dpf zebra balığı embriyosunun perivitelin boşluğuna doğrudan implantasyonuna dayanmaktadır.
Önerilen model, hasta kaynaklı tümör dokusu örneğinin sindirimine dayanan PDX modeline bir alternatif olarak hizmet edebilir, ardından yumurta sarısı kesesine veya perivitelin boşluğuna doğrudan enjeksiyon yapılabilir. Fior ve ark.'nın çalışmasının kanıtladığı gibi, cerrahi olarak rezeke edilmiş pankreatobiler kanserlerin enzimatik diseksiyonundan bir zAvatar modeli oluşturmak mümkündür. İmplantasyon oranı, tümör pankreas örneğinin tipik düşük hücreselliği ve olumsuz yoğun desmoplastik stroma19 nedeniyle% 44 ile% 64 arasında değişmiştir.
Bununla birlikte, hücre süspansiyonu orijinal tümör14'ü sadece kısmen yeniden üretti. Tersine, tümör dokusunun doğrudan immün yetmezlikli farelere nakledilmesiyle oluşturulan mPDX, orijinal tümöre en iyi şekilde benzemektedir, bu da klinisyenlerin tümör davranışını anlamalarına ve tedaviden önce bireysel yanıtları değerlendirmelerine daha iyi yardımcı olabilir20. Aslında, küçük, aşılanmış fragman, tümör mikro ortamını korur ve orijinal tümör21'e benzer şekilde, kötü huylu ve sağlıklı hücreler arasındaki çapraz etkileşimi korur. Kemosensitivite veya kemorezistans, zPDX teknolojisinin translasyonel onkoloji alanındaki doğrudan etkisiyle daha iyi üretilir14. zPDX yaklaşımı, her hastanın canlı bir sistemde kendi tümörünün geliştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu, tümör dokusunun bozulmadan ortogreftlendiği veya hücrelerde ayrıştırıldığı, daha sonra fare alıcı modellerine ksenografize edildiği mPDX kullanımına iyi bir alternatiftir13.
Bu protokol, transplantasyon için en uygun tümör parçalarının seçiminden sorumlu patologlarla işbirliği içinde geliştirilmiştir. Biyolojik doku örnekleri her zaman cerrahi numuneden alınmıştır ve asla biyopsiden alınmamıştır, çünkü ikincisi genellikle doku kıtlığı ile karakterizedir ve bu nedenle sadece tanısal amaçlıdır. Doku örneklemesi için kriter genellikle çekirdeğe karşı marjinal değil, kanama ve nekrozdan yoksun bir tümör alanıdır. Bu nedenle, malzemenin derhal kalite kontrolü için numunenin bir yarısına her zaman bir kriyostat histolojik kesiti uygulanmıştır. Bu çalışma, primer tümör hücrelerinin zebra balığı embriyolarının perivitelin boşluğuna girme kapasitesi ile sınırlandırılabilir. Bununla birlikte, transplantasyondan 3 gün sonra, hem 4 ° C'de (12/15 vaka) depolandıktan sonra hem de -80 ° C'den (10/12 vaka) çözüldükten sonra, canlı dokunun% 80'lik bir engraftman oranı gözlenmiştir, bu da tümörün% 74 ± % 2'lik bir hücre canlılığı ile etkili bir şekilde kriyoprezerve edilebileceğini düşündürmektedir (Ek Şekil S1). Buna rağmen, doku engraftmanının başarı oranı farklı PDAC hastası tümörleri arasında değişmektedir; Sonuç olarak, cerrahi rezeksiyondan hemen sonra dokunun hızlı bir şekilde işlenmesi ve donmanın önlenmesi verimliliği artırabilir.
Başarılı ksenogreftler için protokolde bazı teknik çıkarlar da önerilmektedir. Örneğin, doğrayıcının kullanımı, ksenograflı parçaların boyutlarını standartlaştırdı. Doğramadan sonra tümör dokularının parçalarının boyut olarak eşit olup olmadığını kontrol etmek için, potansiyel bir çözüm, ksenotransplantasyondan önce parçaların çapını ölçmek için bir kalibrasyon camı kullanmaktır.
% 1 agaroz silindir desteğinin kullanılması, hem embriyoların bir tarafa yerleştirilmesi hem de sadece bir tümör parçasının implante edilmesi ve ayrıca mikroiğnenin kırılmasını önlemek için gereklidir. Tümörler yüksek bir değişkenlik gösterdiğinden, yöntemin bir başka sınırlaması, intratümöral heterojenitenin hücresel bir süspansiyona kıyasla bir fragmanda daha az temsil edilmesidir. Aslında, küçük doku parçaları iyi huylu hücre popülasyonları ve tümör alt klonları açısından ayrılabilir. Bu eleştirinin üstesinden gelmek için, tümör heterojenliğini özetlemek ve analizdeki değişkenliği azaltmak için çok sayıda enjekte edilen embriyo kullanılmalıdır. İstatistiksel analize göre, her grup, d = 2'lik bir etki büyüklüğü ve% 80 ve% 95'lik bir istatistiksel anlamlılık gücü göz önüne alındığında, 15'ten büyük bir örneklem büyüklüğü gerektirir. Bu sayı makuldür, çünkü uzman bir operatör saatte yaklaşık 40 embriyo işleyebilir.
zPDX modelini oluşturmak için kullanılan metodolojiye ek olarak, burada bir FOLFOXIRI kombinasyonunun zPDX modelinde hasta kaynaklı hücrelerin apoptozunu indüklediği de kanıtlanmıştır. FOLFOXIRI'de olduğu gibi, zPDX kemosensitivitesini, Usai ve ark.11 tarafından başarıyla test edilenler gibi diğer kemoterapi şemalarına test etmek mümkündür.
Ek olarak, ilgilenilen özelliğin nicelleştirilmesini sağlamak için tam montajlı immünoboyama ve görüntüleme tekniği sunulmaktadır. Bazı sorunların üstesinden gelmek ve başarılı bir tam montajlı immün boyamaya yol açmak için, dokuları geçirgenleştirmek için% 5'lik bir DMSO çözeltisi önerilir. Konfokal görüntüleme ile ilgili olarak, konfokal mikroskobun çözünürlük sınırlamaları, ksenogreftli larvaların daha derin yığınlarının edinilmesini bozabilir. Bununla birlikte, çalışmada, apoptotik hücreler toplam hasta hücresi sayısından sayılmıştır. İmplante edilen tümör kütlesinin tabanından tepesine kadar 5 μm'lik bir adım boyutuna sahip üç boyutlu bir rekonstrüksiyon, aynı çekirdeğin önceki veya sonraki Z-düzleminde yayılma olasılığı göz önüne alındığında, tüm insan çekirdeklerinin tanımlanmasını sağlar. Sonuç olarak, ImageJ çok noktalı araç sayacı, aynı hücrenin iki kez sayılmasını kontrol etmek ve önlemek ve aynı Z-yığınlarında çift sayım yapmak için kullanılabilir (toplam insan hücrelerinden apoptotik) ve apoptozu tek hücre düzeyinde kolayca izleyebilir.
Sınırlamalarına rağmen, zPDX modelinin in vivo modellere kıyasla birçok avantajı vardır: zebra balıklarının son derece hızlı yaşam döngüsü, kısa sürede çok sayıda hayvan elde edebilmek; geliştirme aşamalarındaki optik netlik; ve hepsinden önemlisi, döllenme sonrası 0-120 saat zaman penceresindeki son derece düşük etik etki22. Bugün, zPDX'leri kullanan bir koklinik çalışma, fare tabanlı PDX'lerle yapılandan daha ucuzdur, çünkü immün yetmezlikli konakçı suşları, tümör büyümesini izlemek için karmaşık görüntüleme yöntemlerinin yanı sıra yüksek bakım maliyeti gerektirir23. Sonuç olarak, tüm bu faktörler, zPDX modelinin kanser hastalarının kemoterapi duyarlılık profillerini tahmin etmek ve ilaç taraması için yeni modellerle ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere ortak klinik çalışmalarda kullanım potansiyelini vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Fondazione Pisa tarafından finanse edildi (proje 114/16). Yazarlar, hasta örneklem seçimi ve patoloji desteği için Azienda Ospedaliera Pisana Histopatoloji Birimi'nden Raffaele Gaeta'ya teşekkür eder. Ayrıca Alessia Galante'ye deneylerdeki teknik desteği için teşekkür ederiz. Bu makale, COST (European Cooperation in Science and Technology) tarafından desteklenen COST Action TRANSPAN, CA21116'in çalışmalarına dayanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
