Summary
临床前模型旨在提高癌症生物学知识并预测治疗效果。本文描述了基于斑马鱼的患者来源的带有肿瘤组织碎片的异种移植物（zPDX）的产生。zPDXs用化疗治疗，根据移植组织的细胞凋亡评估其治疗效果。
Abstract
癌症是全世界死亡的主要原因之一，许多类型癌症的发病率继续增加。在筛查、预防和治疗方面取得了很大进展;然而，仍然缺乏预测癌症患者化学敏感性特征的临床前模型。为了填补这一空白，开发并验证了一种 体内 患者衍生的异种移植模型。该模型基于受精后2天的斑马鱼 （Danio rerio） 胚胎，这些胚胎被用作从患者手术标本中提取的肿瘤组织的异种移植片段的接受者。
还值得注意的是，生物样本没有被消化或分解，以维持肿瘤微环境，这对于分析肿瘤行为和对治疗的反应至关重要。该协议详细介绍了一种从原发性实体瘤手术切除中建立基于斑马鱼的患者来源异种移植物（zPDX）的方法。经解剖病理学家筛选后，使用手术刀刀片解剖标本。去除坏死组织、血管或脂肪组织，然后切成 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm 的碎片。
然后将这些碎片进行荧光标记并异种移植到斑马鱼胚胎的周围空间中。可以低成本处理大量胚胎，从而能够对zPDX对多种抗癌药物的化学敏感性进行高通量 体内分析 。常规采集共聚焦图像以检测和量化化疗诱导的凋亡水平与对照组相比。异种移植程序具有显着的时间优势，因为它可以在一天内完成，为进行联合临床试验的治疗筛选提供了合理的时间窗口。
Introduction
临床癌症研究的一个问题是，癌症不是一种单一的疾病，而是可以随着时间的推移而演变的各种不同的疾病，需要根据肿瘤本身和患者的特点进行特定的治疗1。因此，挑战在于转向以患者为导向的癌症研究，以便为癌症治疗结果的早期预测确定新的个性化策略2。这与胰腺导管腺癌（PDAC）尤其相关，因为它被认为是一种难以治疗的癌症，5年生存率为11%3。
诊断较晚、进展迅速、缺乏有效治疗仍然是PDAC最紧迫的临床问题。因此，主要的挑战是对患者进行建模并确定可在临床中应用的生物标志物，以选择符合个性化医疗的最有效疗法4，5，6。随着时间的推移，已经提出了新的方法来模拟癌症疾病：患者来源的类器官（PDO）和小鼠患者来源的异种移植物（mPDX）起源于人类肿瘤组织的来源。它们已被用于复制疾病以研究对治疗的反应和抵抗力，以及疾病复发7，8，9。
同样，对基于斑马鱼的患者来源异种移植（zPDX）模型的兴趣也有所增加，这要归功于其独特且有前途的特性10，代表了癌症研究的快速和低成本工具11，12。zPDX模型只需要很小的肿瘤样本量，这使得化疗的高通量筛选成为可能13。用于zPDX模型的最常见技术是基于原代细胞群的完整样品消化和植入，其部分复制肿瘤，但具有缺乏肿瘤微环境和恶性细胞与健康细胞之间串扰的缺点14。
这项工作展示了如何将zPDXs用作临床前模型来识别胰腺癌患者的化学敏感性特征。有价值的策略促进了异种移植过程，因为不需要细胞扩增，从而加速了化疗筛选。该模型的优势在于，所有微环境成分都保持原样，因为它们在患者癌症组织中，因为众所周知，肿瘤的行为取决于它们的相互作用15，16。这比文献中的替代方法非常有利，因为它可以保持肿瘤异质性并有助于以患者特异性的方式提高治疗结果和复发的可预测性，从而使zPDX模型能够用于联合临床试验。这份手稿描述了制作zPDX模型所涉及的步骤，从一段患者肿瘤切除开始，然后对其进行治疗以分析对化疗的反应。
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Protocol
意大利公共卫生部根据关于动物使用和护理的指令2010/63 / EU批准了所有描述的动物实验。当地伦理委员会批准了这项研究，注册号为70213。从所有相关受试者获得知情同意。在开始之前，应准备好所有溶液和设备（第1节），并应将鱼穿过（第2节）。
1. 溶液和设备的准备
注：有关要制备的溶液和培养基，请参见 表1 。
- 琼脂糖凝胶支持
- 称取琼脂糖粉末在微波炉烧瓶中，并将其溶解在给定体积的E3斑马鱼培养基中以制成1%凝胶。在微波炉中加热，直到琼脂糖完全溶解。
注意：不要将溶液煮沸。 - 将融化的琼脂糖倒入培养皿中，等待凝胶完全凝固。
- 使用塑料巴斯德移液管制作小琼脂糖圆柱体（~5 mm高），尖端被切断。准备好后，储存在4°C的培养皿中，用铝箔包裹。
- 称取琼脂糖粉末在微波炉烧瓶中，并将其溶解在给定体积的E3斑马鱼培养基中以制成1%凝胶。在微波炉中加热，直到琼脂糖完全溶解。
- 玻璃微针
- 用拉拔器拉动硼硅酸盐玻璃毛细管以获得细针（设置：HEAT 990，PULL 550）。
注意：从一个毛细管中，可以获得两个尖端直径为10μm的细针。
- 用拉拔器拉动硼硅酸盐玻璃毛细管以获得细针（设置：HEAT 990，PULL 550）。
2. 鱼穿越和采卵
- 如Avdesh等人所述，在组织植入前3天将成年鱼转移到繁殖池中，如Avdesh等人所述17。
- 注意：建议男性与女性的比例为 1：1 或 2：3。鱼的密度应为每升水最多五条鱼。用屏障将男性和女性隔开过夜。
- 第二天，移除屏障，让鱼交配。
- 将鱼从养殖箱中取出并将它们放回其住房水箱中。
- 通过细网将养殖池中的水倒入。将受精卵转移到带有E3斑马鱼培养基的培养皿中。
- 用体视显微镜检查培养皿并丢弃浑浊的鸡蛋。将受精卵保存在28°C的新鲜E3斑马鱼培养基中。
3. 标本采集
注意：高压灭菌器镊子和手术刀手柄。
- 即时处理
- 在4°C的10mL肿瘤培养基中收集肿瘤的手术标本（肿瘤标本直径范围为5mm至10mm）。将样品在4°C下从所需位置转移以进行立即处理。
- 过夜存储（可选）
- 将手术肿瘤标本收集在10mL肿瘤培养基中，并将样品在4°C下储存过夜。
- 储存在-80°C（可选，不推荐）
- 将样品储存在-80°C的低温小瓶中，其中含有补充有5%二甲基亚砜（DMSO）的肿瘤培养基。
4. 样品处理
注意：在无菌组织培养层流罩下执行步骤。
- 用 5 mL 新鲜肿瘤培养基清洗整个肿瘤组织，使用塑料巴斯德移液管上下移液 10 次。吸出并丢弃洗涤介质。重复此步骤 3 次。
注意：避免抽吸肿瘤组织，因为它可能会继续附着在塑料巴斯德移液器上。 - 将样品转移到培养皿中，并将其浸没在1-2mL新鲜肿瘤培养基中。使用手术刀刀片将肿瘤样品切成小块（1-2 mm3），并将它们放入带有肿瘤培养基的无菌5 mL塑料管中。
- 将麦克尔韦恩组织切碎器设置为 100 μm 厚度。将标本碎片放在直升机的圆形塑料桌上并切碎。将桌子旋转 90°，然后重复切碎。
- 将碎片以300 ×g 离心3分钟。然后，小心地吸出上清液并将其丢弃。
- 用荧光细胞示踪剂CM-DiI（Dulbecco磷酸盐缓冲盐水[DPBS]中的终浓度为10μg/ mL），深红（DPBS中的终浓度为1μL / mL）或CellTrace（DPBS中的终浓度为5μM）孵育片段30分钟，将管置于37°C水浴中。
- 每 10 分钟轻轻上下移液一次，重悬碎片。
注意：如果是CellTrace，请根据制造商的说明在孵育结束时添加含有至少1%蛋白质的培养基。 - 以300× g 离心3分钟，弃去上清液。用 1 mL DPBS 重复此步骤 3 次以去除未掺入的染料。
- 将片段悬浮在 60 mm 培养皿中的 5 mL DPBS 中。
注意：确保纸巾不会变干。
5. zPDX的成立
注意：在无菌组织培养层流罩下执行步骤。
- 在 E3 斑马鱼培养基中用 0.16 mg/mL 三卡因麻醉受精后 2 天 （dpf） 胚胎。
- 将三个琼脂糖圆柱体（步骤1.1.3）放入培养皿中，并将斑马鱼胚胎放在圆柱体上，露出一侧。去除多余的溶液，将胚胎保持在薄膜中。
- 用无菌镊子将染色组织从培养皿转移到胚胎躺着的1%琼脂糖载体上。拿起组织，将其放在胚胎卵黄的顶部，然后使用热拉玻璃微针将其推入周围空间（步骤1.2.1）。
- 轻轻地将几滴E3 1%青霉素链霉素（Pen-Strep）滴入胚胎中，使其重新进入液体中。
- 对所有胚胎重复步骤5.2-5.4，最后，从培养皿中取出琼脂糖载体并在35°C孵育胚胎。
- 使用荧光体视显微镜在植入后2小时检查胚胎是否有正确的异种移植物（阳性染色）。丢弃带有不完全在围膜空间内的肿瘤碎片的胚胎，以及死亡的胚胎。将胚胎随机分布在六个多孔板中（最多n = 20个胚胎/孔），根据实验计划平均分成几组（例如，对照和FOLFOXIRI）。
6. 治疗
- 将药物（例如 5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康）稀释到 E3 1% Pen-Strep 中，通过上下移液数次彻底混合。正如Usai等人所建议的12，相对于当量血浆浓度（EPC），在鱼水中使用五倍的药物稀释度。
- 混合药物以制备鸡尾酒（例如，FOLFOXIRI）。
- 从每个孔中取出培养基，并在植入后2小时加入药物鸡尾酒。
- 治疗胚胎3天。每天更新药物鸡尾酒。
7. 全安装免疫荧光染色
注意：在开始之前，将丙酮置于-20°C并制备表1中列出的溶液。
- 第一天：
- 用1mL的4%多聚甲醛在4°C的玻璃小瓶中固定幼虫过夜。
- 第二天：
- 用1mL PBS洗涤幼虫3 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400 rpm）上轻轻搅拌。
- 在-20°C下储存在1mL的100%甲醇中过夜（或长期储存）。
- 用 1 mL PTw（PBS 中的 0.1% 吐温）再水化 3 x 10 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
- 用1mL的150mM Tris-HCl在pH 8.8下在室温下透化5分钟，然后在70°C下加热15分钟。
- 用 1 mL PTw 洗涤 2 x 10 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
- 用1mLdH2 O洗涤2 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
- 用1mL冰冷的丙酮在-20°C下透化20分钟。
- 用1mLdH2 O洗涤2 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
- 用 1 mL PTw 洗涤 2 x 5 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
- 将幼虫在1mL封闭缓冲液中在4°C下孵育3小时，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
- 将幼虫置于每组划分的孔板中，如下所示：96孔板中50μL体积/孔中的10个幼虫或48孔板中100μL体积/孔中的20个幼虫。
- 丢弃封闭缓冲液，将幼虫与在孵育缓冲液中稀释在4°C的孵育缓冲液中过夜的黑暗中孵育幼虫（400rpm）。有关建议的卷，请参阅步骤 7.2.11。
- 第三天：
- 用 1 mL PBS-TS（10% 山羊血清，1% Triton X-100 在 PBS 中）依次洗涤幼虫 3 x 1 小时，然后用 1 mL PBS-T（1% Triton X-100 在 PBS 中）和 2 x 1 小时用 1 mL PBS-TS 洗涤幼虫。在每次洗涤中，在振动板（400rpm）上轻轻搅拌含有幼虫的板。
- 用荧光染料偶联的二抗（例如，山羊抗兔 IgG [H+L] 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647，1：500）和 100 μg/mL Hoechst 33258 在黑暗的孵育缓冲液中稀释过夜，在 4 °C 下孵育过夜，在摇床板上轻轻搅拌 （400 rpm）。二抗溶液的推荐体积见步骤7.2.11。
- 第四天：
- 用1mL的PBS-TS洗涤3 x 1小时，用1mL的PTw洗涤2 x 1小时，在摇床板（400rpm）上轻轻搅拌。
- 在显微镜载玻片上用珐琅质（厚度~0.5-1毫米）形成圆形层。让牙釉质变干，将幼虫放在圆形层的中心，露出异种移植物的侧面。
- 干燥过量溶液，并用水溶性、无荧光的封片剂安装玻璃盖玻片。
8. 成像
- 使用40倍物镜在共聚焦显微镜下捕获图像。使用以下采集参数：分辨率为 1024 x 512 像素，Z 间距为 5 μm。
9. 通过ImageJ分析细胞凋亡
- 加载（斐济只是）ImageJ 软件 （https://imagej.net/Fiji/Downloads） 并打开 Z 堆栈文件映像（单击 “文件”|”打开）。在弹出窗口中，选择堆栈 查看/超堆栈 ，然后单击 确定。
- 通过选择 “图像 |颜色 |使复合。
- 拖动图像底部的 Z 栏以浏览 Z 堆栈图像并识别异种移植区域（荧光细胞追踪器阳性的细胞。参见步骤4.5）在斑马鱼周围空间。
- 选择 点工具 并计数凋亡人类细胞的数量（对荧光细胞追踪器和裂解的半胱天冬酶-3呈阳性），如 补充视频S1所示。
- 双击 点工具 图标，更改计数器，并计数人类细胞核（CM-DiI阳性细胞的细胞核）的总数。
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Representative Results
该协议描述了从原发性人胰腺腺癌中建立zPDX的实验方法。收集肿瘤样品，切碎并使用荧光染料染色，如方案第4节所述。然后通过将一块肿瘤植入 2 个 dpf 斑马鱼胚胎的围膜空间成功建立 zPDX，如协议第 5 节所述。如方案第6节所述，进一步筛选zPDX以确定患者来源癌细胞的化疗敏感性谱。例如，测试了化疗组合 FOLFOXIRI（5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂和伊立替康），因为它被用作晚期胰腺导管腺癌和转移性结直肠癌的一线化疗。在共聚焦显微镜上以Z堆栈的形式获取zPDX的全安装图像，并按照方案第8节和第9节所述分析细胞凋亡诱导。如图1A，B所示，与对照组相比，联合治疗导致细胞凋亡增加。在这里报告的案例研究中，与对照组相比，FOLFOXIRI处理组的植入异种移植物中凋亡细胞的比例在统计学上显着增加（图1C）。
| 图1：FOLFOXIRI治疗后3天来自人胰腺导管腺癌的zPDX。用CM-DiI（红色）对细胞膜进行染色，并将组织异种移植到2 dpf AB野生型斑马鱼的周围空间中。幼虫暴露于FOLFOXIRI组合（0.216mg / mL 5-氟尿嘧啶，0.013 mg / mL亚叶酸，0.006 mg / mL奥沙利铂，0.011mg / mL伊立替康）或未暴露（CTRL）3天，固定，并用裂解的半胱天冬酶-3抗体（青色）免疫染色并用Hoechst（蓝色细胞核）复染。用Aqua Poly-Mount将幼虫安装在玻璃显微镜载玻片中。（答1-3）对照幼虫（未暴露于化疗）的代表性示例。未观察到裂解的半胱天冬酶-3阳性细胞。（地下一至三层）FOLFOXIRI处理后3天异种移植幼虫的代表性例子，显示裂解的半胱天冬酶-3的一致活化。整个卡口图像是在带有数码相机的尼康A1共聚焦显微镜上捕获的。虚线表示异种移植区域。（C）与CTRL相比，用FOLFOXIRI处理的异种移植幼虫中裂解的半胱天冬酶-3和CM-DiI双阳性细胞的定量，绘制为SEM±平均值（n ≥12）;p < 0.001，曼-惠特尼 U 检验。比例尺 = 100 μm。缩写：zPDX = 斑马鱼患者来源的异种移植物;DPF = 受精后天数;FOLFOXIRI = 5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂和伊立替康;CTRL = 控制。请点击此处查看此图的大图。 |
| 溶液/培养基 | 作文、评论 | 目的 | ||
| 肿瘤培养基（1x） | 在 RPMI-1640 培养基中加入青霉素-链霉素（终浓度 100 U/mL）和两性霉素（终浓度 2.50 μg/mL）。 | |||
| E3 斑马鱼培养基 （1x） | 将60x E3胚胎培养基（NaCl 3 M，KCl 0.1 M，CaCl 2 0.2 M，MgSO4 0.2 M）在去离子水中稀释至最终工作浓度为1x。 | |||
| E3 1% 笔链球菌 | 将 1 mL 青霉素-链霉素加入 99 mL E3 斑马鱼培养基中。倒置混合。将溶液储存在4°C | |||
| PTw | 0.1% 吐温在 PBS 中 | 全安装免疫染色 | ||
| 封闭缓冲液 | 10% 山羊血清、1% DMSO、1% BSA、0.8% Triton X-100 PTw | 全安装免疫染色 | ||
| 孵育缓冲液 | 1%山羊血清，1%DMSO，1%BSA，0.8%Triton X-100在PTw中 | 全安装免疫染色 | ||
| PBS-TS | 10%山羊血清，1%Triton X-100在PBS中 | 全安装免疫染色 | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 在 PBS 中 | 全安装免疫染色 | ||
表 1：协议中使用的溶液和培养基。
补充图S1：PDAC肿瘤样品被DiO染色（绿色）并异种移植到2个dpf斑马鱼胚胎的周围空间中。孵育3天后，向zPDX注射2μg/mL碘化丙啶（PI;红色），然后进行3D共聚焦成像。通过测量人类细胞总数（DiO阳性）中的PI阳性细胞来检查细胞活力。比例尺 = 100 μm。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌;DPF = 受精后天数;zPDX = 斑马鱼患者来源的异种移植物。请点击此处下载此文件。
补充视频S1：使用ImageJ的多点工具进行凋亡人类细胞计数的示例。 该视频是植入后 3 天 zPDX 的 Z 堆栈，在裂解半胱天冬酶-3 和 Hoechst 33258 免疫染色后获得。缩写：zPDX = 斑马鱼患者来源的异种移植物。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
癌症研究中的体内模型为了解癌症生物学和预测癌症治疗反应提供了宝贵的工具。目前，可以使用不同的体内模型，例如转基因动物（转基因和敲除小鼠）或来自人类原代细胞的患者来源的异种移植物。尽管有许多最佳功能，但每个功能都有各种限制。特别是，上述模型缺乏一种可靠的方法来模拟患者的肿瘤组织微环境。
有人提出，肿瘤微环境可能在药物反应中起许多重要作用18。因此，为了找到维持肿瘤组织微环境的合适动物模型，使用在2 dpf斑马鱼胚胎中移植的肿瘤组织碎片，开发了另一种PDX模型。该协议描述了如何在大量胚胎中进行异种移植，允许对药物进行高通量筛选，无论是作为单一药物还是组合。
与通常使用的单细胞悬液zPDX相比，这种创新方法的关键点是它保留了细胞间相互作用和肿瘤微环境。将来自手术标本的PDAC立即放入新鲜和冷的肿瘤培养基中，并将肿瘤切成小碎片。用于生成zPDX模型的整个过程基于将患者肿瘤的片段直接植入2 dpf斑马鱼胚胎的围膜空间。
所提出的模型可以作为PDX模型的替代方案，该模型基于消化患者来源的肿瘤组织样本，然后直接注射到卵黄囊或周围玻璃线空间中。正如Fior等人的工作所证明的那样，有可能从手术切除的胰腺癌的酶解中建立zAvatar模型。由于肿瘤胰腺样本的典型低细胞性和不利的致密结缔组织增生基质19，植入率在44%至64%之间。
然而，细胞悬液仅部分复制了原始肿瘤14。相反，通过将肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠中构建的mPDX与原始肿瘤最相似，可以更好地帮助临床医生在治疗前了解肿瘤行为并评估个体反应20。事实上，小的移植片段维持了肿瘤微环境，保留了恶性和健康细胞之间的串扰，类似于原始肿瘤21。因此，化学敏感性或化学耐药性得到更好的再现，zPDX技术在转化肿瘤学领域有直接影响14。zPDX方法使每个患者都能在生命系统中发展出自己的肿瘤。因此，这代表了使用mPDX的良好替代方案，其中肿瘤组织被完整地正交或分解在细胞中，然后将其异种移植到小鼠受体模型中13。
该协议是与负责选择最合适的肿瘤碎片进行移植的病理学家合作开发的。生物组织样本总是从手术标本中取出，而不是从活检中取出，因为后者通常以组织稀缺为特征，因此仅用于诊断目的。组织取样的标准通常不是边缘性与核心取样，而是没有出血和坏死的肿瘤区域。出于这个原因，始终对一半的样品进行低温恒温器组织学切片，以便立即对材料进行质量控制。本研究可能受到原代肿瘤细胞移植到斑马鱼胚胎周围空间的能力的限制。然而，在移植后3天观察到活组织的植入率为80%，无论是在4°C（12/15例）下储存后还是从-80°C解冻（10/12例），表明肿瘤可以有效地冷冻保存，细胞活力为74%±2%（补充图S1）。尽管如此，不同PDAC患者肿瘤的组织植入成功率各不相同;因此，手术切除后不久对组织进行快速处理以及防止冻结可以提高效率。
协议中还提出了一些成功的异种移植技术权宜之计。例如，使用切碎器标准化了异种移植件的尺寸。为了检查切碎后肿瘤组织的碎片尺寸是否相等，一个潜在的解决方案是在异种移植前使用校准玻璃测量碎片的直径。
使用1%琼脂糖圆柱体支架对于将胚胎放在一侧和简单地植入一块肿瘤以及防止折断微针至关重要。由于肿瘤表现出高度的变异性，因此该方法的另一个局限性是，与细胞悬液相比，肿瘤内异质性在片段中的代表性较少。事实上，小组织碎片可能在良性细胞群和肿瘤亚克隆方面存在分歧。为了克服这一批评，应使用大量注射胚胎来概括肿瘤异质性并减少分析中的变异性。根据统计分析，每个组需要大于 15 的样本量，考虑效应大小 d = 2，功效为 80% 和 95% 统计显著性。这个数字是合理的，因为专家操作员每小时可以处理大约 40 个胚胎。
除了用于生成zPDX模型的方法外，这里还证明FOLFOXIRI组合诱导zPDX模型中患者来源细胞的凋亡。与FOLFOXIRI一样，可以测试zPDX对其他化疗方案的化学敏感性，例如由Usai等人成功测试的方案11。
此外，还介绍了全卡口免疫染色和成像技术，以提供目标特征的定量。为了克服一些问题并导致成功的全安装免疫染色，建议使用5%DMSO溶液来透化组织。关于共聚焦成像，共聚焦显微镜的分辨率限制可能会损害异种移植幼虫更深层堆栈的获取。然而，在研究中，凋亡细胞被计入患者细胞总数。从植入肿瘤块的底部到顶部的三维重建，步长为5μm，可以识别所有人类细胞核，考虑到同一细胞核可能在上一个或下一个Z平面内扩散的概率。因此，ImageJ 多点工具计数器可用于控制和防止对同一细胞进行两次计数，并在相同的 Z 堆栈中运行重复计数（从总人类细胞中凋亡），并且可以轻松地在单细胞水平上追踪细胞凋亡。
尽管有其局限性，但与 体内 模型相比，zPDX模型具有几个优点：斑马鱼的生命周期极快，能够在短时间内获得大量动物;开发阶段的光学清晰度;最重要的是，受精后0-120小时时间窗口的道德影响极低22。今天，使用zPDXs的联合临床试验比使用基于小鼠的PDXs进行的联合临床试验更便宜，因为免疫缺陷宿主菌株需要高昂的维护成本以及复杂的成像方法来监测肿瘤生长23。总之，所有这些因素都突出了zPDX模型在联合临床试验中用于预测癌症患者化疗敏感性特征的潜力，并被对药物筛选新模型感兴趣的研究人员使用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作由比萨基金会（项目114/16）资助。作者要感谢Azienda Ospedaliera Pisana组织病理学部门的Raffaele Gaeta为患者样本选择和病理学支持。我们还要感谢Alessia Galante在实验中的技术支持。本文基于COST行动TRANSPAN的工作，CA21116，由COST（欧洲科学和技术合作）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
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