Summary
Prækliniske modeller sigter mod at fremme viden om kræftbiologi og forudsige behandlingseffektivitet. Dette papir beskriver dannelsen af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) med tumorvævsfragmenter. zPDX'erne blev behandlet med kemoterapi, hvis terapeutiske virkning blev vurderet med hensyn til celleapoptose i det transplanterede væv.
Abstract
Kræft er en af de vigtigste dødsårsager på verdensplan, og forekomsten af mange typer kræft fortsætter med at stige. Der er gjort store fremskridt med hensyn til screening, forebyggelse og behandling; Der mangler dog stadig prækliniske modeller, der forudsiger kræftpatienters kemosensitivitetsprofil. For at udfylde dette hul blev der udviklet og valideret en in vivo patientafledt xenograftmodel. Modellen var baseret på zebrafisk (Danio rerio) embryoner 2 dage efter befrugtning, som blev brugt som modtagere af xenograft fragmenter af tumorvæv taget fra en patients kirurgiske prøve.
Det er også værd at bemærke, at bioptiske prøver ikke blev fordøjet eller disaggregeret for at opretholde tumormikromiljøet, hvilket er afgørende med hensyn til analyse af tumoradfærd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode til etablering af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) fra primær solid tumorkirurgisk resektion. Efter screening af en anatomiopatog dissekeres prøven ved hjælp af et skalpelblad. Nekrotisk væv, kar eller fedtvæv fjernes og hakkes derefter i stykker på 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
Stykkerne mærkes derefter fluorescerende og xenotransplanteres i perivitellinerummet hos zebrafiskembryoner. Et stort antal embryoner kan behandles til en lav pris, hvilket muliggør in vivo-analyser med høj kapacitet af zPDX'ers kemofølsomhed over for flere kræftlægemidler. Konfokale billeder erhverves rutinemæssigt for at detektere og kvantificere de apoptotiske niveauer induceret af kemoterapibehandling sammenlignet med kontrolgruppen. Xenograftproceduren har en betydelig tidsfordel, da den kan gennemføres på en enkelt dag, hvilket giver et rimeligt tidsvindue til at udføre en terapeutisk screening for cokliniske forsøg.
Introduction
Et af problemerne med klinisk kræftforskning er, at kræft ikke er en enkelt sygdom, men en række forskellige sygdomme, der kan udvikle sig over tid, hvilket kræver specifikke behandlinger afhængigt af selve tumorens egenskaber og patienten1. Derfor er udfordringen at bevæge sig mod patientorienteret kræftforskning for at identificere nye personaliserede strategier til tidlig forudsigelse af kræftbehandlingsresultater2. Dette er især relevant for pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), da det betragtes som en svær at behandle kræft med en 5-årig overlevelsesrate på 11%3.
Den sene diagnose, hurtige progression og mangel på effektive terapier forbliver de mest presserende kliniske problemer med PDAC. Den største udfordring er derfor at modellere patienten og identificere biomarkører, der kan anvendes i klinikken for at vælge den mest effektive terapi på linje med personlig medicin 4,5,6. Over tid er der blevet foreslået nye tilgange til modellering af kræftsygdomme: patientafledte organoider (BDO'er) og musepatientafledte xenotransplantater (mPDX'er) stammer fra en kilde til humant tumorvæv. De er blevet brugt til at reproducere sygdommen for at studere responsen og modstanden mod terapi samt sygdomsgentagelse 7,8,9.
På samme måde er interessen for zebrafiskbaserede patientafledte xenograftmodeller (zPDX) steget takket være deres unikke og lovende egenskaber10, hvilket repræsenterer et hurtigt og billigt værktøj til kræftforskning11,12. zPDX-modeller kræver kun en lille tumorprøvestørrelse, hvilket gør screening med høj kapacitet af kemoterapi mulig13. Den mest almindelige teknik, der anvendes til zPDX-modeller, er baseret på fuldstændig prøvefordøjelse og implantation af de primære cellepopulationer, som delvist reproducerer tumoren, men har ulemperne ved mangel på tumormikromiljø og krydstale mellem ondartede og sunde celler14.
Dette arbejde viser, hvordan zPDX'er kan bruges som en præklinisk model til at identificere kemofølsomhedsprofilen hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Den værdifulde strategi letter xenograft-processen, da der ikke er behov for celleudvidelse, hvilket muliggør acceleration af kemoterapiscreeningen. Modellens styrke er, at alle mikromiljøkomponenterne opretholdes som de er i patientens kræftvæv, fordi tumorens opførsel som bekendt afhænger af deres samspil15,16. Dette er yderst gunstigt i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er muligt at bevare tumorheterogeniteten og bidrage til at forbedre forudsigeligheden af behandlingsresultatet og tilbagefald på en patientspecifik måde, hvilket gør det muligt at anvende zPDX-modellen i co-kliniske forsøg. Dette manuskript beskriver de trin, der er involveret i at lave zPDX-modellen, startende med et stykke patientstumorresektion og behandle det for at analysere responsen på kemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det italienske ministerium for folkesundhed godkendte alle de beskrevne dyreforsøg i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU om brug og pasning af dyr. Den lokale etiske komité godkendte undersøgelsen under registreringsnummer 70213. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle involverede forsøgspersoner. Før start skal alle opløsninger og udstyr forberedes (afsnit 1), og fisken skal krydses (afsnit 2).
1. Fremstilling af opløsninger og udstyr
BEMÆRK: Se tabel 1 for de opløsninger og medier, der skal fremstilles.
- Agarose gel støtte
- Agarosepulveret afvejes i en mikrobølgeovn, og det opløses i et givet volumen E3-zebrafiskmedium til en 1 % gel. Opvarm i en mikrobølgeovn, indtil agaroseen er helt opløst.
BEMÆRK: Kog ikke opløsningen for meget. - Hæld den smeltede agarose i en petriskål og vent, indtil gelen er helt størknet.
- Lav små agarosecylindre (~ 5 mm høje) ved hjælp af en plastik Pasteur-pipette med spidsen afskåret. Når den er tilberedt, opbevares den i en petriskål ved 4 °C indpakket i aluminiumsfolie.
- Agarosepulveret afvejes i en mikrobølgeovn, og det opløses i et givet volumen E3-zebrafiskmedium til en 1 % gel. Opvarm i en mikrobølgeovn, indtil agaroseen er helt opløst.
- Mikronåle af glas
- Træk borosilikatglaskapillærerne med en aftrækker for at opnå fine nåle (indstillinger: HEAT 990, PULL 550).
BEMÆRK: Fra en kapillær er det muligt at opnå to fine nåle med en spidsdiameter på 10 μm.
- Træk borosilikatglaskapillærerne med en aftrækker for at opnå fine nåle (indstillinger: HEAT 990, PULL 550).
2. Fiskekrydsning og ægopsamling
- Overfør voksne fisk i avlstanke 3 dage før vævsimplantation, som beskrevet af Avdesh et al.17.
- BEMÆRK: Et forhold på 1: 1 eller 2: 3 mænd til kvinder anbefales. Fisketætheden bør maksimalt være fem fisk pr. Liter vand. Hold hanner og hunner adskilt med en barriere natten over.
- Den næste dag skal du fjerne barrieren og lade fisken parre sig.
- Fjern fiskene fra avlstankene og returner dem til deres boligtanke.
- Hæld vandet fra avlstanken gennem et finmasket net. Overfør de befrugtede æg til en petriskål med E3 zebrafiskmedium.
- Kontroller petriskålen med et stereomikroskop og kassér de uklare æg. De befrugtede æg opbevares i frisk E3-zebrafiskmedium ved 28 °C.
3. Prøvesamling
BEMÆRK: Autoklave tang og et skalpelhåndtag.
- Øjeblikkelig behandling
- Den kirurgiske prøve af tumor opsamles i 10 ml tumormedium ved 4 °C (tumorprøve fra 5 mm til 10 mm i diameter). Prøven overføres ved 4 °C fra det ønskede sted til øjeblikkelig behandling.
- Opbevaring natten over (valgfrit)
- Den kirurgiske tumorprøve opsamles i 10 ml tumormedium og opbevares natten over ved 4 °C.
- Opbevaring ved -80 °C (valgfrit, mindst anbefalet)
- Prøven opbevares ved -80 °C i et kryogent hætteglas med tumormedium suppleret med 5 % dimethylsulfoxid (DMSO).
4. Behandling af prøver
BEMÆRK: Udfør trinnene under en steril vævskultur laminar strømningshætte.
- Hele tumorvævet vaskes med 5 ml frisk tumormedium, pipetteres 10x op og ned ved hjælp af en plastik Pasteur-pipette. Opsug og kassér vaskemediet. Gentag dette trin 3x.
BEMÆRK: Undgå aspiration af tumorvævet, da det kan forblive fastgjort til plastikpipetten Pasteur. - Overfør prøven i en petriskål og sænk den i 1-2 ml frisk tumormedium. Skær tumorprøven i små stykker (1-2 mm3) ved hjælp af et skalpelblad og læg dem i et sterilt 5 ml plastrør med tumormedium.
- Indstil McIlwain-vævshakkeren til 100 μm tykkelse. Placer prøvefragmenterne på helikopterens cirkulære plastbord og hak dem. Drej bordet 90° og gentag hakningen.
- Fragmenterne centrifugeres ved 300 × g i 3 min. Derefter suges supernatanten forsigtigt til og kasseres den.
- Fragmenterne inkuberes med en fluorescerende celletracker, CM-DiI (slutkoncentration på 10 μg/ml i Dulbeccos fosfatbufferede saltvand [DPBS]), Deep Red (slutkoncentration på 1 μL/ml i DPBS) eller CellTrace (slutkoncentration på 5 μM i DPBS) i 30 minutter, idet røret anbringes i et 37 °C vandbad.
- Resuspender fragmenterne ved forsigtigt at pipettere op og ned hvert 10. minut.
BEMÆRK: I tilfælde af CellTrace tilsættes medium, der indeholder mindst 1% protein ved inkubationens afslutning i henhold til producentens anvisninger. - Der centrifugeres ved 300 x g i 3 min. og supernatanten kasseres. Gentag dette trin 3x med 1 ml DPBS for at fjerne ikke-inkorporeret farvestof.
- Ophæng fragmenterne i 5 ml DPBS i en 60 mm petriskål.
BEMÆRK: Sørg for, at vævet ikke tørrer ud.
5. Etablering af zPDX
BEMÆRK: Udfør trinnene under en steril vævskultur laminar strømningshætte.
- Bedøv de 2 dage efter befrugtning (dpf) embryoner med 0,16 mg / ml tricain i E3 zebrafisk medium.
- Sæt tre agarosecylindre (trin 1.1.3) i en petriskål og læg et zebrafiskembryo på en cylinder, der udsætter den ene side. Fjern overskydende opløsning for at holde embryoet i bare en tynd film.
- Overfør stykket farvet væv med sterile tang fra petriskålen til 1% agarosestøtten, hvor embryoet ligger. Tag vævet op, læg det oven på embryoblommen, og skub det derefter ind i perivitellinerummet ved hjælp af den varmetrukne glasmikronål (trin 1.2.1).
- Tilsæt forsigtigt nogle dråber E3 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep) til embryoet for at bringe det tilbage i væsken.
- Trin 5.2-5.4 gentages for alle embryonerne, og til sidst fjernes agarosestøtterne fra petriskålen og embryonerne inkuberes ved 35 °C.
- Kontroller embryonerne for de korrekte xenotransplantater (positiv farvning) 2 timer efter implantation ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop. Kassér embryonerne med tumorfragmenter, der ikke er helt inde i perivitellinerummet, såvel som de døde embryoner. Embryonerne fordeles tilfældigt i seks plader med flere brønde (maks. n = 20 embryoner/brønd), ligeligt opdelt i grupper i henhold til forsøgsplanen (f.eks. kontrol og FOLFOXIRI).
6. Behandling
- Fortynd lægemidlet (f.eks. 5-fluorouracil, oxaliplatin, irinotecan) i E3 1% Pen-Strep, bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange. Som foreslået af Usai et al.12, brug en fem gange fortynding af lægemidlet i fiskevandet med hensyn til den ækvivalente plasmakoncentration (EPC).
- Bland stofferne for at forberede cocktailen (f.eks. FOLFOXIRI).
- Fjern medierne fra hver brønd og tilsæt lægemiddelcocktailen 2 timer efter implantation.
- Behandl embryonerne i 3 dage. Forny lægemiddelcocktailen hver dag.
7. Helmonteret immunofluorescerende farvning
BEMÆRK: Før du starter, anbringes acetone ved -20 °C, og opløsningen i tabel 1 tilberedes.
- Dag 1:
- Larverne fikseres med 1 ml 4% paraformaldehyd i hætteglas af glas ved 4 °C natten over.
- Dag 2:
- Larverne vaskes 3 x 5 min med 1 ml PBS, mens de omrøres forsigtigt på en vippeknap til laboratorieplatformen (400 omdr./min.).
- Opbevares i 1 ml 100% methanol ved -20 °C natten over (eller til langtidsopbevaring).
- Rehydrer 3 x 10 min med 1 ml PTw (0,1% tween i PBS), omrør forsigtigt på en laboratorieplatformvipper (400 o / min).
- Permeabilize med 1 ml 150 mM Tris-HCl ved pH 8,8 i 5 minutter ved RT, efterfulgt af opvarmning i 15 min ved 70 °C.
- Vask 2 x 10 min med 1 ml PTw, omrør forsigtigt på en laboratorieplatformvipper (400 o / min).
- Vask 2 x 5 min med 1 ml dH2O, omrør forsigtigt på en laboratorieplatformvipper (400 o / min).
- Permeabilize med 1 ml iskold acetone i 20 min ved -20 °C.
- Vask 2 x 5 min med 1 ml dH2O, omrør forsigtigt på en laboratorieplatformvipper (400 o / min).
- Vask 2 x 5 min med 1 ml PTw, omrør forsigtigt på en laboratorieplatformvipper (400 o / min).
- Larverne inkuberes i 1 ml blokerende buffer i 3 timer ved 4 °C, mens de omrøres forsigtigt på en vippeknap til laboratorieplatformen (400 omdr./min.).
- Larverne anbringes i brøndplader opdelt pr. gruppe som følger: 10 larver i 50 μL volumen/brønd i en 96-brøndplade eller 20 larver i 100 μL volumen/brønd i en 48-brønds plade.
- Kassér blokeringsbufferen, inkuber larverne med primær antistofopløsning (f.eks. kanin-anti-human spaltet caspase-3, 1:250) fortyndet i inkubationsbuffer natten over ved 4 °C i mørke, og vugges forsigtigt på en rysteplade (400 omdr./min.). Se trin 7.2.11 for anbefalede diskenheder.
- Dag 3:
- Larverne vaskes sekventielt 3 x 1 time med 1 ml PBS-TS (10 % gedeserum, 1 % Triton X-100 i PBS) og derefter med 2 x 10 minutter med 1 ml PBS-T (1 % Triton X-100 i PBS) og 2 x 1 time med 1 ml PBS-TS. I hver vask omrøres forsigtigt pladerne, der indeholder larverne, på en rysteplade (400 o / min).
- Larverne inkuberes med fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer (f.eks. gedeantikanin IgG [H+L] krydsadsorberet sekundært antistof, Alexa Fluor 647, 1:500) og 100 μg/ml Hoechst 33258 fortyndet i inkubationsbuffer i mørke natten over ved 4 °C under forsigtig omrøring på en rysteplade (400 omdr./min.). Se trin 7.2.11 for anbefalede mængder sekundær antistofopløsning.
- Dag 4:
- Vask 3 x 1 time med 1 ml PBS-TS og 2 x 1 time med 1 ml PTw, med let omrøring på en rysteplade (400 o / min).
- Opret et cirkulært lag med emaljen (tykkelse på ~ 0,5-1 mm) på mikroskopglas. Lad emaljen tørre ud og læg larverne i midten af det cirkulære lag og udsæt siden af xenograften.
- Tør den overskydende opløsning, og monter glasdækslet med et vandopløseligt, ikke-fluorescerende monteringsmedium.
8. Billedbehandling
- Tag billeder under konfokal mikroskopi med et 40x mål. Brug følgende anskaffelsesparametre: en opløsning på 1024 x 512 pixels med en Z-afstand på 5 μm.
9. Analyse af apoptose af ImageJ
- Indlæs (Fiji Is Just) ImageJ-software (https://imagej.net/Fiji/Downloads), og åbn Z-stack-filaftrykket (klik på Filer | Åben). I pop op-vinduet skal du vælge Stakvisning/Hyperstack og klikke på OK.
- Overlejr de forskellige kanaler ved at vælge Billede | Farve | Lav komposit.
- Træk Z-bjælken nederst i billedet for at gennemse Z-stack-billedet og identificere xenograftområdet (celler, der er fluorescerende cellesporingspositive. Se trin 4.5) i zebrafiskens perivitellinerum.
- Vælg Punktværktøj , og tæl antallet af apoptotiske humane celler (positiv til fluorescerende celletracker og spaltet caspase-3), som vist i supplerende video S1.
- Dobbeltklik på ikonet Point Tool , skift tæller, og tæl det samlede antal humane cellekerner (kerner af CM-DiI-positive celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver den eksperimentelle tilgang til etablering af zPDX'er fra primært humant pancreas adenocarcinom. En tumorprøve blev opsamlet, hakket og farvet ved hjælp af fluorescerende farvestof, som beskrevet i protokol afsnit 4. zPDX'er blev derefter med succes etableret ved implantation af et stykke tumor i perivitellinerummet af 2 dpf zebrafiskembryoner, som beskrevet i protokolafsnit 5. Som beskrevet i protokolafsnit 6 blev zPDX'erne yderligere screenet for at identificere kemoterapifølsomhedsprofilerne for patientafledte kræftceller. For eksempel blev kemoterapikombinationen FOLFOXIRI (5-fluorouracil, folinsyre, oxaliplatin og irinotecan) testet, da den anvendes som førstelinjekemoterapi til avanceret pancreas ductal adenocarcinom og i metastatisk kolorektal cancer. Helmonterede billeder af zPDX'erne blev erhvervet som Z-stakke på det konfokale mikroskop, og apoptoseinduktionen blev analyseret som beskrevet i protokolafsnit 8 og 9. Som vist i figur 1A,B førte den kombinerede behandling til en stigning i celleapoptose sammenlignet med kontrolgruppen. I det casestudie, der er rapporteret her, blev der identificeret en statistisk signifikant stigning i fraktionen af apoptotiske celler i implanterede xenotransplantater for den FOLFOXIRI-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen (figur 1C).
| Figur 1: zPDX'er fra humant pancreas ductal adenocarcinom 3 dage efter behandling med FOLFOXIRI. Cellemembranerne blev farvet med CM-DiI (rød), og vævet blev xenopodet ind i perivitellinerummet hos 2 dpf AB vildtype zebrafisk. Larverne blev eksponeret for en kombination af FOLFOXIRI (0,216 mg/ml 5-fluorouracil, 0,013 mg/ml folinsyre, 0,006 mg/ml oxaliplatin, 0,011 mg/ml irinotecan) eller ikke eksponeret (CTRL) i 3 dage, fikseret og immunfarvet med spaltet caspase-3-antistof (cyan) og modfarvet af Hoechst (blå kerner). Larver blev monteret med Aqua Poly-Mount i glasmikroskopglas. (A1-3) Repræsentativt eksempel på en kontrollarve (ikke udsat for kemoterapi). Der blev ikke observeret spaltede caspase-3-positive celler. (B1-3) Repræsentativt eksempel på en xenograferet larve 3 dage efter behandling med FOLFOXIRI, der viser konsekvent aktivering af spaltet caspase-3. Helmonterede billeder blev taget på et Nikon A1 konfokalmikroskop med et digitalt kamera. De stiplede linjer viser xenograftområderne. C) Kvantificering af spaltede caspase-3 og CM-DiI dobbeltpositive celler i xenograferede larver behandlet med FOLFOXIRI sammenlignet med CTRL, plottet som gennemsnit ± SEM (n ≥ 12) p < 0,001, Mann-Whitney U-test. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: zPDX = zebrafisk patientafledt xenograft; dpf = dage efter befrugtning; FOLFOXIRI = 5-fluorouracil, folinsyre, oxaliplatin og irinotecan; CTRL = kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur. |
| Opløsning/medium | Sammensætning, kommentarer | Formål | ||
| Tumor medium (1x) | Til RPMI-1640 medium tilsættes penicillin-streptomycin (slutkoncentration 100 U / ml) og amphotericin (slutkoncentration 2,50 μg / ml). | |||
| E3 zebrafisk medium (1x) | 60x E3-embryomediet (NaCl3 M, KCl 0,1 M,CaCl2 0,2 M,MgSO4 0,2 M) fortyndes i deioniseret vand til en endelig arbejdskoncentration på 1x. | |||
| E3 1% Pen-Strep | Tilsæt 1 ml penicillin-streptomycin til 99 ml E3 zebrafiskmedium. Bland ved inversion. Opbevar opløsningen ved 4 °C | |||
| Ptw | 0,1% Tween i PBS | Helmonteret immunfarvning | ||
| Blokering af buffer | 10% gedeserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw | Helmonteret immunfarvning | ||
| Inkubationsbuffer | 1% gedeserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 i PTw | Helmonteret immunfarvning | ||
| PBS-TS | 10% gedeserum, 1% Triton X-100 i PBS | Helmonteret immunfarvning | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 i PBS | Helmonteret immunfarvning | ||
Tabel 1: Opløsninger og medier anvendt i protokollen.
Supplerende figur S1: PDAC-tumorprøve blev DiO-farvet (grøn) og xenograferet ind i perivitellinerummet hos 2 dpf zebrafiskembryoner. Efter en 3-dages inkubationstid blev zPDX'er injiceret med 2 μg/ml propidiumiodid (PI; rød) og derefter udsat for 3D-konfokal billeddannelse. Cellelevedygtigheden blev kontrolleret ved at måle PI-positive celler ud af det samlede antal humane celler (DiO-positive). Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; dpf = dage efter befrugtning; zPDX = zebrafisk patientafledt xenograft. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video S1: Eksempel på apoptotisk human celletælling ved hjælp af flerpunktsværktøjet i ImageJ. Videoen er en Z-stak af en zPDX 3 dage efter implantation, erhvervet efter spaltet caspase-3 og Hoechst 33258 immunfarvning. Forkortelser: zPDX = zebrafisk patientafledt xenograft. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo-modeller i kræftforskning giver uvurderlige værktøjer til at forstå kræftbiologi og forudsige kræftbehandlingsresponsen. I øjeblikket findes der forskellige in vivo-modeller , f.eks. genetisk modificerede dyr (transgene mus og knockout-mus) eller patientafledte xenotransplantater fra humane primære celler. På trods af mange optimale funktioner har hver enkelt forskellige begrænsninger. Især mangler de ovennævnte modeller en pålidelig måde at efterligne patientens tumorvævsmikromiljø på.
Det er blevet foreslået, at tumormikromiljøet kan spille mange vigtige roller i lægemiddelrespons18. For at finde en passende dyremodel, der opretholder tumorvævets mikromiljø, blev der derfor udviklet en alternativ PDX-model ved hjælp af stykker tumorvæv xenopodet i 2 dpf zebrafiskembryoner. Protokollen beskriver, hvordan man udfører xenotransplantater i et stort antal embryoner, hvilket muliggør screening af lægemidler med høj kapacitet, både som enkeltmidler og i kombinationer.
Nøglepunktet i denne innovative tilgang er, at den bevarer både celle-celle-interaktioner og tumormikromiljøet sammenlignet med de almindeligt udførte zPDX'er med enkeltcellesuspensioner. PDAC fra en kirurgisk prøve sættes straks i friske og kolde tumormedier, og tumoren hakkes i små fragmenter. Den overordnede procedure, der anvendes til at generere zPDX-modellen, er baseret på direkte implantation af et fragment fra en patients tumor ind i perivitellinerummet i et 2 dpf zebrafiskembryo.
Den foreslåede model kunne tjene som et alternativ til PDX-modellen baseret på fordøjelsen af den patientafledte tumorvævsprøve efterfulgt af direkte injektion i æggeblommesækken eller i perivitellinerummet. Som det fremgår af Fior et al.'s arbejde, er det muligt at etablere en zAvatar-model fra den enzymatiske dissektion af kirurgisk resekterede pancreatobilære kræftformer. Implantationshastigheden varierede mellem 44% og 64% på grund af den typiske lave cellularitet af tumorbugspytkirtelprøven og den ugunstige tætte desmoplastiske stroma19.
Imidlertid reproducerede cellesuspensionen kun delvist den oprindelige tumor14. Omvendt ligner mPDX, konstrueret ved direkte transplantation af tumorvæv i immunodeficiente mus, bedst den oprindelige tumor, som bedre kan hjælpe klinikere med at forstå tumoradfærd og evaluere individuelle reaktioner før behandling20. Faktisk opretholder det lille, indpodede fragment tumormikromiljøet og bevarer krydstalen mellem ondartede og sunde celler, svarende til den oprindelige tumor21. Kemosensitiviteten eller kemoresistensen gengives således bedre med en direkte virkning af zPDX-teknologien inden for translationel onkologi14. zPDX-tilgangen gør det muligt for hver patient at få deres egen tumor udviklet i et levende system. Dette repræsenterer således et godt alternativ til brugen af mPDX, hvor tumorvævet ortopodes intakt eller disaggregeres i celler, som derefter xenopodes i musemodtagermodeller13.
Denne protokol blev udviklet i samarbejde med patologer, der er ansvarlige for at vælge de mest egnede tumorstykker til transplantation. Biologiske vævsprøver er altid blevet taget fra den kirurgiske prøve og aldrig fra en biopsi, da sidstnævnte normalt er karakteriseret ved mangel på væv og derfor kun er bestemt til diagnostiske formål. Kriteriet for vævsprøveudtagning er normalt ikke marginal versus kerne, men snarere et tumorområde, der er blottet for blødning og nekrose. Af denne grund blev der altid udført en kryostat histologisk sektion på den ene halvdel af prøven for øjeblikkelig kvalitetskontrol af materialet. Den foreliggende undersøgelse kan være begrænset af de primære tumorcellers evne til at indpode i perivitellinerummet hos zebrafiskembryoner. Imidlertid blev der observeret en 80% engraftmenthastighed af levedygtigt væv 3 dage efter transplantation, både efter opbevaring ved 4 ° C (12/15 tilfælde) og optøet fra -80 ° C (10/12 tilfælde), hvilket tyder på, at tumoren effektivt kan kryopræserveres med en cellelevedygtighed på 74% ± 2% (supplerende figur S1). På trods af dette varierer succesraten for vævsindgravering mellem forskellige PDAC-patienttumorer; Derfor kan den hurtige behandling af vævet kort efter den kirurgiske resektion samt forhindre frysning øge effektiviteten.
Nogle tekniske udveje foreslås også i protokollen for vellykkede xenotransplantater. For eksempel standardiserede brugen af helikopteren dimensionerne på de xenograferede stykker. For at kontrollere, at stykkerne af tumorvæv er ens i dimension efter hakningen, er en potentiel løsning at bruge et kalibreringsglas til at måle diameteren af fragmenterne før xenotransplantation.
Brugen af 1% agarosecylinderstøtten er afgørende for både at lægge embryonerne på den ene side og blot implantere et stykke tumor samt for at forhindre at bryde mikronålen. Fordi tumorer udviser en høj variabilitet, er en anden begrænsning af metoden, at den intratumorale heterogenitet er mindre repræsenteret i et fragment sammenlignet med en cellulær suspension. Faktisk kan små vævsstykker afvige med hensyn til godartede cellepopulationer og tumorsubkloner. For at overvinde denne kritik bør et stort antal injicerede embryoner anvendes til at rekapitulere tumorheterogeniteten og reducere variabiliteten i analysen. Ifølge den statistiske analyse kræver hver gruppe en stikprøvestørrelse større end 15, i betragtning af en effektstørrelse på d = 2 og en effekt på 80% og 95% statistisk signifikans. Dette tal er rimeligt, da en ekspertoperatør kan behandle ca. 40 embryoner i timen.
Ud over den metode, der blev brugt til at generere zPDX-modellen, blev det også bevist her, at en FOLFOXIRI-kombination inducerer apoptose af patientafledte celler i zPDX-modellen. Som med folfoxiri er det muligt at teste zPDX-kemofølsomheden over for andre kemoterapiordninger, såsom dem, der med succes er testet af Usai et al.11.
Derudover præsenteres teknikken til helmonteret immunfarvning og billeddannelse for at tilvejebringe kvantificeringen af funktionen af interesse. For at overvinde nogle problemer og føre til vellykket helmonteret immunfarvning anbefales en 5% DMSO-opløsning til permeabilisering af vævene. Med hensyn til den konfokale billeddannelse kan opløsningsbegrænsningerne for det konfokale mikroskop forringe erhvervelsen af de dybere stakke af de xenograferede larver. I undersøgelsen tælles de apoptotiske celler imidlertid ud af det samlede antal patientceller. En tredimensionel rekonstruktion fra basen til toppen af den implanterede tumormasse med en trinstørrelse på 5 μm gør det muligt at identificere alle de menneskelige kerner under hensyntagen til sandsynligheden for, at den samme kerne kan sprede sig inden for det forrige eller næste Z-plan. Derfor kan ImageJ-flerpunktsværktøjstælleren bruges til at kontrollere og forhindre tælling af den samme celle to gange og til at køre dobbelttælling i de samme Z-stakke (apoptotisk ud af samlede humane celler) og kan let spore apoptose på enkeltcelleniveau.
På trods af sine begrænsninger har zPDX-modellen flere fordele sammenlignet med in vivo-modeller : zebrafiskens ekstremt hurtige livscyklus, at kunne opnå et stort antal dyr på kort tid; den optiske klarhed i udviklingsfaserne og frem for alt den ekstremt lave etiske indvirkning i tidsvinduet 0-120 timer efter befrugtning22. I dag er et co-klinisk forsøg med zPDX'er billigere end det, der udføres med musebaserede PDX'er, da immundefekte værtsstammer kræver høje vedligeholdelsesomkostninger samt komplekse billeddannelsesmetoder til overvågning af tumorvækst23. Afslutningsvis fremhæver alle disse faktorer potentialet i zPDX-modellen til brug i co-kliniske forsøg til forudsigelse af kemoterapifølsomhedsprofiler hos kræftpatienter og til brug for forskere, der er interesserede i nye modeller til lægemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Fondazione Pisa (projekt 114/16). Forfatterne vil gerne takke Raffaele Gaeta fra Histopatologisk Enhed i Azienda Ospedaliera Pisana for patientprøveudvælgelsen og patologistøtten. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske support i eksperimenterne. Denne artikel er baseret på arbejde udført af COST Action Transpan, CA21116, støttet af COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
