Este protocolo describe un método para establecer y realizar un ensayo de herida por rasguño en monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides tridimensionales (3D) aislados del íleon de primates no humanos.
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Artículo de método
Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los ensayos de heridas por rasguño in vitro se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos y características de la curación epitelial en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, describimos un protocolo para generar una monocapa bidimensional (2D) a partir de enteroides de primates no humanos tridimensionales (3D) derivados de criptas intestinales del íleon terminal. Estas monocapas derivadas de enteroides se utilizaron en un ensayo in vitro de herida por rasguño para probar la capacidad del hialuronano 35 kDa (HA35), un imitador de HA de la leche humana, para promover la migración y proliferación celular a lo largo del borde de la herida epitelial. Después de que las monocapas se cultivaron hasta la confluencia, se rayaron manualmente y se trataron con HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) o control (PBS). La migración celular y la proliferación en la brecha se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de luz transmitida equipado para imágenes de células vivas. El cierre de la herida se cuantificó como porcentaje de cicatrización de heridas utilizando el complemento Wound Healing Size en ImageJ. El área de rasguño y la tasa de migración celular y el porcentaje de cierre de la herida se midieron durante 24 h. HA35 in vitro acelera la cicatrización de heridas en monocapas enteroides del intestino delgado, probablemente a través de una combinación de proliferación celular en el borde de la herida y migración al área de la herida. Estos métodos pueden usarse potencialmente como modelo para explorar la regeneración intestinal en el intestino delgado humano prematuro.
Introducción
La enterocolitis necrosante (ECN) es una de las urgencias gastrointestinales más frecuentes en lactantes prematuros1. La enfermedad se caracteriza por una inflamación intestinal severa que puede deteriorarse rápidamente a necrosis intestinal, sepsis y potencialmente la muerte. Aunque la etiología no está clara, la evidencia sugiere que la ECN es multifactorial y el resultado de una compleja interacción de alimentación, colonización bacteriana anormal y epitelio intestinal inmaduro 2,3. Los lactantes prematuros tienen mayor permeabilidad intestinal, colonización bacteriana anormal y baja....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Después de la aprobación institucional, se obtuvieron muestras fetales de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% gestación, babuino oliva, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I)20.
1. Establecimiento de enteroides intestinales 3D de primates no humanos prematuros
- Preparación de los medios
NOTA: L....
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Resultados
Los efectos de la AH en la reparación de tejidos y la cicatrización de heridas en diversos tejidos y órganos están bien documentados; sin embargo, actualmente se desconocen los efectos específicos del AH con un peso molecular de 35 kDa sobre la cicatrización y regeneración fetal o neonatal del intestino delgado. Para probar la capacidad de HA35 para promover la cicatrización de heridas en un modelo del intestino delgado fetal o neonatal, generamos enteroides intestinales 3D a partir de tejido ileal NHP y disociamos aún m.......
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Discusión
El tracto gastrointestinal de un recién nacido prematuro está bajo presión regenerativa continua por exposiciones repetidas a insultos ambientales asociados con disbiosis, metabolitos y toxinas bacterianas inflamatorias, e hipoxia intermitente23,24. Desafortunadamente, el epitelio intestinal del recién nacido prematuro es incapaz de establecer rápidamente la integridad funcional23, lo que resulta en disfunción de barrera, aumento de la per.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children's Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Los servicios de imágenes de células vivas proporcionados por el núcleo de Genómica Funcional del Cáncer fueron apoyados en parte por la Subvención P20GM103639 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la Subvención P30CA225520 del Instituto Nacional del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer, oto....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 mL Pipeta serológica | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Plato, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Tubo cónico | VWR | 89039-666 | |
| 24 pocillos, tratado con TC, placa de fondo plano | Corning | 3524 | |
| 37 µ M Filtro de células reversible | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Tubo cónico | VWR | 89039-658 | |
| 70 µ m Filtros de células estériles | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albúmina, Bovino (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Adiestrado de águila modificado/nutriente Mezcla de jamón F-12 (DMEM-F12) con tampón HEPES de 15 mM | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Reactivo de disociación | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Instrumento de análisis de células vivas | Sartorius | 4647 | |
| Módulo de software de análisis de heridas por arañazo de incucyte | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (humano) | STEMCELL Technologies | 06010 | Esto es HOGMY, pero sin el Y-27632 ni antibióticos. También se utiliza como base para HOGM, pero luego solo faltan los antibióticos. |
| Lipopolisacáridos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografía de filtración en gel | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Matriz de membrana basal reducida (GFR) con factor de crecimiento (GFR), sin rojo de fenol | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell de 96 pocillos, Nunclon con tratamiento Delta, microplaca de fondo plano | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato), 1X [-] Calcio, magnesio, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Se trata de antibióticos de amplio espectro |
| Hialuronato de sodio, grado de investigación, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Contador de células automatizado | Compañía: Bio-Rad | 1450102 | |
| Tripsina-EDTA 1X, 0.25% Tripsina | Fisher Scientific MT25053CI | ||
| Y-27632 | Tecnologías STEMCELL | 72302 |
Referencias
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
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Reimpresiones y permisos
