Summary
Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.
Abstract
I saggi in vitro delle ferite da graffio sono comunemente usati per studiare i meccanismi e le caratteristiche della guarigione epiteliale in una varietà di tipi di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per generare un monostrato bidimensionale (2D) da enteroidi primati non umani tridimensionali (3D) derivati da cripte intestinali dell'ileo terminale. Questi monostrati derivati da enteroidi sono stati poi utilizzati in un test in vitro per testare la capacità dell'acido ialuronico 35 kDa (HA35), un imitatore di HA del latte umano, di promuovere la migrazione e la proliferazione cellulare lungo il bordo della ferita epiteliale. Dopo che i monostrati sono cresciuti fino alla confluenza, sono stati graffiati manualmente e trattati con HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) o controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l'imaging di cellule vive. La chiusura della ferita è stata quantificata come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size in ImageJ. L'area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell'arco di 24 ore. HA35 in vitro accelera la guarigione delle ferite nei piccoli monostrati enteroidi intestinali, probabilmente attraverso una combinazione di proliferazione cellulare sul bordo della ferita e migrazione verso l'area della ferita. Questi metodi possono potenzialmente essere utilizzati come modello per esplorare la rigenerazione intestinale nell'intestino tenue umano pretermine.
Introduction
L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una delle emergenze gastrointestinali più comuni nei neonati pretermine1. La malattia è caratterizzata da una grave infiammazione intestinale che può rapidamente deteriorarsi in necrosi intestinale, sepsi e potenzialmente morte. Sebbene l'eziologia non sia chiara, l'evidenza suggerisce che la NEC è multifattoriale ed è il risultato di una complessa interazione di alimentazione, colonizzazione batterica anormale e epitelio intestinale immaturo 2,3. I neonati pretermine hanno aumentato la permeabilità intestinale, la colonizzazione batterica anormale e una bassa capacità rigenerativa degli enterociti4,5, aumentando il rischio di disfunzione della barriera intestinale, traslocazione batterica e sviluppo di NEC. Pertanto, identificare strategie o interventi per accelerare la maturazione epiteliale intestinale e promuovere la rigenerazione o la guarigione dell'epitelio intestinale è fondamentale per prevenire questa malattia mortale.
Gli studi hanno dimostrato che il latte umano (HM) è protettivo contro NEC nei neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. Studi sia sull'uomo che sugli animali hanno dimostrato che la formula a base bovina aumenta la permeabilità intestinale ed è direttamente tossica per le cellule epiteliali intestinali 2,12. Sebbene non completamente chiarito, l'evidenza suggerisce che gli effetti protettivi dell'HM sono mediati attraverso componenti bioattivi come la lattoferrina, l'immunoglobulina A (IgA) e gli oligosaccaridi HM13. HM è anche ricco di acido ialuronico (HA), un glicosaminoglicano unicamente non solfato con acido D-glucuronico ripetuto e disaccaridi N-acetil-D-glucosamina14,15. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che 35 kDa HA orale (HA35), una imitazione HM HA, attenua la gravità del danno intestinale, previene la traslocazione batterica e diminuisce la mortalità in un modello murino di danno intestinale simile a NEC16,17.
Qui, gli effetti di HA35 sulla guarigione intestinale e sulla rigenerazione in vitro sono ulteriormente studiati. Attualmente, il test in vitro più utilizzato per le ferite e la riparazione intestinale è un test di ferita da graffio eseguito in monostrati di cellule di cancro del colon-retto (CRC). La rilevanza fisiologica di un tale modello per l'intestino infantile pretermine è limitata, poiché la riparazione delle ferite delle cellule CRC dipende fortemente dalla natura altamente proliferativa delle cellule tumorali piuttosto che dai processi di riparazione guidati dalle cellule staminali18. Per superare questa limitazione, qui viene descritta la creazione di un modello 2D di ferita da graffio enteroide, compresa la procedura di isolamento e mantenimento di enteroidi intestinali piccoli intestinali derivati da cellule staminali primarie da primati non umani pretermine (NHP). Dato che la NEC pretermine è più spesso riportata nell'intestino tenue distale, l'uso di organoidi di cellule epiteliali primarie in un modello di danno intestinale e riparazione fornisce un modello in vitro più fisiologicamente traducibile rispetto ai modelli esistenti che utilizzano monostrati colorettali tradizionali18,19.
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Protocol
Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. A seguito dell'approvazione istituzionale, campioni fetali di convenienza dell'intestino tenue da un primate non umano pretermine (NHP, gestazione al 90%, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo # 101523-16-039-I) 20.
1. Istituzione di enteroidi intestinali 3D di primati pretermine non umani
- Preparazione dei supporti
NOTA: I supporti possono essere preparati fino a 1 settimana prima dell'isolamento della cripta seguendo la tecnica asettica standard. Penicillina/streptomicina (concentrazione finale 1%) può essere utilizzata al posto degli antibiotici ad ampio spettro per le cellule primarie, se lo si desidera.- Preparare il terreno di crescita organoide umano + Y-27632 (HOGMY) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide terreno basale umano con 50 ml di integratore organoide (Tabella dei materiali). Aggiungere 200 μL di antibiotici ad ampio spettro (concentrazione finale 100 μg/ml) (tabella dei materiali) e Y-27632 (ad una concentrazione finale di 10 μM). Riscaldare sul banco a temperatura ambiente.
- Preparare il terreno di crescita organoide umano (HOGM) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide terreno basale umano con 50 ml di integratore organoide. Aggiungere 200 μL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/ml). Riscaldare sul banco a temperatura ambiente.
NOTA: HOGM verrà utilizzato quando si cambia supporto oltre i primi 2-3 giorni dopo il passaggio. - Raffreddare 100 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza calcio o magnesio fino a quando non è ghiacciata.
- Preparare 50 ml di tampone di lavaggio combinando 1x PBS senza calcio o magnesio con lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Raffreddare fino a quando non è ghiacciato.
- Preparare il tampone di lavaggio DMEM-F12 aggiungendo 1 mL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/mL) a 500 mL di DMEM/F12 (Mezzo d'aquila modificato/miscela di prosciutto nutriente F12 + 15 mM tampone HEPES). Tienilo ghiacciato.
- Isolamento e placcatura della cripta
NOTA: L'idrogel a base di matrice extracellulare (ECM) deve rimanere sul ghiaccio durante l'intera procedura. Questa procedura presuppone abbastanza tessuto per popolare sei cupole di idrogel a base di ECM. Se viene raccolta una diversa densità di cripte, il numero della cupola deve essere modificato di conseguenza.- Scongelare 150 μL di estratto di membrana basale (BME) ridotto dal fattore di crescita (GFR) (privo di rosso fenolo) durante la notte sul ghiaccio a 2-8 °C.
- Incubare una piastra di polistirene trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti, a fondo piatto, in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO2 per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Dopo l'eutanasia NHP e la raccolta di tessuti, lavare il segmento di ileo dei detriti con una punta di pipetta da 1.000 μL utilizzando 1x PBS ghiacciato in una capsula di Petri usa e getta.
NOTA: Il tessuto fresco deve essere raccolto rapidamente e mantenuto ghiacciato per raccogliere enteroidi sani. - Tagliare l'ileo longitudinalmente lungo tutto l'intestino e lavare con PBS 3x ghiacciato. Tritare il tessuto in piccoli frammenti (circa 2 mm di lunghezza) con forbici sterili su un tubo conico da 50 mL contenente 15 mL di PBS ghiacciato, a partire dalla porzione del segmento ileale più vicina al tubo.
- Utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml per interrompere le cripte con pipettaggio su e giù 5-10 volte. Lasciare che i segmenti di tessuto si depositino sul fondo del tubo, quindi rimuovere il surnatante e sostituirlo con PBS fresco e ghiacciato. Ripetere questo processo almeno 7x-10x fino a quando il surnatante è libero e privo di detriti.
- Una volta pulito, rimuovere il surnatante e risospendere le cripte in 25 ml di reagente di dissociazione cellulare. Posizionare il tubo su una piattaforma a dondolo a 20 giri / min per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il tubo dal bilanciere, lasciare che le cellule si depositino per circa 30 s a 1 minuto e rimuovere il surnatante. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio ghiacciato. Pipetta su e giù con una pipetta p1000 per dissociare ulteriormente in singole cripte.
- Filtrare il tessuto attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico da 50 ml. Risciacquare il tubo conico originale da 50 mL con 10 mL di tampone di lavaggio ghiacciato e filtrare attraverso il filtro da 70 μm per assicurarsi che tutte le cripte siano state rimosse dal tubo originale. Ripetere questo lavaggio del fazzoletto per un totale di 4 risciacqui.
- Centrifugare il filtrato a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 600 μL di HOGMY e interrompere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 200 μL. Mettere il tubo sul ghiaccio fino a quando la soluzione diventa ghiacciata.
NOTA: Se la soluzione non è ghiacciata, la cupola non manterrà la struttura corretta quando placcata. Evitare di introdurre bolle durante il pipettaggio di cupole di idrogel a base di ECM, poiché le bolle impediranno la corretta aderenza al fondo della piastra. - Aggiungere 600 μL di idrogel a base di ECM ghiacciato per sospendere il pellet cellulare e mescolare bene con una pipetta da 200 μL.
- Rimuovere la piastra a 24 pozzetti dall'incubatore e posizionarla su uno scalda a piastre a 37 °C. Pipettare 50 μL di miscela di idrogel ghiacciata a base di HOGMY/ECM al centro di 24 pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti (50 μL per cupola).
- Una volta placcate, lasciare riposare le cupole su uno scalda a 37 °C per 1 minuto per consentire l'aderenza al fondo della piastra. Capovolgere con cautela la piastra, assicurarsi che non si sia accumulata condensa sul fondo della piastra e posizionare la piastra invertita nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
- Dopo 15 minuti, ruotare la piastra con il lato destro verso l'alto e pipettare 750 μL di HOGMY a temperatura ambiente in ciascun pozzetto.
NOTA: Pipettare lentamente i supporti sulla parete laterale dei pozzetti, facendo attenzione a non interrompere la cupola di idrogel 3D a base di ECM appena formata. - Una volta che tutti i pozzetti sono stati riempiti con il media, posizionare la piastra nell'incubatore e cambiare il mezzo ogni 3 giorni con 750 μL di HOGM. Passaggio enteroidi ogni 7-10 giorni.
- Passaggio enteroide intestinale
NOTA: il seguente protocollo è per una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente enteroidi NHP a una velocità di divisione di 1:2.- Rimuovere il mezzo enteroide da ciascun pozzetto, facendo attenzione a non interrompere la cupola ECM contenente enteroidi, aggiungere 500 μL di reagente di dissociazione cellulare ghiacciato a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta da 1.000 μL e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
- Interrompere manualmente l'ECM mediante pipettaggio su e giù 8-12x. Trasferire il contenuto di 12 pozzetti in un tubo conico da 15 ml.
- Una volta che tutta la soluzione è stata raccolta dalla piastra di coltura a 24 pozzetti, aggiungere 250 μL di reagente di rottura cellulare a ciascun pozzetto per assicurarsi che tutti gli enteroidi NHP siano stati rimossi da ciascun pozzetto, aggiungendo quest'ultimo risciacquo ai tubi conici da 15 ml esistenti.
- Posizionare su una piattaforma a dondolo a 40 giri/min per 15 minuti a temperatura ambiente (20 °C). In alternativa, agitare manualmente i tubi per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 15 min, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante dai tubi da 15 mL fino a quando rimane solo il pellet.
- Aggiungere 8 ml di DMEM + antibiotici ad ampio spettro ghiacciati in un tubo conico da 15 ml, assicurandosi che il pellet sia sufficientemente distrutto. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 600 μL di HOGMY e interrompere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 1.000 μL. Mettere il tubo sul ghiaccio fino a quando la soluzione diventa ghiacciata. Una volta che la soluzione è ghiacciata, aggiungere 600 μL di ECM ghiacciato per sospendere il pellet cellulare e mescolare bene con una pipetta da 1.000 μL. Ripetere i passaggi 1.3.2.-1.3.7. per i restanti 12 pozzi.
- Per i passaggi rimanenti, fare riferimento ai passaggi 1.2.11.-1.2.16.
2. Istituzione del monostrato enteroide e del saggio della ferita da graffio
- Preparazione dei media e del trattamento
- Raffreddare 5 ml di PBS senza calcio o magnesio fino a quando non si raffredda il ghiaccio.
- Preparare il tampone di lavaggio DMEM-F12 aggiungendo 1 mL di antibiotici ad ampio spettro (100 μg/mL) a 500 mL di DMEM/F12 (Mezzo d'aquila modificato/miscela di prosciutto nutriente F12 + 15 mM tampone HEPES). Mantieni il ghiaccio freddo.
- Preparare 100 mL di HOGMY, come descritto al punto 1.1.1., e riscaldarlo sul piano di lavoro a temperatura ambiente.
- Riscaldare 25 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico allo 0,25% (EDTA) a bagnomaria a 37 °C.
- Preparare concentrazioni di 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL di HA35 per il trattamento cellulare, utilizzando PBS sterile senza calcio o magnesio come solvente. La diluizione finale di HA35 utilizzerà HOMGY come solvente.
NOTA: La preparazione di HA35 può richiedere diverse diluizioni, poiché HA35 spesso esce dalla soluzione ad una concentrazione superiore a 5 mg/ml.
- Formazione di monostrato enteroide
NOTA: la seguente procedura fornisce volumi sufficienti per la generazione di una piastra a 24 pozzetti di monostrati enteroidi. Regolare i volumi per il numero desiderato di monostrati.- Scongelare 96 μL di idrogel BME a base di ECM (privo di rosso fenolo) durante la notte su ghiaccio a 2-8 °C. Diluire l'idrogel a base di ECM in PBS ghiacciato senza calcio o magnesio in un rapporto di 1:50. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 200 μL di idrogel diluito a base di ECM ghiacciato.
- Incubare la piastra rivestita di idrogel a base ECM per un minimo di 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Aspirare il mezzo dalla piastra di coltura a 24 pozzetti contenente gli enteroidi 3D destinati ai monostrati e sostituirli con 500 μL di reagente/pozzetto di dissociazione cellulare.
- Interrompere manualmente le cupole di idrogel basate su ECM mediante pipettaggio su e giù 8x-12x e trasferire il contenuto di 12 pozzetti in un tubo conico da 15 ml.
- Lavare i 12 pozzetti vuoti con 250 μL di reagente di dissociazione cellulare per assicurarsi che tutti gli enteroidi siano stati rimossi e trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 ml. Ripetere il passaggio 2.2.5. e il punto 2.2.6. per i restanti 12 pozzetti utilizzando un secondo tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare i tubi conici a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio DMEM-F12 ghiacciato a tubi conici da 15 ml e sospendere i pellet enteroidi invertendo i tubi. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 12 mL di tripsina-EDTA a 37 °C. Mettere i tubi a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti o fino a quando le cellule appaiono solubili. Aggiungere 3 mL di tampone di lavaggio DMEM-F12 a ciascun tubo per diluire Trypsin-EDTA, mescolare capovolgendo i tubi e posizionare su ghiaccio.
- Filtrare gli enteroidi dissociati attraverso un filtro a cellule a maglie da 37 μM, raccogliendo il contenuto in tubi conici puliti da 15 ml. Centrifugare i tubi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Mentre le celle sono pellettizzate nella centrifuga, rimuovere la piastra rivestita di idrogel a base di ECM dall'incubatore e aspirare qualsiasi soluzione di idrogel a base di ECM in eccesso senza graffiare la superficie rivestita o lasciare asciugare completamente la piastra.
- Rimuovere il surnatante dai tubi conici e risospendere i pellet cellulari con 6 mL di HOMGY. Aggiungere 500 μL della sospensione combinata di 12 mL di cellule HOMGY in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita con idrogel a base di ECM ad una densità di semina di circa 3 x 105 celle/pozzetto. Ruotare la piastra con un coperchio per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno dei pozzetti.
- Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO 2, scambiando i fluidi HOMGY ogni 2 giorni fino a quando i monostrati raggiungono il >90% di confluenza.
- Trattamento monostrato e saggio della ferita da graffio
- Una volta che i monostrati raggiungono il >90% di confluenza, aspirare il mezzo per rimuovere eventuali cellule che non riescono ad attaccarsi. Trattare cellule con 500 μL di HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o PBS, disciolte in HOMGY, per 24 ore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il supporto, facendo attenzione a non interrompere la superficie del monostrato. Utilizzando una punta per pipetta da 200 μL, effettuare un graffio lineare su tutto il diametro superficiale del monostrato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non lasciare asciugare i monostrati.
- Lavare i monostrati graffiati 1x con 500 μL di 1x PBS. Aggiungere 500 μL di HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o PBS disciolto in HOMGY e trasferire la piastra allo strumento di analisi delle cellule vive (Table of Materials) all'interno di un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 .
- Sotto l'icona Schedule nel software di analisi delle celle vive (Table of Materials), fare clic sull'icona Launch Add New Vessel Wizard e impostare la frequenza di scansione per la scansione in base a una pianificazione. Creare un nuovo contenitore Whole Well in Tipo di scansione, specificare le impostazioni di scansione (ad esempio, Fase per i canali immagine e 4x per l'obiettivo) e fare clic su Avanti.
- Selezionare il produttore della targhetta e il numero di catalogo dall'elenco fornito. Sotto l'icona Pianificazione , scegliere il simbolo più in cui verrà posizionata la piastra all'interno dello strumento di analisi delle cellule vive. Selezionare il pattern di scansione desiderato, quindi creare una mappa delle lastre selezionando "+" nella pagina Layout piastra. Selezionare Differire l'analisi fino a un secondo momento, quindi impostare il programma di scansione per ogni 4 ore per 24 ore e verificare le impostazioni di acquisizione nella pagina Riepilogo della procedura guidata nave . Infine, seleziona Aggiungi alla pianificazione.
- Una volta completato il test 24, sotto l'icona Visualizza, fare doppio clic su Nome nave ed esportare immagini e filmati. Selezionare i pozzi e una serie di immagini da visualizzare ed esportare come JPEG. Analizzare le immagini per la percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size per ImageJ21, come da passaggio 2.4. sotto.
- Analisi delle ferite da graffio
- Aprire il software ImageJ. Caricare le immagini del saggio della ferita da graffio (. TIFF o .JPG).
- Selezionare Immagine > Digitare > 8 bit per modificare l'immagine da RGB a 24 bit a 8 bit. Installa il plug-in Wound Healing Size selezionando Plugin > Macro > Installa > plug-in Wound Healing Size.
- Ruota l'immagine in modo che il graffio sia verticale e inizializza il plug-in Wound Healing Size Tool.
- Selezionare i parametri del plugin nella finestra di dialogo per adattarsi al meglio alla ferita antigraffio. Impostate il valore dei parametri per le opzioni di dimensione di guarigione delle ferite come segue: Raggio finestra varianza su 20, Valore soglia su 100 e Percentuale di pixel saturi su 0,001 e scegliete Sì per Imposta scala globale. Finalizzare la selezione facendo clic sul pulsante OK . Verificare se l'area selezionata è l'area della ferita. I parametri di cui sopra possono richiedere la standardizzazione da laboratorio a laboratorio.
- Ripetere i passaggi 2.4.2.-2.4.4. per i punti temporali rimanenti per ogni scratch.
- Calcola la percentuale di guarigione della ferita dell'area del graffio delle cellule in migrazione o proliferanti nell'arco di 24 ore come segue:
% guarigione delle ferite =
dove T 0 = % Area al tempo 0 h e Tc = % Area a 0 h, 4 h, 12 h o 24 h.
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Representative Results
Gli effetti dell'HA sulla riparazione dei tessuti e sulla guarigione delle ferite in vari tessuti e organi sono ben documentati; tuttavia, gli effetti specifici dell'HA con un peso molecolare di 35 kDa sulla guarigione e rigenerazione dell'intestino tenue fetale o neonatale sono attualmente sconosciuti. Per testare la capacità di HA35 di promuovere la guarigione delle ferite in un modello dell'intestino tenue fetale o neonatale, abbiamo generato enteroidi intestinali 3D dal tessuto ileale NHP e ulteriormente dissociato questo tessuto in singole cellule per creare monostrati derivati da enteroidi 2D (Figura 1A, B). I monostrati sono stati coltivati fino alla confluenza e graffiati manualmente utilizzando una punta per pipetta P200 (Figura 1B,C). I monostrati sono stati quindi trattati con HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o di controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese ogni 4 ore per un totale di 24 ore utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l'imaging di cellule vive22. Il tasso di chiusura della ferita, una misura della velocità di migrazione cellulare, è stato quantificato utilizzando ImageJ come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il Wound Healing Size Plugin21 (Figura 2). L'area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell'arco di 24 ore (fase 2.4.6.). Come mostrato nella Figura 3, l'esposizione a HA35 ha determinato una stimolazione dipendente dalla dose e dal tempo della migrazione/proliferazione cellulare, portando ad accelerare la chiusura della ferita. HA35 a 100 μg/mL e 200 μg/mL ha aumentato significativamente la guarigione di ~1,5-2,5 volte rispetto al controllo sia a 4 h che a 12 h (*p < 0,05).
Figura 1. Generazione di enteroidi e procedura di analisi di guarigione delle ferite monostrato derivata da enteroidi. (A) Coltura di enteroidi intestinali tridimensionali di primati non umani utilizzati per dissociarsi in (B) monostrati bidimensionali. (C) I monostrati sono stati coltivati fino alla confluenza del >90% in una piastra a 24 pozzetti e quindi trattati con acido ialuronico 35 kDa o soluzione salina tamponata con fosfato per 24 ore. I monostrati sono stati quindi graffiati con una punta per pipetta P200. Barra di scala = 800 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Immagini e analisi del saggio di guarigione delle ferite. Immagini rappresentative di acido ialuronico 35 kDa (100 μg/mL, 200 μg/mL) e trattamenti di controllo di monostrati enteroidi di primati non umani. Le immagini sono state ottenute a 0 h, 4 h, 12 h, 16 h e 24 h dopo aver eseguito un scratch con una punta della pipetta P200. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 4x con lo strumento di analisi delle cellule vive e analizzate in ImageJ utilizzando il plug-in Wound Healing Size. La percentuale di guarigione delle ferite è stata calcolata dalle cellule migratorie / proliferanti nell'arco di 24 ore. Barra di scala = 800 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa (HA35) sulla guarigione delle ferite nei monostrati enteroidi. Variazione della guarigione delle ferite nel tempo nei monostrati enteroidi, dipendente dalla concentrazione del trattamento HA35. HA35 ha aumentato significativamente la guarigione delle ferite dopo 4 ore e 12 ore a 100 μg/ml e 200 μg/ml rispetto al controllo, ma i tassi di guarigione convergevano tra i trattamenti di 24 ore. La significatività è stata valutata utilizzando il t-test di Student a *p < 0,05, presentato come errore medio ± standard della media (SEM) (n = 6 pozzetti per trattamento). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il tratto gastrointestinale di un neonato pretermine è sottoposto a continua pressione rigenerativa da ripetute esposizioni a insulti ambientali associati a disbiosi, metaboliti batterici infiammatori e tossine e ipossia intermittente23,24. Sfortunatamente, l'epitelio intestinale del neonato pretermine non è in grado di stabilire rapidamente l'integrità funzionale23, con conseguente disfunzione della barriera, aumento della permeabilità intestinale e, nei casi più gravi, infiammazione intestinale dilagante e sviluppo di NEC.
I glicosaminoglicani (GAG) sono una classe di polisaccaridi prevalenti nel latte materno, che sono potenziali fattori bioattivi che proteggono dallo sviluppo di NEC15,16. L'HA è un polimero lineare di disaccaridi ripetuti di acido glucuronico e N-acetilglucosamina25,26 prodotto da sintasi ialuroniche. L'HA può avere proprietà pro- o anti-infiammatorie a seconda delle dimensioni e dell'ambiente tissutale27,28. Nell'intestino e nel colon, l'HA endogeno è presente nello spazio extracellulare adiacente alle cellule epiteliali criptate e guida la proliferazione epiteliale e la normale crescita intestinale 29,30,31. L'HA è anche un componente naturale in HM e viene prodotto alle più alte concentrazioni durante le prime settimane di lattazione30. In particolare, l'HA purificato da HM o HA disponibile in commercio di peso molecolare ~35 kDa (HA 35) protegge dalla colite indotta da batteri aumentando l'espressione dell'antimicrobico β-defensina e della proteina TJ ZO-1 nell'epitelio del colon in vivo e in vitro25,27. È importante notare che, tra tutti gli HA di dimensioni specifiche (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa), HA35 è il più potente induttore delle proteine TJ e dell'espressione peptidica antimicrobica nell'epitelio del colon in vitro. Inoltre, grandi MW HA (~2.000 kDa) non esercitano alcun effetto sull'espressione della proteina TJ, indicando che questi effetti sono specifici della dimensione32. Abbiamo anche dimostrato che la somministrazione orale di HA35 accelera la maturazione intestinale, promuove la proliferazione e la differenziazione epiteliale e protegge dallo sviluppo di NEC16. Qui, la capacità di HA35 di promuovere la guarigione delle ferite viene testata utilizzando un test in vitro per la guarigione delle ferite da graffio. Utilizzando i modelli sopra descritti, è stato riscontrato che HA35 accelera la chiusura della ferita in modo dipendente dalla concentrazione a 4 ore e 12 ore post-graffio rispetto al controllo, chiarendo una lacuna critica nella conoscenza degli effetti dell'HA di dimensioni specifiche sulla guarigione delle ferite intestinali e sulla riparazione dei tessuti e, quindi, confermando un ruolo benefico di HA35 nella guarigione delle ferite intestinali neonatali. Sebbene il meccanismo con cui HA35 esercita questo effetto sia sconosciuto, i dati precedenti degli autori nei cuccioli di topo hanno mostrato che il bersaglio meccanicistico della via della rapamicina (mTOR) complesso 1 (mTORC1) era sovraregolato nei tessuti ileali dopo il trattamento con HA3516. Sono necessari ulteriori studi per determinare il contributo di questo percorso a questi effetti osservati.
Sono stati utilizzati più modelli in vitro per studiare interventi che promuovono la rigenerazione, la guarigione e la riparazione intestinale. Il test in vitro più utilizzato per la ferita intestinale e la successiva riparazione è il test della ferita da graffio, eseguito più comunemente nei monostrati di cellule del cancro del colon-retto (CRC)33,34. La rilevanza fisiologica di un tale modello per l'intestino infantile pretermine, tuttavia, è limitata, poiché la riparazione delle ferite delle cellule CRC si basa così pesantemente sulla natura altamente proliferativa delle cellule tumorali piuttosto che sui processi di riparazione guidati dalle cellule staminali18. La recente capacità di isolare e mantenere enteroidi derivati da cripte dell'epitelio intestinale offre l'opportunità di esplorare una risposta intestinale più fisiologicamente rilevante a una moltitudine di stimoli immunitari o nocivi, nonché possibili interventi terapeutici35. Gli enteroidi contengono tutti i tipi di cellule epiteliali differenziate presenti nel segmento intestinale da cui derivano, fungendo così da modello efficace per studiare e riparare i danni della barriera intestinale36,37,38.
Qui descritti sono la creazione e il mantenimento di un modello enteroide in vitro di danno epiteliale intestinale e la riparazione utilizzando ileo da NHP pretermine. Questo modello consente lo studio dei percorsi meccanicistici e degli interventi terapeutici coinvolti nella guarigione e nella rigenerazione epiteliale. Un passo fondamentale in questo protocollo è la creazione di uno spazio ben definito con una larghezza simile, riducendo al minimo la variazione da pozzo a pozzo. Inoltre, quando si graffiano i monostrati, la punta della pipetta deve mantenere un contatto costante con il fondo del pozzetto per rimuovere in modo pulito lo strato cellulare. Una pressione eccessiva dovrebbe essere evitata per evitare il "sollevamento" dei bordi della ferita. Allo stesso modo, la fase di lavaggio PBS post-ferita deve essere eseguita delicatamente, utilizzando la parete laterale del pozzetto, per evitare danni al monostrato rimanente o un ulteriore allargamento dello spazio della ferita. Infine, è necessario evitare di mantenere la piastra al di sotto di 37 °C per periodi prolungati per garantire che il rivestimento ECM sulla piastra rimanga gelatinoso e che il monostrato non venga interrotto a causa di variazioni di viscosità ECM.
Sebbene questo modello abbia vantaggi distinti rispetto alla coltura cellulare tradizionale, è tecnicamente più impegnativo, costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto al tradizionale test di guarigione delle ferite nei monostrati di CRC. Inoltre, la coerenza dei reagenti e dei mezzi utilizzati è fondamentale per garantire la sopravvivenza e il corretto mantenimento di queste colture, così come il mantenimento delle cellule, dei reagenti e dell'ECM a temperature adeguate. Infine, i piccoli monostrati intestinali primari sono notoriamente di breve durata, quindi il test della ferita qui descritto dovrebbe essere condotto subito dopo aver raggiunto la confluenza del monostrato.
Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che i piccoli monostrati enteroidi intestinali possono essere utilizzati come nuovo modello per studiare la rigenerazione epiteliale intestinale attraverso i processi di migrazione e proliferazione cellulare dopo la ferita. Inoltre, gli enteroidi forniscono un tessuto molto più fisiologicamente traducibile per studiare gli effetti sulla vitalità differenziata delle cellule intestinali. Tali modelli possono fornire una piattaforma per analizzare i meccanismi che regolano la riparazione epiteliale e aiutare nell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). I servizi di imaging delle cellule vive forniti dal nucleo di genomica funzionale del cancro sono stati supportati in parte dal National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e dal National Cancer Institute Grant P30CA225520 del National Institutes of Health, assegnato al Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma Stephenson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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