Summary
Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.
Abstract
In vitro kraswondtesten worden vaak gebruikt om de mechanismen en kenmerken van epitheliale genezing in verschillende weefseltypen te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol om een tweedimensionale (2D) monolaag te genereren uit driedimensionale (3D) niet-menselijke primaat enteroïden afgeleid van darmcrypten van het terminale ileum. Deze van enteroïden afgeleide monolagen werden vervolgens gebruikt in een in vitro kraswondtest om het vermogen van hyaluronaat 35 kDa (HA35), een ha-mimiek voor moedermelk, te testen om celmigratie en proliferatie langs de epitheliale wondrand te bevorderen. Nadat de monolagen tot confluentie waren gegroeid, werden ze handmatig bekrast en behandeld met HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden in beeld gebracht met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop die is uitgerust voor live-cell imaging. Wondsluiting werd gekwantificeerd als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin in ImageJ. Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur. HA35 in vitro versnelt wondgenezing in enteroïde monolagen in de dunne darm, waarschijnlijk door een combinatie van celproliferatie aan de wondrand en migratie naar het wondgebied. Deze methoden kunnen mogelijk worden gebruikt als een model om darmregeneratie in de premature menselijke dunne darm te onderzoeken.
Introduction
Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een van de meest voorkomende gastro-intestinale noodsituaties bij te vroeg geboren baby's1. De ziekte wordt gekenmerkt door ernstige darmontsteking die snel kan verslechteren tot darmnecrose, sepsis en mogelijk de dood. Hoewel de etiologie onduidelijk is, suggereert bewijs dat NEC multifactorieel is en het resultaat van een complexe interactie van voeding, abnormale bacteriële kolonisatie en een onrijp darmepitheel 2,3. Premature baby's hebben een verhoogde darmdoorlaatbaarheid, abnormale bacteriële kolonisatie en een laag regeneratief vermogen van enterocyten 4,5, waardoor hun risico op intestinale barrièredisfunctie, bacteriële translocatie en NEC-ontwikkeling toeneemt. Daarom is het identificeren van strategieën of interventies om de intestinale epitheliale rijping te versnellen en regeneratie of genezing van het darmepitheel te bevorderen van cruciaal belang bij het voorkomen van deze dodelijke ziekte.
Studies hebben aangetoond dat moedermelk (HM) beschermend is tegen NEC bij te vroeg geboren baby's 6,7,8,9,10,11. Zowel menselijke als dierlijke studies hebben aangetoond dat op runderen gebaseerde formule de darmdoorlaatbaarheid verhoogt en direct toxisch is voor intestinale epitheelcellen 2,12. Hoewel niet volledig opgehelderd, suggereert bewijs dat de beschermende effecten van HM worden gemedieerd door bioactieve componenten zoals lactoferrine, immunoglobuline A (IgA) en HM oligosacchariden13. HM is ook rijk aan hyaluronaat (HA), een uniek niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan met herhalend D-glucuronzuur en N-acetyl-D-glucosaminedisachariden14,15. Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat orale 35 kDa HA (HA35), een HM HA-nabootsing, de ernst van darmletsel verzwakt, bacteriële translocatie voorkomt en de mortaliteit vermindert in een muizenNEC-achtig darmletselmodel16,17.
Hier worden de effecten van HA35 op darmgenezing en regeneratie in vitro verder onderzocht. Momenteel is de meest gebruikte in vitro assay voor darmbeschadiging en -reparatie een kraswondtest uitgevoerd in colorectale kanker (CRC) celmonolagen. De fysiologische relevantie van een dergelijk model voor de te vroeg geboren darm is beperkt, omdat wondherstel van CRC-cellen sterk afhankelijk is van de zeer proliferatieve aard van kankercellen in plaats van stamcelgestuurde reparatieprocessen18. Om deze beperking te overwinnen, wordt de oprichting van een 2D enteroïde kraswondmodel, inclusief de procedure voor het isoleren en onderhouden van primaire stamcel-afgeleide dunne darm enteroïden van premature niet-menselijke primaten (NHP), hier beschreven. Aangezien premature NEC meestal wordt gemeld in de distale dunne darm, biedt het gebruik van primaire epitheelcelorganoïden in een model van darmbeschadiging en -reparatie een meer fysiologisch vertaalbaar in vitro model in vergelijking met bestaande modellen die traditionele colorectale monolagen gebruiken18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Na institutionele goedkeuring werden foetale dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol # 101523-16-039-I) 20.
1. Vaststelling van premature niet-menselijke primaat 3D intestinale enteroïden
- Media voorbereiding
OPMERKING: Media kunnen tot 1 week voor cryptisolatie worden voorbereid volgens de standaard aseptische techniek. Penicilline/streptomycine (eindconcentratie 1%) kan indien gewenst worden gebruikt in plaats van de breedspectrumantibiotica voor primaire cellen.- Bereid humane organoïde groeimedia + Y-27632 (HOGMY) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement (materiaaltabel). Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (eindconcentratie 100 μg/ml) (materiaaltabel) en Y-27632 (tot een eindconcentratie van 10 μM) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur.
- Bereid humane organoïde groeimedia (HOGM) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement. Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (100 μg/ml) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur.
OPMERKING: HOGM zal worden gebruikt bij het wisselen van media na de eerste 2-3 dagen na passage. - Koel 100 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.
- Bereid 50 ml wasbuffer door 1x PBS zonder calcium of magnesium te combineren met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Laat het afkoelen tot het ijskoud is.
- Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd het ijskoud.
- Crypt isolatie en beplating
OPMERKING: Extracellulaire matrix (ECM) -gebaseerde hydrogel moet gedurende de hele procedure op het ijs blijven. Deze procedure gaat uit van voldoende weefsel om zes op ECM gebaseerde hydrogelkoepels te bevolken. Als een andere dichtheid van crypten wordt geoogst, moet het koepelnummer dienovereenkomstig worden gewijzigd.- Ontdooi 150 μL groeifactor verminderd (GFR) keldermembraanextract (BME) (fenol roodvrij) 's nachts op het ijs bij 2-8 °C.
- Incubeer een 24-well, platte bodem, weefselkweekbehandelde polystyreenplaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 30 minuten voor gebruik.
- Na NHP-euthanasie en weefselverzameling spoelt u het ileumsegment van puin met een pipetpunt van 1.000 μL met behulp van ijskoude 1x PBS in een wegwerp petrischaaltje.
OPMERKING: Vers weefsel moet snel worden geoogst en ijskoud worden gehouden om gezonde enteroïden te oogsten. - Snijd het ileum in de lengterichting langs de hele darm en was 3x met ijskoude PBS. Gehakt het weefsel in kleine fragmenten (ongeveer 2 mm lang) met een steriele schaar over een conische buis van 50 ml met 15 ml ijskoude PBS, te beginnen met het deel van het ileale segment dat zich het dichtst bij de buis bevindt.
- Gebruik een serologische pipet van 10 ml om de crypten te verstoren door 5-10x op en neer te pipetteren. Laat de weefselsegmenten op de bodem van de buis zakken, verwijder vervolgens het supernatant en vervang het door verse, ijskoude PBS. Herhaal dit proces minimaal 7x-10x totdat het supernatant helder en vrij van vuil is.
- Eenmaal helder, verwijder het supernatant en resuspenseer de crypten in 25 ml celdissociatiereagens. Plaats de buis op een schommelplatform bij 20 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de buis uit de rocker, laat de cellen ongeveer 30 s tot 1 min bezinken en verwijder het supernatant. Voeg 10 ml ijskoude wasbuffer toe. Pipetteer op en neer met een p1000 pipet om verder te dissociëren in enkele crypten.
- Filter het weefsel door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml. Spoel de originele conische buis van 50 ml met 10 ml ijskoude wasbuffer en filter door de zeef van 70 μm om ervoor te zorgen dat alle crypten uit de oorspronkelijke buis zijn verwijderd. Herhaal dit wassen van tissue voor een totaal van 4x spoelingen.
- Centrifugeer het filtraat bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 200 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt.
OPMERKING: Als de oplossing niet ijskoud is, zal de koepel niet de juiste structuur behouden wanneer deze wordt verguld. Vermijd het introduceren van bubbels bij het pipetteren van op ECM gebaseerde hydrogelkoepels, omdat bubbels een goede hechting aan de plaatbodem voorkomen. - Voeg 600 μL ijskoude hydrogel op basis van ECM toe om de celpellet te suspenseren en meng goed met een pipet van 200 μL.
- Haal de 24-wells plaat uit de incubator en plaats deze op een 37 °C platenwarmer. Pipetteer 50 μL ijskoud HOGMY/ECM-gebaseerd hydrogelmengsel in het midden van 24 putten van een 24-well kweekplaat (50 μL per koepel).
- Laat de koepels na de vergulding 1 minuut op een platenwarmer van 37 °C zitten om hechting aan de onderkant van de plaat mogelijk te maken. Keer de plaat voorzichtig om, zorg ervoor dat er zich geen condensatie op de bodem van de plaat heeft opgehoopt en plaats de omgekeerde plaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Draai na 15 minuten de plaat rechts omhoog en pipetteer 750 μL HOGMY op kamertemperatuur in elke put.
OPMERKING: Pipet media langzaam op de zijwand van putten, voorzichtig om de nieuw gevormde 3D ECM-gebaseerde hydrogelkoepel niet te verstoren. - Zodra alle putjes zijn gevuld met media, plaatst u de plaat in de incubator en vervangt u de media om de 3 dagen met 750 μL HOGM. Passage enteroïden om de 7-10 dagen.
- Intestinale enteroïde passaging
OPMERKING: Het volgende protocol is voor één 24-well kweekplaat met NHP-enteroïden met een splitsnelheid van 1:2.- Verwijder de enteroïde media uit elke put, zorg ervoor dat de ECM-koepel met enteroïden niet wordt verstoord, voeg 500 μL ijskoude celdissociatiereagens toe aan elke put met behulp van een pipet van 1.000 μL en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Verstoor de ECU handmatig door 8-12x op en neer te pipetteren. Breng de inhoud van 12 putten over op één conische buis van 15 ml.
- Zodra alle oplossing is verzameld uit de 24-well kweekplaat, voegt u 250 μL celverstoringsreagens toe aan elke put om ervoor te zorgen dat alle NHP-enteroïden uit elke put zijn verwijderd en voegt u deze laatste spoeling toe aan de bestaande conische buizen van 15 ml.
- Plaats op een schommelplatform bij 40 tpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (20 °C). U kunt de buizen ook handmatig schudden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 15 minuten centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit de buizen van 15 ml totdat alleen de pellet overblijft.
- Voeg 8 ml ijskoude DMEM + breedspectrumantibiotica toe aan één conische buis van 15 ml en zorg ervoor dat de pellet voldoende verstoord is. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt. Zodra de oplossing ijskoud is, voegt u 600 μL ijskoude ECU toe om de celpellet te suspenseren en mengt u goed met een pipet van 1.000 μL. Herhaal stap 1.3.2.-1.3.7. voor de overige 12 putten.
- Voor de overige stappen raadpleegt u stap 1.2.11.-1.2.16.
2. Vaststelling van enteroïde monolaag- en kraswondtest
- Media en behandelingsvoorbereiding
- Koel 5 ml PBS zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.
- Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd ijskoud.
- Bereid 100 ml HOGMY, zoals beschreven in stap 1.1.1., en verwarm het op de bank tot kamertemperatuur.
- Verwarm 25 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in een waterbad van 37 °C.
- Bereid 50 μg/ml, 100 μg/ml en 200 μg/ml ha35 voor celbehandeling, met steriel PBS zonder calcium of magnesium als oplosmiddel. De uiteindelijke verdunning van HA35 zal HOMGY als oplosmiddel gebruiken.
OPMERKING: HA35-preparaat kan verschillende verdunningen vereisen, omdat HA35 vaak uit de oplossing komt in een concentratie van meer dan 5 mg / ml.
- Enteroïde monolaagvorming
OPMERKING: De volgende procedure biedt volumes die voldoende zijn voor het genereren van één 24-well plaat van enteroïde monolagen. Pas de volumes aan voor het gewenste aantal monolagen.- Ontdooi 96 μL op ECM gebaseerde hydrogel BME (fenol roodvrij) 's nachts op ijs bij 2-8 °C. Verdun ECM-gebaseerde hydrogel in ijskoude PBS zonder calcium of magnesium in een verhouding van 1:50. Bestrijk elk putje van een 24-well weefselkweekplaat met 200 μL ijskoude verdunde hydrogel op basis van ECM.
- Incubeer de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat gedurende minimaal 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Aspirateer media uit de 24-well kweekplaat met de 3D-enteroïden bestemd voor monolagen en vervang door 500 μL celdissociatiereagens/put.
- Verbreek handmatig op ECM gebaseerde hydrogelkoepels door 8x-12x op en neer te pipetteren en breng de inhoud van 12 putten over naar een conische buis van 15 ml.
- Was de 12 lege putjes met 250 μL celdissociatiereagens om ervoor te zorgen dat alle enteroïden zijn verwijderd en breng de inhoud over naar een conische buis van 15 ml. Herhaal stap 2.2.5. en stap 2.2.6. voor de overige 12 putten met behulp van een tweede conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de conische buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 10 ml ijskoude DMEM-F12 wasbuffer toe aan 15 ml conische buizen en suspensie de enteroïde pellets door de buizen om te keren. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 12 ml trypsine-EDTA van 37 °C. Plaats de buisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C of totdat de cellen oplosbaar lijken. Voeg 3 ml DMEM-F12 wasbuffer toe aan elke buis om Trypsin-EDTA te verdunnen, meng door de buizen om te keren en plaats op ijs.
- Filter de gedissocieerde enteroïden door een 37 μM mesh celzeef en verzamel de inhoud in schone conische buizen van 15 ml. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Terwijl de cellen in de centrifuge pelleteren, verwijdert u de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat uit de incubator en zuigt u overtollige hydrogeloplossing op basis van ECM op zonder het gecoate oppervlak te krassen of de plaat volledig te laten drogen.
- Verwijder het supernatant uit de conische buizen en resuspenseer de celpellets met 6 ml HOMGY. Voeg 500 μL van de gecombineerde 12 ml HOMGY-celsuspensie toe aan elke put van de 24-well plaat bedekt met ECM-gebaseerde hydrogel met een zaaidichtheid van ongeveer 3 x 105 cellen / put. Draai de plaat met een deksel erop om een gelijkmatige verdeling van de cellen in de putten te garanderen.
- Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 en wissel elke 2 dagen HOMGY-media uit totdat de monolagen >90% samenvloeiing bereiken.
- Monolayer behandeling en kras wond assay
- Zodra de monolagen >90% confluency bereiken, aspirateer media om cellen te verwijderen die zich niet hechten. Behandel cellen met 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS, opgelost in HOMGY, gedurende 24 uur.
- Verwijder na 24 uur de media en zorg ervoor dat u het oppervlak van de monolaag niet verstoort. Maak met behulp van een pipetpunt van 200 μL een lineaire kras over de volledige oppervlaktediameter van de monolaag in elke put, waarbij u moet oppassen dat u monolagen niet laat drogen.
- Was de bekraste monolagen 1x met 500 μL 1x PBS. Voeg 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS opgelost in HOMGY toe en breng de plaat over naar het levendcelanalyse-instrument (materiaaltabel) in een CO2-incubator van 37 °C en 5%.
- Klik onder het pictogram Schema in de live-cell analysesoftware (Materiaaltabel) op het pictogram Launch Add New Vessel Wizard en stel de scanfrequentie in om volgens een schema te scannen. Maak een nieuw Whole Well-vat onder Scantype, geef de scaninstellingen op (d.w.z. Fase voor beeldkanalen en 4x voor Doelstelling) en klik op Volgende.
- Selecteer de fabrikant van de plaat en het catalogusnummer in de lijst. Kies onder het pictogram Schema het plussymbool waar de plaat in het live-cell analyse-instrument wordt geplaatst. Selecteer het gewenste scanpatroon en maak vervolgens een plaatkaart door "+" te selecteren op de pagina Plaatindeling. Selecteer Analyse uitstellen tot later en stel vervolgens het scanschema in voor elke 4 uur gedurende 24 uur en controleer de acquisitie-instellingen op de pagina Overzicht van de wizard Vaartuig . Selecteer ten slotte Toevoegen aan schema.
- Zodra de 24-test is voltooid, dubbelklikt u onder het pictogram Weergave op Vessel Name en exporteert u afbeeldingen en films. Selecteer putjes en een reeks afbeeldingen om weer te geven en te exporteren als JPEG. Analyseer afbeeldingen voor procent wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin voor ImageJ21, volgens stap 2.4. onder.
- Kras wondanalyse
- Open ImageJ-software. Upload de scratch wound assay afbeeldingen (. TIFF of .JPG).
- Selecteer Afbeelding > Typ > 8-bits om de afbeelding te wijzigen van 24-bits RGB in 8-bits. Installeer de Wound Healing Size Plugin door Plugins > Macros te selecteren > Install > Wound Healing Size Plugin te installeren.
- Draai de afbeelding zodat de kras verticaal is en initialiseer de Wound Healing Size Tool-plug-in.
- Selecteer de plugin parameters in het dialoogvenster om het beste bij de kras wond te passen. Stel de waarde van de parameters voor opties voor wondgenezingsgrootte als volgt in: Variantievensterradius op 20, Drempelwaarde op 100 en Percentage verzadigde pixels op 0,001 en kies Ja voor Schaal globaal instellen. Voltooi de selectie door op de knop OK te klikken. Controleer of het geselecteerde gebied het wondgebied is. De bovenstaande parameters kunnen standaardisatie van laboratorium tot laboratorium vereisen.
- Herhaal stap 2.4.2.-2.4.4. voor de resterende tijdspunten voor elke kras.
- Bereken het percentage wondgenezing van het krasgebied van migrerende of prolifererende cellen gedurende 24 uur als volgt:
% Wondgenezing =
waarbij T0 = % oppervlakte op tijdstip 0 h en Tc = % oppervlakte 0 h, 4 h, 12 h of 24 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De effecten van HA op weefselherstel en wondgenezing in verschillende weefsels en organen zijn goed gedocumenteerd; de specifieke effecten van HA met een molecuulgewicht van 35 kDa op foetale of neonatale genezing en regeneratie van de dunne darm zijn momenteel echter onbekend. Om het vermogen van HA35 te testen om wondgenezing te bevorderen in een model van de foetale of neonatale dunne darm, genereerden we 3D-intestinale enteroïden uit NHP-ileaal weefsel en dissocieerden we dit weefsel verder in afzonderlijke cellen om 2D enteroïde-afgeleide monolagen te creëren (figuur 1A, B). De monolagen werden samengevoegd tot confluency en handmatig bekrast met behulp van een P200 pipetpunt (figuur 1B,C). Monolagen werden vervolgens behandeld met HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden elke 4 uur gedurende een totaal van 24 uur in beeld gebracht met behulp van een microscoop met doorgelaten licht die is uitgerust voor live-cell imaging22. De snelheid van wondsluiting, een maat voor de snelheid van celmigratie, werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin21 (figuur 2). Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur (stap 2.4.6.). Zoals te zien is in figuur 3, resulteerde blootstelling aan HA35 in een dosis- en tijdsafhankelijke stimulatie van celmigratie/proliferatie, wat leidde tot versnelde wondsluiting. HA35 bij 100 μg/ml en 200 μg/ml verhoogde de genezing significant met ~1,5-2,5-5-voudig ten opzichte van controle bij zowel 4 uur als 12 uur (*p < 0,05).
Figuur 1. Enteroïde generatie en enteroïde-afgeleide monolayer wondgenezing assay procedure. (A) Cultuur van driedimensionale niet-menselijke intestinale enteroïden van primaten die worden gebruikt om te dissociëren in (B) tweedimensionale monolagen. (C) Monolagen werden gekweekt tot >90% samenvloeiing in een 24-wells plaat en vervolgens behandeld met hyaluronzuur 35 kDa of fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 24 uur. Monolayers werden vervolgens bekrast met een P200 pipetpunt. Schaalbalk = 800 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Wondgenezing assay beelden en analyse. Representatieve beelden van hyaluronzuur 35 kDa (100 μg/ml, 200 μg/ml) en controlebehandelingen van niet-menselijke enteroïde monolagen van primaten. Beelden werden verkregen op 0 h, 4 h, 12 h, 16 h en 24 h na het uitvoeren van een kras met een P200 pipet tip. Beelden werden genomen met 4x vergroting met het live-cell analyse-instrument en geanalyseerd in ImageJ met behulp van de Wound Healing Size Plugin. Percentage wondgenezing werd berekend uit migrerende/prolifererende cellen gedurende 24 uur. Schaalbalk = 800 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Effect van hyaluronzuur 35 kDa (HA35) op wondgenezing bij enteroïde monolagen. Verandering in wondgenezing in de loop van de tijd in enteroïde monolagen, afhankelijk van de HA35-behandelingsconcentratie. HA35 verhoogde de wondgenezing significant na 4 uur en 12 uur bij 100 μg / ml en 200 μg / ml in vergelijking met controle, maar de genezingssnelheden convergeerden tussen behandelingen met 24 uur. Significantie werd beoordeeld met behulp van de Student's t-test op *p < 0,05, gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) (n = 6 putjes per behandeling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het maagdarmkanaal van een te vroeg geboren baby staat onder voortdurende regeneratieve druk van herhaalde blootstelling aan milieu-beledigingen geassocieerd met dysbiose, inflammatoire bacteriële metabolieten en toxines, en intermitterende hypoxie23,24. Helaas is het darmepitheel van het te vroeg geboren kind niet in staat om snel functionele integriteit vast te stellen23, wat resulteert in barrièredisfunctie, verhoogde darmdoorlaatbaarheid en, in ernstige gevallen, ongebreidelde darmontsteking en NEC-ontwikkeling.
Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een klasse van polysacchariden die voorkomen in moedermelk, die potentiële bioactieve factoren zijn die beschermen tegen de ontwikkeling van NEC15,16. HA is een lineair polymeer van herhalende disachariden van glucuronzuur en N-acetylglucosamine 25,26 geproduceerd door hyaluronaatsynthasen. HA kan zowel pro- als ontstekingsremmende eigenschappen hebben, afhankelijk van de grootte en weefselomgeving27,28. In de darm en dikke darm is endogene HA aanwezig in de extracellulaire ruimte naast cryptepitheelcellen en stimuleert epitheliale proliferatie en normale darmgroei 29,30,31. HA is ook een natuurlijk bestanddeel in HM en wordt geproduceerd in de hoogste concentraties tijdens de eerste weken van borstvoeding30. Met name HA gezuiverd van HM of in de handel verkrijgbaar HA met een molecuulgewicht ~ 35 kDa (HA 35) beschermt tegen door bacteriën geïnduceerde colitis door de expressie van de antimicrobiële β-defensine en het TJ-eiwit ZO-1 in het colonepitheel in vivo en vitro25,27 te verhogen. Het is belangrijk op te merken dat, van alle ha van specifieke grootte (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa), HA35 de krachtigste inductor is van TJ-eiwitten en antimicrobiële peptide-expressie in het colonepitheel in vitro. Bovendien oefent grote MW HA (~ 2.000 kDa) geen effect uit op de TJ-eiwitexpressie, wat aangeeft dat deze effecten groottespecifiek32 zijn. We toonden ook aan dat orale toediening van HA35 de rijping van de dunne darm versnelt, epitheliale proliferatie en differentiatie bevordert en beschermt tegen de ontwikkeling van NEC16. Hier wordt het vermogen van HA35 om wondgenezing te bevorderen getest met behulp van een in vitro kraswondgenezingstest. Met behulp van de hierboven beschreven modellen bleek dat HA35 de wondsluiting versnelt op een concentratieafhankelijke manier na 4 uur en 12 uur na het krabben in vergelijking met controle, waardoor een kritieke kloof in kennis over de effecten van specifiek gedimensioneerde HA op darmwondgenezing en weefselherstel wordt verduidelijkt en dus een gunstige rol van HA35 bij neonatale darmwondgenezing wordt bevestigd. Hoewel het mechanisme waarmee HA35 dit effect uitoefent onbekend is, toonden de eerdere gegevens van de auteurs bij muizenpups aan dat het mechanistische doelwit van de rapamycine (mTOR) complex 1 (mTORC1) -route werd opgewaardeerd in ileale weefsels na HA35-behandeling16. Verdere studies zijn nodig om de bijdrage van deze route aan deze waargenomen effecten te bepalen.
Meerdere in vitro modellen zijn gebruikt om interventies te onderzoeken die intestinale regeneratie, genezing en reparatie bevorderen. De meest gebruikte in vitro assay voor darmwonden en daaropvolgende reparatie is de kraswondtest, meestal uitgevoerd in colorectale kanker (CRC) cel monolagen33,34. De fysiologische relevantie van een dergelijk model voor de te vroeg geboren darm is echter beperkt, omdat wondherstel van CRC-cellen zo sterk afhankelijk is van de zeer proliferatieve aard van kankercellen in plaats van stamcelgestuurde reparatieprocessen18. Het recente vermogen om enteroïden afgeleid van crypten van darmepitheel te isoleren en te onderhouden, biedt de mogelijkheid om een meer fysiologisch relevante intestinale reactie op een veelheid aan immuun- of schadelijke stimuli te onderzoeken, evenals mogelijke therapeutische interventies35. Enteroïden bevatten alle gedifferentieerde epitheelceltypen die worden aangetroffen in het darmsegment waaruit ze zijn afgeleid, en dienen dus als een effectief model voor het bestuderen van darmbarrièreschade en reparatie 36,37,38.
Hierin beschreven zijn de oprichting en het onderhoud van een in vitro enteroïde model van intestinale epitheliale schade en reparatie met behulp van ileum van premature NHP. Dit model maakt het mogelijk om mechanistische paden en therapeutische interventies te onderzoeken die betrokken zijn bij epitheliale genezing en regeneratie. Een cruciale stap in dit protocol is het creëren van een goed gedefinieerde opening met een vergelijkbare breedte, waardoor de variatie van goed tot goed wordt geminimaliseerd. Bovendien moet de pipetpunt bij het krassen van de monolagen constant contact houden met de bodem van de put om de cellaag schoon te verwijderen. Overmatige druk moet worden vermeden om te voorkomen dat de randen van de wond worden "opgetild". Evenzo moet de pbs-wasstap na het verwonden voorzichtig worden uitgevoerd, met behulp van de zijwand van de put, om schade aan de resterende monolaag of extra verbreding van de wondspleet te voorkomen. Ten slotte moet men voorkomen dat de plaat gedurende langere perioden onder 37 °C wordt gehouden om ervoor te zorgen dat de ECU-coating op de plaat gelachtig blijft en de monolaag niet wordt verstoord door veranderingen in de viscositeit van de ECU.
Hoewel dit model duidelijke voordelen heeft ten opzichte van traditionele celkweek, is het technisch veeleisender, duurder en tijdrovender in vergelijking met de traditionele wondgenezingstest in CRC-monolagen. Bovendien is consistentie in de gebruikte reagentia en media van cruciaal belang om de overleving en het juiste onderhoud van deze culturen te waarborgen, evenals het handhaven van de cellen, reagentia en ECM bij de juiste temperaturen. Ten slotte zijn primaire dunne darmmonolagen notoir van korte duur, dus de hier beschreven wondtest moet worden uitgevoerd kort nadat monolaagconfluentie is bereikt.
Alles bij elkaar suggereren deze resultaten dat enteroïde monolagen van de dunne darm kunnen worden gebruikt als een nieuw model om intestinale epitheliale regeneratie te onderzoeken door de processen van celmigratie en proliferatie na verwonding. Bovendien bieden enteroïden een veel fysiologischer vertaalbaar weefsel om effecten op de levensvatbaarheid van gedifferentieerde darmcellen te bestuderen. Dergelijke modellen kunnen een platform bieden om de mechanismen te ontleden die epitheliaal herstel reguleren en helpen bij de identificatie van nieuwe therapeutische doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. Live-cell imaging-diensten die worden aangeboden door de Cancer Functional Genomics-kern werden gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 en national cancer institute grant P30CA225520 van de National Institutes of Health, toegekend aan het University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
