Este protocolo describe el análisis de morfología organoide rectal (ROMA), un nuevo ensayo diagnóstico para la fibrosis quística (FQ). Las características morfológicas, a saber, la redondez (índice de circularidad, IC) y la presencia de un lumen (relación de intensidad, IR), son una medida de la función CFTR. El análisis de 189 sujetos mostró una discriminación perfecta entre FQ y no FQ.
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Artículo de método
Análisis de morfología organoide rectal (ROMA): un ensayo de diagnóstico en fibrosis quística
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Resumen
Resumen
El diagnóstico de la fibrosis quística (FQ) no siempre es sencillo, especialmente cuando la concentración de cloruro en el sudor es intermedia y / o se pueden identificar menos de dos mutaciones CFTR causantes de la enfermedad. Los ensayos fisiológicos CFTR (diferencia de potencial nasal, medición de corriente intestinal) se han incluido en el algoritmo de diagnóstico, pero no siempre están disponibles o son factibles (p. ej., en lactantes). Los organoides rectales son estructuras 3D que crecen a partir de células madre aisladas de criptas de una biopsia rectal cuando se cultivan en condiciones específicas. Los organoides de sujetos sin FQ tienen una forma redonda y una luz llena de líquido, ya que el transporte de cloruro mediado por CFTR conduce el agua hacia el lumen. Los organoides con función CFTR defectuosa no se hinchan, conservando una forma irregular y sin luz visible. Las diferencias en la morfología entre los organoides CF y no CF se cuantifican en el 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) como un nuevo ensayo fisiológico CFTR. Para el ensayo ROMA, los organoides se colocan en placas de 96 pocillos, se tiñen con calceína y se obtienen imágenes en un microscopio confocal. Las diferencias morfológicas se cuantifican utilizando dos índices: el índice de circularidad (IC) cuantifica la redondez de los organoides, y la relación de intensidad (IR) es una medida de la presencia de un lumen central. Los organoides sin FQ tienen un IC alto y un IR bajo en comparación con los organoides de FQ. Los índices ROMA discriminaron perfectamente a 167 sujetos con FQ de 22 sujetos sin FQ, lo que hace de ROMA un ensayo fisiológico CFTR atractivo para ayudar en el diagnóstico de FQ. Las biopsias rectales se pueden realizar rutinariamente a todas las edades en la mayoría de los hospitales y el tejido se puede enviar a un laboratorio central para cultivo de organoides y ROMA. En el futuro, ROMA también podría aplicarse para probar la eficacia de los moduladores CFTR in vitro. El objetivo del presente informe es explicar plenamente los métodos utilizados para la ROMA, a fin de permitir la replicación en otros laboratorios.
Introducción
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR). La proteína CFTR es un canal de cloruro y bicarbonato, asegurando la hidratación de varios epitelios1. La FQ es una enfermedad multisistémica de alta carga, que acorta la vida, que se manifiesta principalmente como una enfermedad respiratoria, pero que también afecta al tracto gastrointestinal, el páncreas, el hígado y el tracto reproductivo2.
Las mutaciones CFTR causantes de la enfermedad conducen a una disminución en la cantidad....
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Protocolo
Para todos los procedimientos con tejido humano, se obtuvo la aprobación del Comité de Ética de Investigación UZ/KU Leuven (investigación de la CE). Todas las investigaciones se realizaron con el consentimiento informado y/o el consentimiento de los padres, representantes y/o pacientes.
NOTA: Todos los procedimientos que involucren biopsias rectales y organoides deben realizarse en un flujo laminar para proteger al investigador de cualquier peligro biológico y minimizar el riesgo de contaminación de los cultivos. En cuanto a cualquier procedimiento de laboratorio, los investigadores deben usar en todo momento batas de laboratorio, guantes y....
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Resultados
Se recolectaron organoides de 212 sujetos durante las visitas clínicas de rutina. No se produjeron eventos adversos durante o después del procedimiento de biopsia rectal. Los organoides fueron fotografiados por un investigador cegado a las características del sujeto, como el genotipo y la información clínica. Debido a las imágenes de baja calidad, 23 sujetos fueron excluidos. En la Figura 2 se pueden ver ejemplos de cultivos de organoides exitosos y fallidos y adquisición de imágenes.
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Discusión
Proporcionamos un protocolo detallado para el análisis morfológico de organoides rectales (ROMA). Los dos índices calculados con ROMA, IR e IC, distinguieron organoides de sujetos con FQ de aquellos sin FQ con perfecta precisión. ROMA podría funcionar como un nuevo ensayo fisiológico CFTR complementario al SCC y otras pruebas actualmente disponibles13,14,15.
El protocolo depende del uso de organoides .......
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Divulgaciones
Este estudio fue financiado por la asociación belga de pacientes con FQ "Mucovereniging / Association Muco", la beca de investigación de la Sociedad Belga de Pediatría BVK-SBP 2019 y una subvención del Fondo UZ Leuven para la Investigación Biomédica Traslacional. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a los pacientes y padres que participaron en este estudio. Agradecemos a Abida Bibi por todo el trabajo de cultivo con los organoides. Agradecemos a Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz y Bernard Wenderickx por su apoyo logístico. También agradecemos a Mucovereniging/Association Muco, y específicamente a Stefan Joris y al Dr. Jan Vanl....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Sorenson | 17040 | |
| Tubos cónicos de 15 mL | VWR | 525-0605 | |
| Placas de 24 pocillos | Corning | 3526 | |
| Placas de 96 pocillos | Greiner | 655101 | |
| Microscopio de campo claro | Centrífuga Zeiss | Axiovert 40C | |
| Eppendorf | 5702 | ||
| Incubadora 2 | Binder | CB160 | |
| Ordenador | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 800 | |
| Campana de flujo laminar | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material para el cultivo de organoides como se detalla en el protocolo anterior10 | |||
| Micropipetas (20, 200 y 1000 µ L) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO Software de hoja de cálculo de 64 bits | |
| NIS-Elements Software de imágenes de análisis de investigación avanzada | Nikon | v.5.02.00 | Software de imagen |
| Puntas de pipeta (20, 200 y 1000 µ L) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Software de imagen | Zeiss | v2.6 |
Referencias
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
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Reimpresiones y permisos
