Summary
Das Protokoll zeigt eine Methode zur Untersuchung der räumlichen Korrelation zwischen den präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und perisynaptischen Schwann-Zellen im medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte unter Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie mit verschiedenen Biomarkern, nämlich Neurofilament 200, vesikulärem Acetylcholintransporter, Alpha-Bungarotoxin und S100.
Abstract
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist eine komplexe Struktur, die für die Signalkommunikation vom Motoneuron zum Skelettmuskel dient und aus drei wesentlichen histologischen Komponenten besteht: den präsynaptischen motorischen Axonterminals, den postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und den perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs). Um die morphologischen Eigenschaften von NMJ zu demonstrieren, wurde der Musculus gastrocnemius medialis der Ratte als Zielgewebe ausgewählt und unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern, einschließlich Neurofilament 200 (NF200) und vesikulärem Acetylcholintransporter (VAChT) für die motorischen Nervenfasern und ihre präsynaptischen Terminals, alpha-Bungarotoxin (α-BTX) für die postsynaptischen nikotinischen AchRs, und S100 für die PSCs. In dieser Studie wurde die Färbung in zwei Gruppen durchgeführt: In der ersten Gruppe wurden die Proben mit NF200, VAChT und α-BTX gefärbt, und in der zweiten Gruppe wurden die Proben mit NF200, α-BTX und S100 gefärbt. Es zeigte sich, dass beide Protokolle die detaillierte Struktur von NMJ effektiv demonstrieren können. Mit dem konfokalen Mikroskop wurden morphologische Eigenschaften der präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und PSC gesehen, und ihre Z-Stacks-Bilder wurden in einem dreidimensionalen Muster rekonstruiert, um die räumliche Korrelation zwischen den verschiedenen Markierungen weiter zu analysieren. Aus methodischer Sicht bieten diese Protokolle eine wertvolle Referenz für die Untersuchung der morphologischen Eigenschaften von NMJ unter physiologischen Bedingungen, die auch geeignet sein können, die pathologische Veränderung von NMJ, wie periphere Nervenverletzung und Regeneration, zu bewerten.
Introduction
Als drei wesentliche strukturelle Komponenten der neuromuskulären Verbindung (NMJ)1,2,3,4 wurden morphologische Aspekte der präsynaptischen motorischen Axonterminals, der postsynaptischen Membran mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs) umfassend untersucht. Dünne Schnitte und Ganzkörperproben der Skelettmuskulatur wurden mit verschiedenen histologischen Techniken untersucht, wie Elektronenmikroskopie 5,6, konfokale Mikroskopie7,8 und Lichtblattmikroskopie 9,10. Obwohl die morphologischen Eigenschaften von NMJ durch diese Techniken unter verschiedenen Aspekten nachgewiesen wurden, ist die konfokale Mikroskopie zum Vergleich immer noch eine ideale Wahl für die Bildgebung der detaillierten Morphologie von NMJ.
In letzter Zeit wurden viele neue Technologien entwickelt, um die strukturellen Komponenten von NMJ zu zeigen. Zum Beispiel wurden thy1-YFP-transgene fluoreszierende Mäuse direkt verwendet, um motorische Axone und motorische Endplatten in vivo und in vitro10,11 zu beobachten. Darüber hinaus wurde die intravenöse Injektion von fluoreszierendem α-BTX angewendet, um die räumliche Verteilung der motorischen Endplatten in der gesamten Skelettmuskulatur von Wildtyp- und transgenen fluoreszierenden Mäusen aufzudecken, indem eine gewebeoptische Clearing-Behandlung zur Untersuchung mit Lichtblattmikroskopie 9,12 verwendetwurde. Abgesehen von den prä- und postsynaptischen Elementen, die mit diesen fortgeschrittenen Methoden betrachtet werden können, können die PSCs jedoch nicht gleichzeitig demonstriert werden.
Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass PSCs als periphere Gliazellen eng mit den präsynaptischen Terminals verbunden sind, die zur Entwicklung und Stabilität von NMJ, zur Modulation der synaptischen Aktivität des NMJ unter physiologischen Bedingungen und zur Regeneration des NMJ nach Nervenverletzung beitragen13,14,15 . In Anbetracht der zellulären Architektur von NMJ ist dieses Protokoll ein geeigneter Kandidat für die gleichzeitige Kennzeichnung der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente, und wird möglicherweise verwendet, um die Integrität und Plastizität des NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten. Vergleichen Sie zum Beispiel die Intensität von NMJ, die Morphologie und das Volumen der postsynaptischen motorischen Endplatten, die Innervation und Denervierung von NMJ und die Anzahl der PSCs in Muskeln mit physiologischem und pathologischem Status.
Der Musculus gastrocnemius ist der größte Muskel, der die Ausbuchtung in der Wade bildet, die leicht durch Entfernen der Haut und des Bizeps femoris aus der Extremität herausgeschnitten werden kann. Der Muskel wird oft ausgewählt, um Muskelatrophie, neuromuskuläre Degeneration, Muskelleistung und motorische Einheit Kraft ex vivo oder in vivo16,17,18 zu beurteilen. Die Technik eignet sich aber auch, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ aus verschiedenen Skelettmuskeln aufzudecken. Gleichzeitig können die dicken Muskelabschnitte eine vollständigere Morphologie und Menge an NMJ im Vergleich zu dünnen Abschnitten 7,8 und gehänselten Muskelfasern19 aufweisen.
In Übereinstimmung mit diesen Studien wurde der mediale Gastrocnemius-Muskel der Ratte als Zielgewebe in dieser Studie ausgewählt und in einer Dicke von 80 μm für die mehrfache fluoreszierende Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern entsprechend den Strukturkomponenten von NMJ geschnitten. Hier wurden Neurofilament 200 (NF200)20,21, vesikulärer Acetylcholintransporter (VAChT)22, Alpha-Bungarotoxin (α-BTX)23,24 und S10025,26 verwendet, um Nervenfasern, präsynaptische Terminals, postsynaptische AchRs bzw. PSCs zu markieren. Darüber hinaus wurde der Hintergrund von Muskelgewebe und Zellkernen weiter mit Phalloidin und DAPI konterkariert.
In dieser Studie erwarten wir, ein verfeinertes Protokoll für die gleichzeitige Färbung der zellulären Architektur von NMJ mit ihren entsprechenden Biomarkern auf dickeren fixierten Proben zu entwickeln, das für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie bequemer ist und dazu beiträgt, viel mehr Informationen über die detaillierte Struktur der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente sowie deren räumliche Korrelation zueinander zu erhalten. Aus methodischer Sicht kann dieses Protokoll von Vorteil sein, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Genehmigung Nr. 2021-04-15-1). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden verwendet. Die Ratten wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit und freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Die Instrumente und Materialien für diese Studie sind in Abbildung 1 dargestellt.
1. Perfusion
- Injizieren Sie 250 mg/kg Tribromethanollösung intraperitoneal, um die Euthanasie der Ratten zu induzieren.
- Sobald die Atmung aufhört, öffnen Sie die Brusthöhle, um mit einer Schere und einer Pinzette auf das Herz zuzugreifen. Führen Sie einen intravenösen Katheter vom linken Herzventrikel in Richtung Aorta ein und schneiden Sie dann die rechte Ohrmuschel ab.
- Durchbluten Sie die experimentellen Ratten in der Haube. Beginnen Sie mit der Perfusion mit 100 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung, bis das Blut, das aus der rechten Ohrmuschel austritt, klar, und setzen Sie dann die Perfusion mit 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) für etwa 10 Minuten fort, bis der Schwanz schwer zu biegen ist.
2. Regionale Anatomie
- Entfernen Sie nach der Perfusion die Haut der beidseitigen Hintergliedmaße mit einer chirurgischen Klinge (Abbildung 2A) und legen Sie den beidseitigen Ischiasnerv und den Musculus gastrocnemius medialis frei (Abbildung 2B).
- Sezieren Sie den beidseitigen medialen Gastrocnemius-Muskel vorsichtig von der Hinterextremität mit einer Klinge aus (Abbildung 2C) und fixieren Sie den gesamten Muskel in 10 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB für 2 h.
- Entfernen Sie den Muskel aus der Lösung und kryoschützen Sie den Muskel in 10 ml 25% Saccharose in 0,1 M PB für 1 Tag bei 4 ° C, bis der Muskel vollständig in die Lösung eingetaucht ist.
3. Kryosektion des Muskels
- Sobald das Muskelgewebe in die Lösung eingetaucht ist, fixieren Sie es auf einem Gefriertisch eines gleitenden Mikrotomsystems mit gefrorenem Schnittmedium. Schneiden Sie den Muskel horizontal entlang der Längsachse des Muskels mit einer Dicke von 80 μm.
- Sieben Kryoabschnitte pro Bohrung in geordneter Weise in eine Kulturplatte mit sechs Vertiefungen mit 10 ml 0,1 M PB (pH 7,4) mit einem Pinsel legen.
HINWEIS: Die Abschnitte sind so angeordnet, dass die Abschnitte in verschiedenen Vertiefungen benachbart sind, wodurch die Abschnitte, die für verschiedene Flecken verwendet werden, konsistenter werden.
4. Multiple fluoreszierende Färbung mit NF200, VAChT, α-BTX und Pha
HINWEIS: Multiple fluoreszierende Färbung mit NF200, VAChT, α-BTX und Pha wurde angewendet, um die Nervenfasern, präsynaptischen Terminals, postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren bzw. Muskelfasern aufzudecken.
- Inkubieren Sie vier Abschnitte pro Bohrung mit 1,5 ml 0,1 M PB, die 75 μL 10% Triton X-100 (0,5%) und 45 μL normales Eselserum (3%) auf einem Orbitalshaker bei 20 U / min für 30 min.
- Die Abschnitte werden in 1,5 ml Mischlösung aus primären Antikörpern mit Kaninchen-Anti-NF200 (1:1.000), Ziegen-Anti-VAChT (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) mit 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X-100 überführt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag 3x für jeweils 5 min in 0,1 M PB (pH 7,4) auf einem Orbitalschüttler bei 20 U / min.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in 1,5 ml Mischlösung von sekundären Antikörpern, die Esel-Anti-Kaninchen-AF488 (1:500) und Esel-Anti-Ziegen-AF546 (1:500) enthalten, sowie die Biomarker von α-BTX, AF647 (1:500) und Phalloidin 350 (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) enthaltend 1% normales Eselserum und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Vor Licht schützen.
- Nachdem Sie 3x für jeweils 5 min in 0,1 M PB (pH 7,4) gewaschen haben, montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern. Tragen Sie Deckglas auf die Abschnitte auf, indem Sie 50% Glycerin in destilliertem Wasser zur Beobachtung verwenden.
5. Mehrfachfluoreszierende Färbung mit NF200, S100, α-BTX und DAPI
HINWEIS: Die Verfahren ähneln denen von Schritt 4. Der Hauptunterschied besteht zwischen den primären Antikörpern und ihren entsprechenden sekundären Antikörpern.
- Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Hähnchen-Anti-NF200 (1:6.000), Kaninchen-Anti-S100 (1:2.500) in Schritt 4.2 und die entsprechenden sekundären Antikörper: Esel-Anti-Huhn-AF488 (1:500) und Esel-Anti-Kaninchen-AF546 (1:500) sowie die Biomarker von α-BTX AF647 (1:500) und DAPI (1:50000) in Schritt 4.3.
6. Beobachtung und Analysen
- Beobachten Sie die Probe und nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Bildgebungssystem auf, das mit den folgenden Objektivlinsen ausgestattet ist: 20x Objektiv mit NA von 0,75 und 40x Objektiv mit NA von 0,95.
- Verwenden Sie Anregungs- und Emissionswellenlängen von 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT und S100), 647 nm (α-BTX) oder DAPI, die der mehrfachen Fluoreszenzfärbung entsprechen. Stellen Sie die Auflösung der Bildaufnahme auf 640 x 640 Pixel ein.
HINWEIS: Die Auflösung von 640 x 640 Pixeln wird gewählt, da die Bilder in Z-Stacks aufgenommen wurden. Eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln führt zu langsamer Bildgebung und Photobleiche in Z-Stacks. - Stellen Sie die Startfokalebene und die Endfokalebene ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 1 μm oder 2 μm ein. Wählen Sie Tiefenmuster, Bilderfassung und Z-Serie.
- Für die Bilder mit geringerer Vergrößerung, die mit 20x aufgenommen wurden, nehmen Sie 40 Bilder (Z-Stacks) in 2 μm Schrittgröße aus jedem 80 μm dicken Abschnitt mit einem 105 μm Loch auf. Wählen Sie den Projektions-/Topographiemodus und die Intensitätsprojektion über die Z-Achse, um alle Bilder in einem einzigen Infokus zu integrieren.
- Für die Bilder mit höherer Vergrößerung, die mit 40x aufgenommen wurden, nehmen Sie 80 Bilder (Z-Stacks) in 1 μm Schrittgröße von jedem 80 μm dicken Schnitt mit Zoom auf 2 und einem 105 μm Pinhole auf. Integrieren Sie alle Bilder in einem einzigen Fokus.
- Rekonstruieren Sie die Bilder im dreidimensionalen Muster mit dem Bildverarbeitungssystem wie zuvor in27 beschrieben.
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Representative Results
Nach mehrfacher fluoreszierender Färbung wurde die entsprechende Markierung geordnet auf den 80 μm dicken Abschnitten des medialen Gastrocnemius-Muskels der Ratte mit NF200-positiven Nervenfasern, VAChT-positiven präsynaptischen Terminals, α-BTX-positiven postsynaptischen AchRs, S100-positiven PSCs, phalloidin-positiven Muskelfasern und DAPI-markierten Zellkernen gezeigt (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Es wurde gezeigt, dass NF200-positive Nervenfasern im Bündel liefen und Zweige an die VAChT-positiven präsynaptischen Terminals abgaben, die eine Spiegelbeziehung mit den α-BTX-positiven postsynaptischen AchRs bildeten (Abbildung 3). Darüber hinaus wurden S100-positive PSCs um die NF200-positiven Nervenfasern in der Nähe der präsynaptischen Terminals nachgewiesen (Abbildung 4).
Durch die Nutzung der Bildrekonstruktion wurde die räumliche Korrelation der Nervenfasern, präsynaptischen Terminals, PSCs und postsynaptischen AchRs in einem dreidimensionalen Muster gezeigt, das die detaillierten morphologischen Eigenschaften von NMJ aus verschiedenen Perspektiven zeigt (Abbildung 3C, C1 und Abbildung 4C, C1).
Abbildung 1. Bilder der verschiedenen Protokollschritte. (A) Durchbluten Sie die Ratte in der Haube. (B) Sezieren Sie den Musculus gastrocnemius medialis der Ratte heraus. (C) Schneiden Sie das Muskelgewebe auf einer Gefrierstufe des gleitenden Mikrotomsystems ab. (D) Sammeln Sie Gewebeabschnitte geordnet in einer Six-Well-Schale. (E) Fluoreszierende Färbung auf dem Shaker. (F) Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern. (G) Tragen Sie Deckblätter auf die Abschnitte mit 50% Glycerin auf. (H) Beobachten Sie die Proben mit einem konfokalen Bildgebungssystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Verfahren der regionalen Anatomie zur Sezierung des Musculus gastrocnemius medialis der Ratte. (A) Außenansicht der Muskeln in der Hintergliedmaße der Ratte. (B) Innenansicht des Musculus gastrocnemius medialis und seiner Innervation. (C) Sezieren des Musculus gastrocnemius medialis der Ratte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Räumliche Korrelation der Nervenfasern, präsynaptischen Terminals, postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und Muskelfasern am medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte. (A ) Repräsentatives Bild des Musculus gastrocnemius medialis der Ratte, das die multiple fluoreszierende Färbung mit Neurofilament 200 (NF200), vesikulärem Acetylcholintransporter (VAChT), Alpha-Bungarotoxin (α-BTX) und Phalloidin (Pha) zeigt. (B) Das vergrößerte Bild aus Panel A (Pfeilspitze), das die verschiedenen Beschriftungen im Detail zeigt. B1-B4: Panel B separat mit NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) und Pha (B4). (C) Die angepassten Bilder von Panel B mit dem Rahmen, der die Vorderansicht des 3D-Musters in (C) und die Rückansicht in (C1) zeigt. Gleiche Maßstabsleiste für B1-B4 wie in B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Räumliche Korrelation der Nervenfasern, perisynaptischen Schwann-Zellen, postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und Zellkernen am medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte. (A) Repräsentatives Bild des Musculus gastrocnemius medialis der Ratte, das die multiple fluoreszierende Färbung mit Neurofilament 200 (NF200), Schwann-Zellmarker (S100), Alpha-Bungarotoxin (α-BTX) und zellulärem Nukleusmarker 4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) zeigt. (B) Das vergrößerte Bild aus Panel A (Pfeilspitze), das die verschiedenen Beschriftungen im Detail zeigt. B1-B4: Zeigen Sie Panel B separat mit NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) und DAPI (B4). (C) Die angepassten Bilder von Panel B mit dem Rahmen in einem 3D-Muster in (C) und der Ansicht ohne S100-Beschriftung in (C1). Gleiche Maßstabsleiste für B1-B4 wie in B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir haben die technischen Details beschrieben, die für die Durchführung einer erfolgreichen Mehrfachfärbung von Muskelscheiben und die Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie zur Aufdeckung der morphologischen Eigenschaften von NMJ an den dicken Abschnitten des medialen Gastrocnemius-Muskels der Ratte erforderlich sind. Mit diesem Ansatz können die feinen Details und die räumliche Korrelation der PSCs und prä- und postsynaptischen Elemente unter konfokaler Mikroskopie analysiert und geschätzt und in einem dreidimensionalen Muster weiter rekonstruiert werden. Hier wurden verschiedene Arten von Biomarkern verwendet, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ aufzudecken, wobei NF200 auf den myelinisierten Axonen 20,21, VAChT, die sich an den präsynaptischen Terminals 22 akkumuliert, α-BTX auf den postsynaptischen AchRs 23,24 und S100 auf den PSCs 25,26 gezeigt wird. . Die Zusammenführung unserer Ergebnisse und denen aus früheren Studien zeigt, dass diese Biomarker frei kombiniert werden können, um die Strukturelemente von NMJ gemäß dem experimentellen Design zur Beurteilung ihrer räumlichen Beziehung zueinanderzu markieren 1,28,29.
Um mit dieser Technik eine ideale Bildgebung zu erhalten, ist die Zeit nach der Korrektur ein wichtiges Thema, auf das geachtet werden muss, da eine Überfixierung zu einem hohen Hintergrund führen kann. Daher wird empfohlen, dass die Zeit nach dem Fix in der Fixlösung nicht länger als 2 h liegen sollte. Um mehr NMJ in Muskelpartien zu beobachten, ist es außerdem wichtig, den Muskel horizontal entlang der Längsachse mit einer Dicke von 80 μm zu schneiden, was die räumliche Korrelation der präsynaptischen Terminals, postsynaptischen AchR und PSCs im NMJ umfassend demonstrieren kann. Hier sollte betont werden, dass ein Gleitmikrotom ein praktisches Werkzeug zum Schneiden des Muskelgewebes ist. In ähnlicher Weise können ein Kryostat und Vibratom auch verwendet werden, um dicke Abschnitte zu erhalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die morphologischen Eigenschaften von NMJ von zweidimensionalen histologischen Abschnitten bis hin zu dreidimensionalem Ganzkörpergewebe unter Verwendung verschiedener Techniken umfassend untersucht wurden. In Anbetracht der mühsamen und zeitaufwändigen Gewebebehandlungen zur Untersuchung mit Elektronenmikroskopie und Lichtblattmikroskopie ist die mehrfache fluoreszierende Färbung auf dem dickeren Gewebeabschnitt immer noch ein bequemer Ansatz, um die stereologische Architektur von NMJ mithilfe der konfokalen Mikroskopie effektiv zu erforschen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde gefördert durch den CACMS Innovation Fund (Nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (Nr. 82004299) und die Grundlagenforschungsfonds für die zentralen gemeinnützigen Forschungsinstitute (Nr. ZZ13-Bj.-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-BJ-034; ZZ201914001 ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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