Summary
Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Nöromüsküler bileşke (NMJ), motor nörondan iskelet kasına sinyal iletişimi için hizmet eden karmaşık bir yapıdır ve üç temel histolojik bileşenden oluşur: sinaptik öncesi motor akson terminalleri, sinaptik sonrası nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR'ler) ve peri-sinaptik Schwann hücreleri (PSC'ler). NMJ'nin morfolojik özelliklerini göstermek için, sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçildi ve motor sinir lifleri ve bunların pre-sinaptik terminalleri için nörofilament 200 (NF200) ve veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT), post-sinaptik nikotinik AchR'ler için alfa-bungarotoksin (α-BTX) dahil olmak üzere çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama kullanılarak incelendi. ve PSC'ler için S100. Bu çalışmada boyama iki grupta yapıldı: Birinci grupta örnekler NF200, VAChT ve α-BTX ile boyandı ve ikinci grupta örnekler NF200, α-BTX ve S100 ile boyandı. Her iki protokolün de NMJ'nin ayrıntılı yapısını etkili bir şekilde gösterebileceği gösterilmiştir. Konfokal mikroskop kullanılarak, sinaptik öncesi terminallerin, post-sinaptik reseptörlerin ve PSC'nin morfolojik özellikleri görüldü ve Z-yığınları görüntüleri, farklı etiketlemeler arasındaki uzamsal korelasyonu daha fazla analiz etmek için üç boyutlu bir desende yeniden yapılandırıldı. Metodoloji perspektifinden bakıldığında, bu protokoller fizyolojik koşullar altında NMJ'nin morfolojik özelliklerini araştırmak için değerli bir referans sağlar ve bu da periferik sinir hasarı ve rejenerasyon gibi NMJ'nin patolojik değişikliğini değerlendirmek için uygun olabilir.
Introduction
Nöromüsküler bileşke (NMJ)1,2,3,4'ün üç temel yapısal bileşeni olarak, sinaptik öncesi motor akson terminallerinin, nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR'ler) içeren post-sinaptik membranın ve peri-sinaptik Schwann hücrelerinin (PSC'ler) morfolojik yönleri kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. İskelet kaslarının ince kesitleri ve tam montajlı örnekleri, elektron mikroskobu 5,6, konfokal mikroskopi 7,8 ve ışık tabakası mikroskobu 9,10 gibi farklı histolojik tekniklerle incelenmiştir. NMJ'nin morfolojik özellikleri bu tekniklerle farklı yönlerden gösterilmiş olsa da, karşılaştırma olarak, konfokal mikroskopi, NMJ'nin ayrıntılı morfolojisinin görüntülenmesi için hala ideal bir seçimdir.
Son zamanlarda, NMJ'nin yapısal bileşenlerini göstermek için birçok yeni teknoloji geliştirilmiştir. Örneğin, thy1-YFP transgenik floresan fareleri, motor aksonları ve motor uç plakalarını in vivo ve in vitro 10,11'i gözlemlemek için doğrudan kullanılmıştır. Ek olarak, floresan α-BTX'in intravenöz enjeksiyonu, ışık tabakası mikroskobu 9,12 ile inceleme için doku optik temizleme tedavisi kullanılarak, vahşi tip ve transgenik floresan farelerin tüm montajlı iskelet kaslarındaki motor uç plakalarının mekansal dağılımını ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu gelişmiş yöntemlerle görülebilen sinaptik öncesi ve sonrası elemanların yanı sıra, PSC'ler aynı anda gösterilemez.
Biriken kanıtlar, PSC'lerin, periferik glial hücreler olarak, NMJ'nin gelişimine ve stabilitesine, fizyolojik durum altında NMJ'nin sinaptik aktivitesinin modülasyonuna ve sinir hasarından sonra NMJ'nin rejenerasyonuna katkıda bulunan pre-sinaptik terminallerle yakından ilişkili olduğunu göstermektedir13,14,15 . NMJ'nin hücresel mimarisi göz önüne alındığında, bu protokol PSC'leri, sinaptik öncesi ve sonrası elemanları aynı anda etiketlemek için uygun bir adaydır ve NMJ'nin bütünlüğünü ve plastisitesini normal ve patolojik koşullar altında değerlendirmek için potansiyel olarak kullanılır. Örneğin, NMJ'nin yoğunluğunu, post-sinaptik motor uç plakalarının morfolojisini ve hacmini, NMJ'nin innervasyonu ve denervasyonunu ve fizyolojik ve patolojik durumdaki kaslardaki PSC'lerin sayısını karşılaştırın.
Gastroknemius kası, baldırdaki şişkinliği oluşturan en büyük kastır ve cildin ve biseps femoris kasının uzuvdan çıkarılmasıyla kolayca diseke edilir. Kas genellikle kas atrofisi, nöromüsküler dejenerasyon, kas performansı ve motor ünite kuvveti ex vivo veya in vivo16,17,18'i değerlendirmek için seçilir. Bununla birlikte, teknik, NMJ'nin morfolojik özelliklerini çeşitli iskelet kaslarından ortaya çıkarmak için de uygundur. Aynı zamanda, kalın kas bölümleri, ince bölümler 7,8 ve alaylı kas lifleri19'a kıyasla daha eksiksiz bir morfoloji ve NMJ miktarı ortaya çıkarabilir.
Bu çalışmalar doğrultusunda, bu çalışmada sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçilmiş ve NMJ'nin yapısal bileşenlerine göre çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama için 80 μm kalınlığında dilimlenmiştir. Burada, sinir liflerini, sinaptik öncesi terminalleri, post-sinaptik AchR'leri ve PSC'leri etiketlemek için sırasıyla nörofilament 200 (NF200) 20,21, veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT) 22, alfa-bungarotoksin (α-BTX)23,24 ve S100 25,26 kullanıldı. Ek olarak, kas dokusunun ve hücresel çekirdeklerin arka planı falloidin ve DAPI ile daha da boyandı.
Bu çalışmada, NMJ'nin hücresel mimarisini, daha kalın sabit örnekler üzerinde karşılık gelen biyobelirteçlerle aynı anda boyamak için rafine bir protokol geliştirmeyi bekliyoruz; bu, konfokal mikroskopide kullanım için daha uygundur ve PSC'lerin ayrıntılı yapısı, sinaptik öncesi ve sonrası elemanlar ve birbirleriyle uzamsal korelasyonları hakkında çok daha fazla bilgi edinmeye yardımcı olur. Metodoloji açısından bakıldığında, bu protokol normal ve patolojik koşullar altında NMJ'nin morfolojik özelliklerini değerlendirmek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay No. 2021-04-15-1). Tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'na (National Academy Press, Washington, DC, 1996) uygun olarak yürütülmüştür. Üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanıldı. Sıçanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile ve yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsüne yerleştirildi. Bu çalışma için kullanılan alet ve malzemeler Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Perfüzyon
- Sıçanların ötenazisini indüklemek için intraperitoneal olarak 250 mg / kg tribromoetanol çözeltisi enjekte edin.
- Solunum durduktan sonra, makas ve forseps kullanarak kalbe erişmek için göğüs boşluğunu açın. Sol kalp ventrikülünden aort yönünde intravenöz bir kateter yerleştirin ve ardından sağ kulak kepçesini kesin.
- Deneysel fareleri kaputtaki perfüze edin. Sağ kulak kepçesinden çıkan kan temizlenene kadar 100 mL% 0.9 normal salin ile perfüze ederek başlayın, daha sonra kuyruğun bükülmesi zor olana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 250-300 mL% 4 paraformaldehit ile perfüze etmeye devam edin.
2. Bölgesel anatomi
- Perfüzyondan sonra, cerrahi bir bıçak kullanarak bilateral arka ekstremitenin derisini çıkarın (Şekil 2A) ve bilateral siyatik sinir ve medial gastroknemius kasını açığa çıkarın (Şekil 2B).
- İki taraflı medial gastroknemius kasını bir bıçak kullanarak arka bacaktan dikkatlice diseke edin (Şekil 2C) ve tüm kası 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4'lük 10 mL'lik paraformaldehit içinde sabitleyin.
- Kasları çözeltiden çıkarın ve kas tamamen çözeltiye daldırılana kadar 4 ° C'de 1 gün boyunca 0.1 M PB'de% 25 sakarozun 10 mL'sinde kası kriyokoruyun.
3. Kasın kriyoseksiyonu
- Kas dokusu çözeltiye daldırıldıktan sonra, dondurulmuş kesit ortamı kullanarak sürgülü bir mikrotom sisteminin donma aşamasına sabitleyin. Kasları, kasın uzun ekseni boyunca yatay olarak 80 μm kalınlığında dilimleyin.
- Bir fırça kullanarak kuyu başına yedi kriyo-kesiti düzenli bir şekilde, 10 mL 0,1 M PB (pH 7,4) içeren altı kuyucuklu bir kültür plakasına yerleştirin.
NOT: Bölümler, farklı kuyucuklardaki bölümler bitişik olacak şekilde sıraya göre yerleştirilir, bu da farklı lekeler için kullanılan bölümleri daha tutarlı hale getirir.
4. NF200, VAChT, α-BTX ve Pha ile çoklu floresan boyama
NOT: NF200, VAChT, α-BTX ve Pha ile çoklu floresan boyama, sırasıyla sinir liflerini, sinaptik öncesi terminalleri, sinaptik sonrası nikotinik asetilkolin reseptörlerini ve kas liflerini ortaya çıkarmak için uygulandı.
- 30 dakika boyunca 20 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 75 μL% 10 Triton X-100 (% 0.5) ve 45 μL normal eşek serumu (% 3) içeren 1.5 mL 0.1 M PB ile kuyu başına dört bölüm inkübe edin.
- Bölümleri,% 1 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 ile tavşan anti-NF200 (1: 1.000), keçi anti-VAChT (1: 500) içeren birincil antikorların 1.5 mL'lik karışık çözeltisine aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri 20 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 0,1 M PB'de (pH 7,4) 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Eşek anti-tavşan AF488 (1:500) ve eşek keçi karşıtı AF546 (1:500) içeren ikincil antikorların 1,5 mL'lik karışık çözeltisindeki bölümleri ve ayrıca α-BTX, AF647 (1:500) ve falloidin 350 (1:500) biyobelirteçlerini, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 normal eşek serumu ve% 0,5 Triton X-100 içeren 0,1 M PB'de (pH 7,4) inkübe edin. Işıktan koruyun.
- Her biri 0,1 M PB'de (pH 7,4) 5 dakika boyunca 3x yıkadıktan sonra, bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin. Gözlem için damıtılmış sudamıtılmış suda% 50 gliserin kullanarak bölümlere kapak camı uygulayın.
5. NF200, S100, α-BTX ve DAPI ile çoklu floresan boyama
NOT: Yordamlar adım 4'ünkine benzer; temel fark, birincil antikorlar ve bunlara karşılık gelen ikincil antikorlar arasındadır.
- Aşağıdaki birincil antikorları kullanın: tavuk anti-NF200 (1:6,000), adım 4.2'de tavşan anti-S100 (1:2,500) ve bunlara karşılık gelen ikincil antikorlar: eşek anti-tavuk AF488 (1:500) ve eşek anti-tavşan AF546 (1:500) ve ayrıca adım 4.3'te α-BTX AF647 (1:500) ve DAPI (1:50000) biyobelirteçleri.
6. Gözlem ve analizler
- Numuneyi gözlemleyin ve aşağıdaki objektif lenslerle donatılmış bir konfokal görüntüleme sistemi kullanarak görüntü çekin: 0,75 NA ile 20x lens ve 0,95 NA ile 40x lens.
- Çoklu floresan boyamaya karşılık gelen 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT ve S100), 647 nm (α-BTX) veya DAPI uyarma ve emisyon dalga boyları kullanın. Görüntü yakalama çözünürlüğünü 640 x 640 piksel olarak ayarlayın.
NOT: 640 x 640 piksel çözünürlük, görüntüler Z-yığınları halinde yakalandığı için seçilir. 1024 x 1024 piksel çözünürlük, yavaş görüntüleme ve Z-yığınlarında fotobeyazlatma ile sonuçlanır. - Başlangıç odak düzlemini ve bitiş odak düzlemini ayarlayın. Adım boyutunu 1 μm veya 2 μm olarak ayarlayın. Derinlik deseni, görüntü yakalama ve Z serisini seçin.
- 20x'te çekilen daha düşük büyütmeli görüntüler için, 105 μm iğne deliği kullanarak her 80 μm kalınlığındaki bölümden 2 μm adım boyutunda 40 görüntü (Z-yığını) yakalayın. Tüm görüntüleri tek bir odak noktasında bütünleştirmek için Z ekseni üzerinden projeksiyon/topografya modunu ve yoğunluk projeksiyonunu seçin.
- 40x'te çekilen daha yüksek büyütmeli görüntüler için, yakınlaştırma 2 olarak ayarlanmış ve 105 μm iğne deliği ile her 80 μm kalınlığındaki bölümden 1 μm adım boyutunda 80 görüntü (Z-yığını) yakalayın. Tüm görüntüleri tek bir odak noktasında entegre edin.
- Daha önce27'de açıklandığı gibi görüntü işleme sistemi ile üç boyutlu desendeki görüntüleri yeniden oluşturun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çoklu floresan boyama işleminden sonra, karşılık gelen etiketleme, NF200-pozitif sinir lifleri, VAChT-pozitif pre-sinaptik terminaller, α-BTX-pozitif post-sinaptik AchR'ler, S100-pozitif PSC'ler, faloidin-pozitif kas lifleri ve DAPI etiketli hücresel çekirdekler ile sıçan medial gastroknemius kasının 80 μm kalınlığındaki bölümlerinde düzenli olarak gösterilmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4).
NF200-pozitif sinir liflerinin demet halinde koştuğu ve α-BTX-pozitif post-sinaptik AchR'ler ile ayna ilişkisi oluşturan VAChT-pozitif pre-sinaptik terminallere dallar verdiği gösterilmiştir (Şekil 3). Ek olarak, ön sinaptik terminallere yakın NF200-pozitif sinir lifleri etrafında S100-pozitif PSC'ler tespit edildi (Şekil 4).
Görüntü rekonstrüksiyonundan yararlanılarak, sinir liflerinin, pre-sinaptik terminallerin, PSC'lerin ve post-sinaptik AchR'lerin uzamsal korelasyonu, NMJ'nin ayrıntılı morfolojik özelliklerini farklı perspektiflerden gösteren üç boyutlu bir desende sergilenmiştir (Şekil 3C, C1 ve Şekil 4C, C1).
Şekil 1. Çeşitli protokol adımlarının görüntüleri. (A) Sıçanı kaputun içine perfüze edin. (B) Sıçan medial gastroknemius kasını diseke edin. (C) Sürgülü mikrotom sisteminin donma aşamasında kas dokusunu kesin. (D) Doku kesitlerini altı kuyucuklu bir tabakta düzenli olarak toplayın. (E) Çalkalayıcı üzerinde floresan boyama. (F) Bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin. (G) %50 gliserin içeren bölümlere örtü fişleri uygulayın. (H) Numuneleri konfokal görüntüleme sistemi ile gözlemler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Sıçan medial gastroknemius kasının diseksiyonu için bölgesel anatomi prosedürü. (A) Sıçan arka bacağındaki kasların dışarıdan görünümü. (B) Medial gastroknemius kasının ve innervasyonunun iç görünümü. (C) Sıçan medial gastroknemius kasının diseksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Sıçan medial gastroknemius kasında sinir liflerinin, presinaptik terminallerin, post-sinaptik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin ve kas liflerinin uzamsal korelasyonu. (A ) Sıçan medial gastroknemius kasından nörofilament 200 (NF200), veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT), alfa-bungarotoksin (α-BTX) ve faloidin (Pha) ile çoklu floresan boyamasını gösteren temsili görüntü. (B ) Çeşitli etiketlemeleri ayrıntılı olarak gösteren A panelinden (ok ucu) büyütülmüş görüntü. B1-B4: panel B, NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) ve Pha (B4) ile ayrı ayrı gösterilir. (C) B panelinden 3B desenin ön görünümünü (C) ve arka görünümünü (C1) içinde gösteren çerçeve ile ayarlanmış görüntüler. B1-B4 için B'de olduğu gibi aynı ölçek çubuğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Sinir liflerinin, peri-sinaptik Schwann hücrelerinin, post-sinaptik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin ve sıçan medial gastroknemius kasındaki hücresel çekirdeklerin uzamsal korelasyonu. (A) Sıçan medial gastroknemius kasından nörofilament 200 (NF200), Schwann hücre belirteci (S100), alfa-bungarotoksin (α-BTX) ve hücresel çekirdek belirteci 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) ile çoklu floresan boyamasını gösteren temsili görüntü. (B) Çeşitli etiketlemeleri ayrıntılı olarak gösteren A panelinden (ok ucu) büyütülmüş görüntü. B1-B4: B panelini NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) ve DAPI (B4) ile ayrı ayrı gösterir. (C) B panelinden ayarlanan görüntüler, çerçeve (C) içinde 3B desende ve görünüm (C1) içinde S100 etiketsiz olarak. B1-B4 için B'de olduğu gibi aynı ölçek çubuğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kas dilimlerinin başarılı çoklu boyanması ve sıçan medial gastroknemius kasının kalın kesitlerinde NMJ'nin morfolojik özelliklerini ortaya çıkarmak için floresan immünohistokimyasının kullanılması için gerekli teknik detayları açıkladık. Bu yaklaşımı kullanarak, PSC'lerin ve sinaptik öncesi ve sonrası elemanların ince detayları ve mekansal korelasyonu, konfokal mikroskopi altında analiz edilebilir ve takdir edilebilir ve üç boyutlu bir düzende yeniden yapılandırılabilir. Burada, NMJ'nin morfolojik özelliklerini ortaya çıkarmak için çeşitli biyobelirteçler kullanılmıştır; burada NF200, miyelinli aksonlar 20,21, VAChT, sinaptik öncesi terminallerde biriken VAChT22, α-BTX, post-sinaptik AchRs 23,24'te sergilenir ve S100, PSC'ler 25,26'da gösterilir. . Sonuçlarımızı ve önceki çalışmalardan elde edilenleri bir araya getirmek, bu biyobelirteçlerin, NMJ'nin yapısal elemanlarını, birbirleriyle mekansal ilişkilerini değerlendirmek için deneysel tasarıma göre etiketlemek için serbestçe birleştirilebileceğini göstermektedir 1,28,29.
Bu teknikle ideal görüntüleme elde etmek için post-fix süresi dikkat edilmesi gereken önemli bir konudur çünkü aşırı fiksasyon yüksek arka plana neden olabilir. Bu nedenle, düzeltme çözümünde düzeltme sonrası sürenin 2 saatten fazla olmaması önerilir. Ek olarak, kas kesitlerinde daha fazla NMJ gözlemlemek için, kası uzun eksen boyunca yatay olarak 80 μm kalınlığında dilimlemek çok önemlidir, bu da NMJ'deki sinaptik öncesi terminallerin, post-sinaptik AchR'lerin ve PSC'lerin uzamsal korelasyonunu kapsamlı bir şekilde gösterebilir. Burada, kayan bir mikrotomun kas dokusunu dilimlemek için uygun bir araç olduğu vurgulanmalıdır. Benzer şekilde, kalın bölümler elde etmek için bir kriyostat ve vibratom da kullanılabilir.
Özetle, NMJ'nin morfolojik özellikleri iki boyutlu histolojik kesitlerden üç boyutlu tam montajlı dokuya kadar farklı teknikler kullanılarak geniş çapta incelenmiştir. Elektron mikroskobu ve ışık tabakası mikroskobu ile inceleme için zahmetli ve zaman alıcı doku tedavileri göz önüne alındığında, daha kalın doku bölümünde çoklu floresan boyama, konfokal mikroskopi kullanarak NMJ'nin stereolojik mimarisini etkili bir şekilde keşfetmek için hala uygun bir yaklaşımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma CACMS İnovasyon Fonu (No. CI2021A03407), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004299) ve Merkezi Kamu Refahı Araştırma Enstitüleri için Temel Araştırma Fonları (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E.
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J.
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
