Implementación de la resección de tumor cerebral mínimamente invasiva en roedores para la recolección de tejido de alta viabilidad

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más común y agresivo en adultos. A pesar de los recientes avances en neurocirugía, desarrollo de fármacos dirigidos y radioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con GBM es inferior al 5%, una estadística que no ha mejorado significativamente en más de tres décadas¹. Por lo tanto, existe la necesidad de estrategias de tratamiento más efectivas.

Para desarrollar nuevas terapias, cada vez es más evidente que los protocolos de investigación necesitan (1) utilizar modelos preclínicos traducibles que recapitulen con precisión la heterogeneidad tumoral y el microambiente, (2) reflejar el régimen terapéutico estándar utilizado en pacientes con GBM, que actualmente incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia, y (3) explicar la diferencia entre núcleo resecado y residual, tejidos tumorales invasivos 2,3,4,5. Sin embargo, la mayoría de los modelos preclínicos de tumores cerebrales actualmente disponibles no implementan la resección quirúrgica o utilizan modelos de resección quirúrgica que requieren relativamente tiempo, lo que lleva a una cantidad significativa de pérdida de sangre o falta de estandarización. Además, realizar la resección de tumores cerebrales de roedores puede ser un desafío debido a la falta de herramientas o protocolos quirúrgicos clínicamente comparables y la ausencia de una plataforma establecida⁶ para la recolección sistemática de tejidos (Tabla 1).

El presente protocolo tiene como objetivo describir un paradigma estandarizado para la resección de tumores cerebrales de roedores y la preservación de tejidos utilizando un sistema de resección mínimamente invasiva no ablativa (MIRS) multifuncional y un sistema integrado de preservación de tejidos (TPS) (Figura 1). Se espera que esta técnica única proporcione una plataforma estandarizada que se pueda utilizar en varios estudios en investigación preclínica para GBM y otros tipos de modelos de tumores cerebrales. Los investigadores que investigan modalidades terapéuticas o diagnósticas para tumores cerebrales pueden implementar este protocolo para lograr una resección estandarizada en sus estudios.

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Maryland y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6, de 6-8 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). Se siguieron todas las regulaciones de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2), incluido el uso de máscaras, guantes y batas.

1. Implantación inicial del tumor intracraneal

1. En la fase inicial del estudio, inyectar intracranealmente a cada ratón 100.000 células (línea celular de glioma murino GL261) suspendidas en 4 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) a una profundidad de 2,5 mm siguiendo el informe previamente publicado⁷.
2. Cuantificar la señal tumoral en cada ratón utilizando el sistema de imágenes in vivo ⁸ 9 días después de la implantación del tumor.
   NOTA: Si es necesario, estratificar a los ratones en dos grupos según la carga tumoral. En el presente estudio, los dos grupos fueron: (1) ratones con carga tumoral relativamente pequeña (señal bioluminiscente media = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 fotones / s, n = 10) y (2) ratones con carga tumoral relativamente grande (señal bioluminiscente media = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 fotones / s, n = 10), (p < 0.05, prueba de Mann-Whitney)⁹.
3. Divide cada grupo en dos subgrupos comparables.
   NOTA: En este estudio, los dos subgrupos fueron: ratones no tratados (n = 5) y ratones con tumores sometidos a resección quirúrgica utilizando el MIRS (n = 5), (p > 0,05, prueba de Mann-Whitney)⁹.
4. A partir del día de la resección, realice un seguimiento de la progresión del tumor utilizando el sistema de imágenes in vivo a una frecuencia basada en el patrón de crecimiento del tumor.
   NOTA: Para la línea celular GL261, haga un seguimiento de la progresión del tumor el día de la resección y luego cada 3-6 días.

2. Resección tumoral mediante MIRS

1. Anestesiar al ratón usando una mezcla de gas isoflurano-O2 en una cámara de inducción o inyección intraperitoneal de solución de xilazina/ketamina.
   1. Si usa el anestésico de gas, ajuste el caudal de gas a 1.0 ml / min y el vaporizador al 2.0% para la inducción de anestesia, que generalmente requiere de 3 a 5 minutos en la cámara (consulte la Tabla de materiales).
   2. Si usa el anestésico inyectable, anestesiar a los ratones inyectando 0.2 ml de solución anestésica (80-100 mg / kg de ketamina y 10-12.5 mg / kg de xilazina, ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal.
2. Evalúe al animal para una sedación adecuada pellizcando el dedo del pie. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Administrar un analgésico (0,03-0,06 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea) antes del procedimiento.
3. Coloque el ratón sobre el marco estereotáctico (consulte la Tabla de materiales) una vez que se haya confirmado la sedación completa.
   NOTA: Si usa el anestésico gaseoso, coloque la nariz del ratón en un cono nasal donde continuará recibiendo la mezcla de isoflurano-O2 durante el procedimiento (1.5%).
4. Retire la grapa anterior, luego retire el vello con una crema depilatoria o afeitándose. Desinfecte la piel con ciclos alternos de un exfoliante a base de clorhexidina/betadina y alcohol. Luego, usando un bisturí estéril, cree una incisión longitudinal de 1 cm en la línea media a lo largo de la cicatriz quirúrgica anterior.
5. Acople la pieza de mano MIRS al brazo estereotáctico a través del adaptador de escenario/soporte de la pieza de mano para mejorar la estabilidad y la precisión.
6. Configure la máquina MIRS (consulte Tabla de materiales) utilizando la siguiente configuración (Figura 1).
   1. Inserte el cable de alimentación colocado en el panel posterior en el receptáculo del cable de alimentación. Encienda o apague el sistema alternando (1 = ON, 0 = OFF).
   2. Inserte un extremo de la manguera de nitrógeno (suministrada con la consola) en el accesorio macho del panel posterior de la consola. Gire la tuerca de conexión en el sentido de las agujas del reloj para apretar la conexión.
      NOTA: El extremo opuesto de la manguera debe estar conectado al suministro de nitrógeno.
   3. Antes de conectar la manguera al suministro de nitrógeno, confirme que la presión de suministro no supere los 100 psig, que es la presión de suministro de entrada recomendada para la consola.
      NOTA: La consola generará su propia aspiración cuando se active con el pedal una vez que se haya suministrado nitrógeno a la consola.
   4. Asegure la tapa del puerto de vacío y séllelo para evitar fugas en el sistema de vacío. Cualquier fuga en el sistema de aspiración afectará el rendimiento de la consola MIRS.
   5. Si la aspiración es inferior a 17 durante la configuración o el cebado, compruebe que la perilla de aspiración en la parte frontal de la consola esté ajustada al nivel máximo (100), asegúrese de que no haya fugas en el sistema de aspiración y confirme que la presión de suministro de entrada de nitrógeno es correcta.
   6. Para conectar el pedal a la consola, inserte el conector gris del pedal en su receptáculo gris hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector del pedal se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
   7. Para conectar la pieza de mano a la consola, inserte el conector azul de la pieza de mano en su receptáculo azul hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector de la pieza de mano se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
   8. Prepare cada pieza de mano antes de usar el sistema aspirando líquido estéril de un recipiente pequeño en la abertura, a través del tubo y la pieza de mano, y luego en el recipiente para asegurarse de que el interior del tubo y la pieza de mano estén lubricados para reducir las oclusiones del tejido.
   9. Prepárese para la aspiración sola o la aspiración con corte seleccionando el modo apropiado en el panel frontal de la consola. Inicie usando el pedal.
7. Inserte la cánula MIRS de 23 G en el orificio de rebabas a una profundidad de 2,5 mm.
8. Inicie el proceso de resección presionando el pedal conectado a la cánula. Realice un ciclo completo (360°) o más de resección utilizando la perilla de control de la pieza de mano.
   NOTA: Cuantos más ciclos se realicen, más volumen de tejido tumoral se reseque.
9. Una vez que se complete el proceso de resección, retire la cánula MIRS 23 G del orificio de rebabas y use 5 ml de 1x PBS para enjuagar el tubo y desalojar cualquier residuo residual.
10. Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la herida con una grapadora o material de sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales).
11. Coloque el ratón en una almohadilla térmica o bajo una luz cálida durante la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a su jaula.
12. Una vez completado el experimento, purgue la cánula mediante el lavado. Alterne con medios refrigerados y aire para "empujar" todo el tejido resecado de vuelta al recipiente de recolección. Retire el recipiente de recolección del sistema y tape con la tapa proporcionada.
13. Después de completar el paso 2.12, coloque la punta distal de la cánula en 3% H 2 O₂ y aplique succión a 24-25 in Hg para llenar la línea de succión de nuevo al recipiente de recolección de succión y deje reposar durante 60-90 s. Enjuague con medios estériles que pulsan aire y medios intermitentemente.
14. Controle a los ratones para detectar cualquier signo neurológico (movimientos erráticos anormales o convulsiones) después del procedimiento.
15. Eutanasia a los ratones con deficiencias neurológicas graves (se vuelven letárgicos, tienen una apariencia demacrada, encorvados hacia atrás o tienen movimientos erráticos).
    NOTA: Para el presente estudio, se utilizaron 200 mg/kg de una solución de eutanasia disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) para sacrificar a cada ratón.

3. Recolección de tejidos a través de TPS

1. Sumerja la muestra del tumor en una placa de cultivo de tejido que contenga un medio de lisis de glóbulos rojos (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: El tejido cosechado del MIRS en el TPS será principalmente en forma de células individuales junto con pequeños trozos de tejido.
2. Coloque un filtro de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) en un tubo cónico de 50 ml y use un émbolo de una jeringa de 5 ml para pasar la muestra del tumor a través del filtro.
3. Con una pipeta de transferencia, utilice el medio RPMI-1640 para facilitar el paso de las células y cualquier masa de tejido a través del filtro.
4. Centrifugar a 428 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante con una pipeta.
5. Resuspender cada muestra en 5 mL de medio preparado RPMI-1640.
6. Para aumentar la viabilidad del tejido, especialmente si se visualizan trozos grandes de tejido en la impresión inicial, agregue los volúmenes requeridos del cóctel de enzimas (que contiene DNAsa I, colagenasa IV, dispasa, papaína y EDTA, consulte la Tabla de materiales) a cada muestra. Usa el vórtice para mezclar las soluciones.
   NOTA: El paso 3.6 es opcional. La composición del cóctel enzimático (para un volumen total de 5 mL/muestra): 300 μL de DNAsa I Grado II, 150 μL de Colagenasa/Dispasa (escinde fibronectina, colagenasa IV, I y aminoácidos no polares), 250 μL de Papaína (proteasa inespecífica) y 6 μL de 0,5 M EDTA.
7. Colocar las muestras en una incubadora agitadora a 200 rpm, 37 °C durante 20 min.
8. Después de 20 minutos, girar las muestras a 428 x g durante 5 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
9. Filtrar células individuales a través de un filtro celular de 70 μm y girar hacia abajo a 274 x g durante 3 min a 4 °C. Realizar análisis de viabilidad celular¹⁰ con Trypan Blue y Hemocytometer (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La viabilidad del día 0 oscila entre el 30% y el 70% y aumenta significativamente en 2-3 días.
10. Continúe con los pasos 4, 5 o 6, dependiendo de la prueba de viabilidad necesaria.

4. Cultivo de células en cultivo adherente

1. En una campana de flujo laminar certificada, resuspenda el pellet en un medio adherente que contenga suero (como DMEM, suero bovino fetal al 10% (FBS) y solución de penicilina/estreptomicina (P/S) al 1%) y células en placa en un matraz celular adherente.
2. Mantener las células en un ambiente incubado controlado (37 °C, 5%_CO2).

5. Cultivo de células en cultivo en suspensión (neuroesferas)

1. En una campana de flujo laminar certificada, resuspender el pellet en medio de células madre completas¹¹ sin suero y colocar en un matraz de suspensión.
2. Mantener las células en un ambiente incubado controlado (37 °C, 5%_CO2) durante 2-3 días para permitir la formación de la neurosfera.
3. Después de la visualización de las neuroesferas en el medio de cultivo, use tripsina-EDTA o Accutase (ver Tabla de materiales) para obtener suspensiones unicelulares para la pasificación.
   NOTA: Siempre que se tenga especial cuidado durante la cosecha y se utilicen medios apropiados que apoyen las células madre neurales, las células madre en el tejido cosechado deben formar neuroesferas en unos pocos días.

6. Preparación de las células para el reimplante

1. Resuspender el pellet a una concentración de 100.000 células vivas por 4 μL de 1x PBS.
2. Inyectar inmediatamente en ratones naïve utilizando el método de implantación del tumor intracraneal (paso 1).

7. Análisis histológico

1. Inmediatamente después de la resección, extraer y fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 24 h¹².
2. Transfiera los cerebros a una solución de sacarosa al 30% hasta que estén saturados con sacarosa (hundidos hasta el fondo del recipiente).
3. Transfiera los cerebros a una solución de etanol al 70%.
4. Realizar la incrustación de bloques de parafina, la sección y la tinción estándar de hematoxilina y eosina (H&E) después del informe¹³ publicado anteriormente.
   NOTA: El espesor de cada sección tomada para la tinción fue de 10 μm.

La resección quirúrgica con el MIRS resulta en una disminución significativa de la carga tumoral
En el grupo con una carga tumoral más pequeña, la señal bioluminiscente basal media fue de 5,5e+006 fotones/s ± 0,2e+006 en el subgrupo que se sometió a resección. Después de la resección, la señal bioluminiscente media disminuyó a 3.09e+006 fotones/s ± 0.3e+006, (p <0.0001, prueba de Mann-Whitney)9 (Figura 2). La señal bioluminiscente aumentó en los días siguientes hasta que los ratones fueron sacrificados. Del mismo modo, en el grupo con una mayor carga tumoral, la señal bioluminiscente basal media fue de 1,68e + 007 fotones / s ± 0,1e + 007 en el subgrupo que se sometió a resección. Después de la resección, la señal bioluminiscente media disminuyó a 5,19e+006 fotones/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, prueba de Mann-Whitney)9. La señal bioluminiscente aumentó en los días siguientes hasta que los ratones fueron sacrificados.

La resección utilizando el MIRS se puede ajustar para el volumen deseado de resección
En las imágenes previas a la resección de tumores singénicos CT2A, el tumor se puede identificar generalmente como una masa heterogénea en el sitio de inoculación con arquitectura parenquimatosa alterada y edema peritumoral y hemorragia indicados por áreas heterogéneas de hipo e hiperintensidad ponderadas en T2 (T2w). La pista de aguja utilizada para la inyección estereotáctica de células tumorales se puede identificar en las resonancias magnéticas T2w14.

La cavidad de resección se puede identificar en las imágenes de resonancia magnética T2w posteriores a la resección como un área hipointensa redonda grande en el sitio de inoculación del tumor (Figura 3). El procedimiento de resección no causó pérdida significativa de sangre o alteración de la arquitectura cerebral circundante. En algunos casos, se acumuló líquido en la cavidad de resección. Como se muestra en la Figura 4, el volumen de resección aumentó significativamente de 9,4 mm 3 para una rotación de la abertura de corte a 23,2 mm3 para dos rotaciones (p = 0,0117), lo que permite ajustar la resección de volumen para optimizar una carga tumoral conocida.

La resección tumoral con el MIRS conduce a una prolongación de 7 días en la mediana de supervivencia de ratones portadores de tumores sin inducir ningún signo neurológico
Como se muestra en la Figura 5, hubo una prolongación en la supervivencia de los ratones que se sometieron a resección quirúrgica en ambos grupos con tumores pequeños (6 días) y grandes (7 días). En el grupo con una carga tumoral menor, la mediana de supervivencia del subgrupo control fue de 16 días, mientras que la mediana de supervivencia del subgrupo que se sometió a resección fue de 22 días (p = 0,0044). Del mismo modo, en el grupo con una mayor carga tumoral, la mediana de supervivencia del subgrupo control fue de 12 días, mientras que la mediana de supervivencia del subgrupo que se sometió a resección fue de 19 días (p = 0,0043). Además, ninguno de los ratones sometidos a resección utilizando el MIRS mostró ningún signo de lesión neurológica después del procedimiento. Esto indica que el MIRS puede lograr una resección segura.

El tejido resecado utilizando el MIRS tiene alta viabilidad in vitro e in vivo
Las células extraídas del tejido resecado se filtraron, cuantificaron y resuspendieron en el medio apropiado (Figura 6) antes de realizar experimentos de viabilidad in vitro o in vivo . Para examinar la viabilidad in vitro de las células y confirmar la resección del tumor y no el parénquima cerebral normal, las células se cultivaron en cultivo en suspensión. La formación de la neurosfera, un indicador del potencial de iniciación tumoral, ocurrió con un procesamiento tisular mínimo después de la resección. Esto sugirió que la plataforma MIRS recolectó tejido bien disociado y tuvo un impacto mínimo en la salud y viabilidad del tejido resecado. Las muestras tomadas directamente del TPS a la microscopía óptica parecían ser principalmente en forma de células individuales junto con la presencia de unos pocos trozos pequeños de tejido. La viabilidad del día 0 osciló entre el 30% y el 70% (esto representa la viabilidad después de pasar la muestra a través de un filtro de 70 μm y antes del recubrimiento). El dispositivo de resección tiene una abertura de corte que puede girar 360 ° en el eje de la sonda de resección, lo que permite la resección de volúmenes de tejido concéntrico. En promedio, se pueden cosechar 2-3 millones de celdas con un giro de 360 ° de la apertura de corte, aproximadamente 7 millones de celdas con dos vueltas y se puede obtener un total de 12-14 millones de celdas con tres vueltas de 360 ° de la apertura de corte. Después de colocar en matraces de suspensión que contenían un medio de células madre completo sin suero, las neuroesferas fueron visibles por microscopía óptica el día 2 y a simple vista el día 7 (Figura 7).

Para examinar la viabilidad in vivo , las células extraídas se implantaron intracranealmente en ratones C57BL / 6 naïve (n = 8 ratones, 100,000 células vivas / ratón). El crecimiento tumoral se confirmó utilizando el sistema de imágenes in vivo . La señal tumoral continuó aumentando hasta que todos los animales fueron sacrificados en el día 14 después de la implantación del tumor (mediana de supervivencia de 11 días).

La sección representativa de tejido H&E (Figura 3B) contiene una cavidad de resección circular clara con un borde de productos sanguíneos (rosa intenso), inflamación y células tumorales residuales (células de color púrpura oscuro). Macroscópicamente, las células tumorales residuales son mesenquimales en naturaleza e infiltrativas, exhibiendo una extensa invasión y proliferación perivascular. Microscópicamente, se identificaron marcadas atipias nucleares y figuras mitóticas. También se identificaron macrófagos asociados a tumores alrededor de áreas de tejido infartado y microhemorragias. La arquitectura del tejido en el parénquima cerebral circundante no pareció estar alterada.

Figura 1: Configuración del sistema MIRS. (A) Sistema de resección mínimamente invasivo (MIRS) para tumor cerebral en modelos de roedores con un sistema integrado de preservación de tejidos. (B) Panel frontal de la consola MIRS. 1 = Potencia del sistema, 2 = Pedal, 3 = Botón principal, 4 = Aspiración, 5 = Dial de control de nivel de aspiración, 6 = Indicador de nivel de aspiración, 7 = Pieza de mano, 8 = Botón de activación del cortador. (C) Panel posterior de la consola MIRS. 1 = Receptáculo del cable de alimentación, 2 = Disyuntor, 3 = Entrada de suministro de nitrógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cambios en la carga tumoral promedio en ratones con tumores no tratados versus ratones sometidos a resección de tumores por MIRS. (A) Ratones con carga tumoral basal pequeña y (B) ratones con gran carga tumoral basal (p < 0.0001, SD ≤0.3e + 006 en todos los grupos en cada punto de tiempo y demasiado pequeño para mostrarse en el gráfico). Los animales sucumbieron a la carga tumoral o fueron sacrificados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resonancia magnética y análisis de H&E. (A) Imágenes de resonancia magnética cerebral ponderadas en T2 antes y después de la resección y (B) una sección cerebral coronal representativa teñida con H&E que muestra una cavidad de resección circular clara con un borde de productos sanguíneos (rosa oscuro), inflamación y células tumorales residuales (células de color púrpura oscuro). Las imágenes de resonancia magnética y las secciones de H&E se obtuvieron inmediatamente después de la resección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Determinación del volumen de resección tumoral. Los volúmenes promedio calculados a partir de imágenes de resonancia magnética de cavidades de resección creadas con uno vs. dos rotaciones de la apertura de corte, n = 4 por grupo. p = 0,01, prueba T de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Curvas de Kaplan-Meier de ratones con tumores no tratados versus ratones sometidos a resección de tumores por MIRS . (A) Ratones con pequeña carga tumoral basal. (B) Ratones con gran carga tumoral basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Prueba de viabilidad de las células tumorales resecadas. (A) Imágenes representativas de microscopía óptica de tejido cosechado con MIRS el día 0 a 20x. (B) Curva de Kaplan-Meier que describe la supervivencia de ratones después de la implantación intracraneal de células recolectadas de tejido resecado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Formación de neuroesferas. Imágenes representativas de microscopía óptica de neuroesferas generadas a partir de tejido resecado en el día 2 después de la resección en (A) 20x y (B) 10x, y en el día 7 después de la resección en (C) 20x y (D) 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación entre el sistema de resección mínimamente invasiva (MIRS) y los modelos históricos de resección quirúrgica.

BT tiene fondos de investigación de NIH y es copropietaria de Accelerating Combination Therapies*, y Ashvattha Therapeutics Inc. ha licenciado una de sus patentes. GW tiene fondos de los NIH (R01NS107813). HB es un consultor pagado de Insightec y presidente del Consejo Asesor Médico de la compañía. Este acuerdo ha sido revisado y aprobado por la Universidad Johns Hopkins siguiendo sus políticas de conflicto de intereses. HB tiene fondos de investigación de NIH, Johns Hopkins University y filantropía y es consultor para CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* y Nurami Medical*. (*incluye acciones u opciones).