Artículo de método

Implementación de la resección de tumor cerebral mínimamente invasiva en roedores para la recolección de tejido de alta viabilidad

DOI:

10.3791/64048

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9 de mayo de 2022

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe una resección estandarizada de tumores cerebrales en roedores a través de un enfoque mínimamente invasivo con un sistema integrado de preservación de tejidos. Esta técnica tiene implicaciones para reflejar con precisión el estándar de atención en roedores y otros modelos animales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe un paradigma estandarizado para la resección de tumores cerebrales de roedores y la preservación de tejidos. En la práctica clínica, la resección tumoral máxima es el tratamiento estándar para la mayoría de los tumores cerebrales. Sin embargo, la mayoría de los modelos preclínicos de tumores cerebrales actualmente disponibles no incluyen la resección o utilizan modelos de resección quirúrgica que requieren mucho tiempo y conducen a una morbilidad, mortalidad o variabilidad experimental posoperatorias significativas. Además, realizar la resección en roedores puede ser desalentador por varias razones, incluida la falta de herramientas o protocolos quirúrgicos clínicamente comparables y la ausencia de una plataforma establecida para la recolección estandarizada de tejidos. Este protocolo destaca el uso de un dispositivo de resección multifuncional y no ablativo y un sistema integrado de preservación de tejidos adaptado de la versión clínica del dispositivo. El dispositivo aplicado en el presente estudio combina succión sintonizable y una cuchilla cilíndrica en la abertura para sondear, cortar y succionar con precisión el tejido. El dispositivo de resección mínimamente invasivo realiza sus funciones a través del mismo orificio de rebaba utilizado para la implantación inicial del tumor. Este enfoque minimiza las alteraciones en la anatomía regional durante las cirugías de biopsia o resección y reduce el riesgo de pérdida significativa de sangre. Estos factores redujeron significativamente el tiempo operatorio (<2 min/animal), mejoraron la supervivencia animal postoperatoria, disminuyeron la variabilidad en los grupos experimentales y dieron lugar a una alta viabilidad de los tejidos y células resecados para futuros análisis. Este proceso se ve facilitado por una velocidad de cuchilla de ~ 1,400 ciclos / min, que permite la recolección de tejidos en un sistema cerrado estéril que se puede llenar con una solución fisiológica de elección. Dada la importancia emergente de estudiar y modelar con precisión el impacto de la cirugía, la preservación y el análisis comparativo riguroso de muestras de resección tumoral regionalizadas y terapias administradas dentro de la cavidad, este protocolo único ampliará las oportunidades para explorar preguntas sin respuesta sobre el manejo perioperatorio y el descubrimiento terapéutico para pacientes con tumores cerebrales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más común y agresivo en adultos. A pesar de los recientes avances en neurocirugía, desarrollo de fármacos dirigidos y radioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con GBM es inferior al 5%, una estadística que no ha mejorado significativamente en más de tres décadas1. Por lo tanto, existe la necesidad de estrategias de tratamiento más efectivas.

Para desarrollar nuevas terapias, cada vez es más evidente que los protocolos de investigación necesitan (1) utilizar modelos preclínicos traducibles que recapitulen con precisión la heterogeneidad tumoral y el microambiente, (2) reflejar el régimen terapéutico estándar utilizado en pacientes con GBM, que actualmente incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia, y (3) explicar la diferencia entre núcleo resecado y residual, tejidos tumorales invasivos 2,3,4,5. Sin embargo, la mayoría de los modelos preclínicos de tumores cerebrales actualmente disponibles no implementan la resección quirúrgica o utilizan modelos de resección quirúrgica que requieren relativamente tiempo, lo que lleva a una cantidad significativa de pérdida de sangre o falta de estandarización. Además, realizar la resección de tumores cerebrales de roedores puede ser un desafío debido a la falta de herramientas o protocolos quirúrgicos clínicamente comparables y la ausencia de una plataforma establecida6 para la recolección sistemática de tejidos (Tabla 1).

El presente protocolo tiene como objetivo describir un paradigma estandarizado para la resección de tumores cerebrales de roedores y la preservación de tejidos utilizando un sistema de resección mínimamente invasiva no ablativa (MIRS) multifuncional y un sistema integrado de preservación de tejidos (TPS) (Figura 1). Se espera que esta técnica única proporcione una plataforma estandarizada que se pueda utilizar en varios estudios en investigación preclínica para GBM y otros tipos de modelos de tumores cerebrales. Los investigadores que investigan modalidades terapéuticas o diagnósticas para tumores cerebrales pueden implementar este protocolo para lograr una resección estandarizada en sus estudios.

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Protocolo

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Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Maryland y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6, de 6-8 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). Se siguieron todas las regulaciones de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2), incluido el uso de máscaras, guantes y batas.

1. Implantación inicial del tumor intracraneal

  1. En la fase inicial del estudio, inyectar intracranealmente a cada ratón 100.000 células (línea celular de glioma murino GL261) suspendidas en 4 μL de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) a una profundidad de 2,5 mm siguiendo el informe previamente publicado7.
  2. Cuantificar la señal tumoral en cada ratón utilizando el sistema de imágenes in vivo 8 9 días después de la implantación del tumor.
    NOTA: Si es necesario, estratificar a los ratones en dos grupos según la carga tumoral. En el presente estudio, los dos grupos fueron: (1) ratones con carga tumoral relativamente pequeña (señal bioluminiscente media = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 fotones / s, n = 10) y (2) ratones con carga tumoral relativamente grande (señal bioluminiscente media = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 fotones / s, n = 10), (p < 0.05, prueba de Mann-Whitney)9.
  3. Divide cada grupo en dos subgrupos comparables.
    NOTA: En este estudio, los dos subgrupos fueron: ratones no tratados (n = 5) y ratones con tumores sometidos a resección quirúrgica utilizando el MIRS (n = 5), (p > 0,05, prueba de Mann-Whitney)9.
  4. A partir del día de la resección, realice un seguimiento de la progresión del tumor utilizando el sistema de imágenes in vivo a una frecuencia basada en el patrón de crecimiento del tumor.
    NOTA: Para la línea celular GL261, haga un seguimiento de la progresión del tumor el día de la resección y luego cada 3-6 días.

2. Resección tumoral mediante MIRS

  1. Anestesiar al ratón usando una mezcla de gas isoflurano-O2 en una cámara de inducción o inyección intraperitoneal de solución de xilazina/ketamina.
    1. Si usa el anestésico de gas, ajuste el caudal de gas a 1.0 ml / min y el vaporizador al 2.0% para la inducción de anestesia, que generalmente requiere de 3 a 5 minutos en la cámara (consulte la Tabla de materiales).
    2. Si usa el anestésico inyectable, anestesiar a los ratones inyectando 0.2 ml de solución anestésica (80-100 mg / kg de ketamina y 10-12.5 mg / kg de xilazina, ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal.
  2. Evalúe al animal para una sedación adecuada pellizcando el dedo del pie. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. Administrar un analgésico (0,03-0,06 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea) antes del procedimiento.
  3. Coloque el ratón sobre el marco estereotáctico (consulte la Tabla de materiales) una vez que se haya confirmado la sedación completa.
    NOTA: Si usa el anestésico gaseoso, coloque la nariz del ratón en un cono nasal donde continuará recibiendo la mezcla de isoflurano-O2 durante el procedimiento (1.5%).
  4. Retire la grapa anterior, luego retire el vello con una crema depilatoria o afeitándose. Desinfecte la piel con ciclos alternos de un exfoliante a base de clorhexidina/betadina y alcohol. Luego, usando un bisturí estéril, cree una incisión longitudinal de 1 cm en la línea media a lo largo de la cicatriz quirúrgica anterior.
  5. Acople la pieza de mano MIRS al brazo estereotáctico a través del adaptador de escenario/soporte de la pieza de mano para mejorar la estabilidad y la precisión.
  6. Configure la máquina MIRS (consulte Tabla de materiales) utilizando la siguiente configuración (Figura 1).
    1. Inserte el cable de alimentación colocado en el panel posterior en el receptáculo del cable de alimentación. Encienda o apague el sistema alternando (1 = ON, 0 = OFF).
    2. Inserte un extremo de la manguera de nitrógeno (suministrada con la consola) en el accesorio macho del panel posterior de la consola. Gire la tuerca de conexión en el sentido de las agujas del reloj para apretar la conexión.
      NOTA: El extremo opuesto de la manguera debe estar conectado al suministro de nitrógeno.
    3. Antes de conectar la manguera al suministro de nitrógeno, confirme que la presión de suministro no supere los 100 psig, que es la presión de suministro de entrada recomendada para la consola.
      NOTA: La consola generará su propia aspiración cuando se active con el pedal una vez que se haya suministrado nitrógeno a la consola.
    4. Asegure la tapa del puerto de vacío y séllelo para evitar fugas en el sistema de vacío. Cualquier fuga en el sistema de aspiración afectará el rendimiento de la consola MIRS.
    5. Si la aspiración es inferior a 17 durante la configuración o el cebado, compruebe que la perilla de aspiración en la parte frontal de la consola esté ajustada al nivel máximo (100), asegúrese de que no haya fugas en el sistema de aspiración y confirme que la presión de suministro de entrada de nitrógeno es correcta.
    6. Para conectar el pedal a la consola, inserte el conector gris del pedal en su receptáculo gris hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector del pedal se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
    7. Para conectar la pieza de mano a la consola, inserte el conector azul de la pieza de mano en su receptáculo azul hasta que haga clic y encaje en su posición.
      NOTA: El conector de la pieza de mano se conecta a la consola en una orientación y está codificado.
    8. Prepare cada pieza de mano antes de usar el sistema aspirando líquido estéril de un recipiente pequeño en la abertura, a través del tubo y la pieza de mano, y luego en el recipiente para asegurarse de que el interior del tubo y la pieza de mano estén lubricados para reducir las oclusiones del tejido.
    9. Prepárese para la aspiración sola o la aspiración con corte seleccionando el modo apropiado en el panel frontal de la consola. Inicie usando el pedal.
  7. Inserte la cánula MIRS de 23 G en el orificio de rebabas a una profundidad de 2,5 mm.
  8. Inicie el proceso de resección presionando el pedal conectado a la cánula. Realice un ciclo completo (360°) o más de resección utilizando la perilla de control de la pieza de mano.
    NOTA: Cuantos más ciclos se realicen, más volumen de tejido tumoral se reseque.
  9. Una vez que se complete el proceso de resección, retire la cánula MIRS 23 G del orificio de rebabas y use 5 ml de 1x PBS para enjuagar el tubo y desalojar cualquier residuo residual.
  10. Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la herida con una grapadora o material de sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales).
  11. Coloque el ratón en una almohadilla térmica o bajo una luz cálida durante la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a su jaula.
  12. Una vez completado el experimento, purgue la cánula mediante el lavado. Alterne con medios refrigerados y aire para "empujar" todo el tejido resecado de vuelta al recipiente de recolección. Retire el recipiente de recolección del sistema y tape con la tapa proporcionada.
  13. Después de completar el paso 2.12, coloque la punta distal de la cánula en 3% H 2 O2 y aplique succión a 24-25 in Hg para llenar la línea de succión de nuevo al recipiente de recolección de succión y deje reposar durante 60-90 s. Enjuague con medios estériles que pulsan aire y medios intermitentemente.
  14. Controle a los ratones para detectar cualquier signo neurológico (movimientos erráticos anormales o convulsiones) después del procedimiento.
  15. Eutanasia a los ratones con deficiencias neurológicas graves (se vuelven letárgicos, tienen una apariencia demacrada, encorvados hacia atrás o tienen movimientos erráticos).
    NOTA: Para el presente estudio, se utilizaron 200 mg/kg de una solución de eutanasia disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) para sacrificar a cada ratón.

3. Recolección de tejidos a través de TPS

  1. Sumerja la muestra del tumor en una placa de cultivo de tejido que contenga un medio de lisis de glóbulos rojos (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: El tejido cosechado del MIRS en el TPS será principalmente en forma de células individuales junto con pequeños trozos de tejido.
  2. Coloque un filtro de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) en un tubo cónico de 50 ml y use un émbolo de una jeringa de 5 ml para pasar la muestra del tumor a través del filtro.
  3. Con una pipeta de transferencia, utilice el medio RPMI-1640 para facilitar el paso de las células y cualquier masa de tejido a través del filtro.
  4. Centrifugar a 428 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante con una pipeta.
  5. Resuspender cada muestra en 5 mL de medio preparado RPMI-1640.
  6. Para aumentar la viabilidad del tejido, especialmente si se visualizan trozos grandes de tejido en la impresión inicial, agregue los volúmenes requeridos del cóctel de enzimas (que contiene DNAsa I, colagenasa IV, dispasa, papaína y EDTA, consulte la Tabla de materiales) a cada muestra. Usa el vórtice para mezclar las soluciones.
    NOTA: El paso 3.6 es opcional. La composición del cóctel enzimático (para un volumen total de 5 mL/muestra): 300 μL de DNAsa I Grado II, 150 μL de Colagenasa/Dispasa (escinde fibronectina, colagenasa IV, I y aminoácidos no polares), 250 μL de Papaína (proteasa inespecífica) y 6 μL de 0,5 M EDTA.
  7. Colocar las muestras en una incubadora agitadora a 200 rpm, 37 °C durante 20 min.
  8. Después de 20 minutos, girar las muestras a 428 x g durante 5 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  9. Filtrar células individuales a través de un filtro celular de 70 μm y girar hacia abajo a 274 x g durante 3 min a 4 °C. Realizar análisis de viabilidad celular10 con Trypan Blue y Hemocytometer (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La viabilidad del día 0 oscila entre el 30% y el 70% y aumenta significativamente en 2-3 días.
  10. Continúe con los pasos 4, 5 o 6, dependiendo de la prueba de viabilidad necesaria.

4. Cultivo de células en cultivo adherente

  1. En una campana de flujo laminar certificada, resuspenda el pellet en un medio adherente que contenga suero (como DMEM, suero bovino fetal al 10% (FBS) y solución de penicilina/estreptomicina (P/S) al 1%) y células en placa en un matraz celular adherente.
  2. Mantener las células en un ambiente incubado controlado (37 °C, 5%CO2).

5. Cultivo de células en cultivo en suspensión (neuroesferas)

  1. En una campana de flujo laminar certificada, resuspender el pellet en medio de células madre completas11 sin suero y colocar en un matraz de suspensión.
  2. Mantener las células en un ambiente incubado controlado (37 °C, 5%CO2) durante 2-3 días para permitir la formación de la neurosfera.
  3. Después de la visualización de las neuroesferas en el medio de cultivo, use tripsina-EDTA o Accutase (ver Tabla de materiales) para obtener suspensiones unicelulares para la pasificación.
    NOTA: Siempre que se tenga especial cuidado durante la cosecha y se utilicen medios apropiados que apoyen las células madre neurales, las células madre en el tejido cosechado deben formar neuroesferas en unos pocos días.

6. Preparación de las células para el reimplante

  1. Resuspender el pellet a una concentración de 100.000 células vivas por 4 μL de 1x PBS.
  2. Inyectar inmediatamente en ratones naïve utilizando el método de implantación del tumor intracraneal (paso 1).

7. Análisis histológico

  1. Inmediatamente después de la resección, extraer y fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 24 h12.
  2. Transfiera los cerebros a una solución de sacarosa al 30% hasta que estén saturados con sacarosa (hundidos hasta el fondo del recipiente).
  3. Transfiera los cerebros a una solución de etanol al 70%.
  4. Realizar la incrustación de bloques de parafina, la sección y la tinción estándar de hematoxilina y eosina (H&E) después del informe13 publicado anteriormente.
    NOTA: El espesor de cada sección tomada para la tinción fue de 10 μm.

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Resultados

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La resección quirúrgica con el MIRS resulta en una disminución significativa de la carga tumoral
En el grupo con una carga tumoral más pequeña, la señal bioluminiscente basal media fue de 5,5e+006 fotones/s ± 0,2e+006 en el subgrupo que se sometió a resección. Después de la resección, la señal bioluminiscente media disminuyó a 3.09e+006 fotones/s ± 0.3e+006, (p <0.0001, prueba de Mann-Whitney)9 (Figura 2). La señal biol...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resección tumoral es una piedra angular de los planes de tratamiento oncológico neuroquirúrgico para los tumores cerebrales de bajo y alto grado. La citorreducción y la citorreducción del tumor se correlacionan con una mejor función neurológica y supervivencia general en pacientes con tumores cerebrales 1,2,5,6. Aunque los protocolos para la resección quirúrgica se han descrito previamente e...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BT tiene fondos de investigación de NIH y es copropietaria de Accelerating Combination Therapies*, y Ashvattha Therapeutics Inc. ha licenciado una de sus patentes. GW tiene fondos de los NIH (R01NS107813). HB es un consultor pagado de Insightec y presidente del Consejo Asesor Médico de la compañía. Este acuerdo ha sido revisado y aprobado por la Universidad Johns Hopkins siguiendo sus políticas de conflicto de intereses. HB tiene fondos de investigación de NIH, Johns Hopkins University y filantropía y es consultor para CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* y Nurami Medical*. (*incluye acciones u opciones).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringas de 1 mLBD309628
tubos cónicos de 15 mLCorning430052
etanol de 200 gradosPharmCo111000200
pipetas de 5 mLCoStar4487
Filtro de 70 micrasFisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased (inyección de xilacina, 100 mg/mL)Sistema de anestesia Covetrus33198
Patterson Scientific78935903
Contenedor de residuos de gas anestésicoPatterson Scientific78909457
Protector de banco almohadillaCovidien10328
C57Bl/6, ratones de 6-8 semanas de edadCharles River LaboratoriesCódigo de cepa 027
ChroMini ProMoserTipo 1591-Q
Colagenasa-DispasaRoche#10269638001
Countess II Contador de células automatizadoThermo Fisher
Countess II FL HemacitómetroThermo FisherA25750
Solución de eliminación de residuosMiltenyi Biotech#130-109-398
D-LuciferinMedios GoldbioLUCK-1G
DMEM F12Corning10-090-CV
Medios DMEMCorning10-013-CV
DNAse ISigma Aldrich#10104159001
Tubos EppendorfPosi-Click1149K01
Solución de eutanasiaHenry Schein71073
FBSMillipore SigmaF4135
Suero Fetal BovinoThermo Fisher10437-028
FormalinaInvitrogenINV-28906
GasaHenry Schein101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
HeparinaSigmaH-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
Cámara de inducciónPatterson Scientific78933388
IsofluranoCovetrus11695-6777-2
Vaporizador de isofluranoPatterson Scientific78916954
KetaminaCovetrus11695-0703-1
Kopf Marco estereotácticoKopf Instruments5001
Microscopio de campo ópticoUnidad de microinyección BioTekCytation 5
Taladro
Bruker7T Biospec Avance III Escáner
NICO Myriad System NICOCorporation
Pomada oftálmicaPuralube
PapaínaSigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
PenStrepMillipore SigmaN1638
Percoll soluciónSigma Aldrich #P4937
Controlador de pipetasFalconA07260
Povidona solución yodadaAplicare52380-1905-08
ProgesteronaSigmaP-8783
PutrescinaSigmaP-5780
RPMI MediaInvitrogenINV-72400120
Hoja de bisturíCovetrus7319
Mango de bisturíFine Science Tools91003-12
Rotulador de pielTime OutD538,851
Grapa removedorMikRonACR9MM
GrapadoraMikRonACA9MM
Grapas ClayAdams427631
Marco estereotácticoKopf Instruments5000
SacarosaSigma AldrichS9378
Sutura, vicryl 4-0EthiconJ494H
T-75 matrazde cultivoSarstedt83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Tampón de lisado (1x)LonzaBP10-548E
Tripsina-EDTACorningMDT-25-053-CI
de micromotor Kopf 5001 Sistema de resonancia magnética de F210418 de resonancia magnética

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
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