Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הדמיה של סחר בתאים: שיטה של תיוג רדיו תאים

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לתאי רדיולייבל עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) רדיואיזוטופ, 89 Zr (t1/2 78.4 h), באמצעות סינתון רדיו-תיוג מוכן לשימוש, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). תיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN מאפשר מעקב לא פולשני והדמיה של תאים רדיו-מסומנים בגוף עם PET עד 7 ימים לאחר מתן התרופה.

Abstract

טיפולים בתאי גזע וקולטן אנטיגן כימרי (CAR) לתאי T מסתמנים כטיפולים מבטיחים להתחדשות איברים וכאימונותרפיה לסוגי סרטן שונים. למרות התקדמות משמעותית שנעשתה בתחומים אלה, יש עוד מה ללמוד כדי להבין טוב יותר את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של התאים הטיפוליים המנוהלים במערכת החיה. עבור מעקב לא פולשני, in vivo של תאים עם טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), פותחה שיטה חדשה [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method באמצעות 89Zr (t 1/2 78.4 h). הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינתון [89Zr]Zr-DBN, מוכן לשימוש, לסימון רדיואקטיבי ישיר של מגוון תאים, כולל תאי גזע מזנכימליים, תאי גזע קרדיופויטיים מונחי שושלת, הפטוציטים המחדשים את הכבד, תאי דם לבנים, תאי מלנומה ותאים דנדריטיים. המתודולוגיה שפותחה מאפשרת הדמיית PET לא פולשנית של סחר בתאים עד 7 ימים לאחר מתן התרופה מבלי להשפיע על אופי או תפקוד התאים המסומנים ברדיו. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה מדורגת לרדיוסינתזה של [89 Zr]Zr-DBN, ניסוח תואם ביולוגית של [89 Zr]Zr-DBN, הכנת תאים לתיוג רדיו, ולבסוף תיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN, כולל כל הפרטים המורכבים הדרושים לתיוג רדיואקטיבי מוצלח של תאים.

Introduction

טיפולי תאי גזע וקולטן אנטיגן כימרי (CAR) T-cell צוברים פופולריות ונמצאים תחת חקירה פעילה לטיפול במחלות שונות, כגון אי ספיקת שריר הלב1,2, ניוון רשתית 2, ניוון מקולרי 2, סוכרת 2, אוטם שריר הלב 3,4,5 וסרטן 6,7,8,9,10. בין שתי הגישות הסבירות של טיפולים בתאי גזע, תאי גזע יכולים להיות מושתלים ישירות באתר המחלה כדי לגרום לתגובה טיפולית, או לגרום לשינויים במיקרו-סביבה של אתר המחלה מבלי להיצמד לאתר המחלה כדי ליזום תגובה טיפולית עקיפה. תגובה טיפולית עקיפה עלולה לגרום לשינויים במיקרו-סביבה של אתר המחלה על ידי שחרור גורמים שיתקנו או יטפלו במחלה5. גישות אלה של טיפולים בתאי גזע יכולות להיות מוערכות על ידי הדמיה לא פולשנית של תאי גזע מסומנים רדיו. הדמיה לא פולשנית יכולה להתאים את ספיגת התאים הרדיואקטיביים באתר המחלה עם תגובה טיפולית לפענוח התגובה הטיפולית הישירה לעומת העקיפה.

בנוסף, טיפולים מבוססי תאי חיסון מפותחים לטיפול בסוגי סרטן שונים באמצעות CAR T-cell 6,7,8,9,10 ואימונותרפיה של תאים דנדריטיים 11,12. באופן מכניסטי, באימונותרפיהשל תאי T CAR 6,7,8,9,10, תאי T מהונדסים לבטא אפיטופ שנקשר לאנטיגן ספציפי על גידולים שיש לטפל בו. תאי CAR T מהונדסים אלה, עם נתינתם, נקשרים לאנטיגן הספציפי הקיים על תאי הגידול באמצעות אינטראקציה אפיטופית-אנטיגן. לאחר הקשירה, תאי ה-CAR T הקשורים עוברים הפעלה ולאחר מכן מתרבים ומשחררים ציטוקינים, מה שמאותת למערכת החיסון של המארח לתקוף את הגידול המבטא את האנטיגן הספציפי. לעומת זאת, במקרה של טיפולים בתאים דנדריטיים11,12, תאים דנדריטיים מהונדסים להציג אנטיגן סרטני ספציפי על פני השטח שלהם. תאים דנדריטיים מהונדסים אלה, כאשר הם מנוהלים, הם ביתם של בלוטות הלימפה ונקשרים לתאי T בבלוטות הלימפה. תאי T, עם קשירתם לאנטיגנים הסרטניים הספציפיים על התאים הדנדריטיים המנוהלים, עוברים הפעלה/התפשטות ויוזמים תגובה חיסונית של המאכסן כנגד הגידול המבטא את האנטיגן הספציפי. לפיכך, הערכת הסחר של תאי CAR T הניתנים לאתר גידול9,10 וביות של תאים דנדריטיים לבלוטות הלימפה11,12 אפשרית על ידי הדמיה רדיואקטיבית של תאי CAR T ותאים דנדריטיים כדי לקבוע את יעילות האימונותרפיה. יתר על כן, סחר לא פולשני בתאים יכול לעזור להבין טוב יותר את הפוטנציאל הטיפולי, להבהיר את התגובה הטיפולית הישירה לעומת העקיפה, ולחזות ולנטר את התגובה הטיפולית של טיפולים מבוססי תאי גזע ותאי חיסון.

שיטות הדמיה שונות לסחר בתאים נחקרו 3,4,9,10,12, כולל דימות אופטי, דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET). לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות וחסרונות משלה. מבין אלה, PET הוא המודל המבטיח ביותר בשל אופיו הכמותי ורגישותו הגבוהה, החיוניים לכימות אמין של תאים בסחר תאים מבוסס הדמיה 3,4,9,10.

רדיואיזוטופ פולט פוזיטרונים 89Zr, עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, מתאים לתיוג תאים. הוא מאפשר הדמיית PET של סחר בתאים במשך יותר משבוע אחד ומיוצר בקלות על ידי ציקלוטרון רפואי זמין באופן נרחב, אנרגיה נמוכה 13,14,15,16,17. בנוסף, כלטור p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) המתפקד כראוי זמין מסחרית לסינתזה של סינתון תיוג תאים 89 Zr, מוכן לשימוש, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, הידוע גם בשם [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. העיקרון של [89 Zr]Zr-DBN בתיווך תיוג תאים מבוסס על תגובה בין אמינים ראשוניים של חלבוני קרום התא לבין moiety איזותיוציאנט (NCS) של [89Zr]Zr-DBN כדי לייצר קשר קוולנטי יציב thiourea.

[89זר] תיוג והדמיית תאים מבוססי Zr-DBN פורסמו כדי לעקוב אחר מגוון תאים שונים, כולל תאי גזע 18,23,25, תאים דנדריטיים18, תאי גזע קרדיופויטיים19, תאי סטרומה נשירים 20, מקרופאגים שמקורם במח עצם 20, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים 20, תאי T Jurkat/CAR 21, הפטוציטים22,24 ותאי דם לבנים 25. הפרוטוקול הבא מספק שיטות שלב אחר שלב של הכנה ותיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN ומתאר שינויים שעשויים להידרש בפרוטוקול התיוג הרדיואקטיבי עבור סוג תא ספציפי. לקבלת בהירות רבה יותר, השיטה של radiolabeling התא המוצג כאן מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון עוסק בהכנת [89 Zr]Zr-DBN על ידי chelating 89Zr עם DFO-Bn-NCS. החלק השני מתאר את ההכנה של נוסחה תואמת ביולוגית של [89Zr]Zr-DBN שניתן להשתמש בה בקלות לתיוג רדיו של תאים. החלק השלישי מכסה את השלבים הדרושים להתניה מוקדמת של תאים לתיוג רדיו. ההתניה המוקדמת של התאים כרוכה בשטיפת התאים עם תמיסת מלח מבודדת ללא חלבון פוספט (PBS) ותמיסת מלח מאוזן HEPES חוצצת הנקס (H-HBSS) כדי להסיר חלבונים חיצוניים, אשר עשויים להפריע או להתחרות בתגובה של [89Zr]Zr-DBN עם אמינים ראשוניים הנמצאים על פני התא חלבונים במהלך תיוג רדיו. החלק האחרון מספק שלבים המעורבים ברדיותיוג בפועל של התאים וניתוח בקרת איכות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תאים דנדריטיים ותאי מלנומה התקבלו באופן מסחרי18. הפטוציטים בודדו מכבד של חזירים לאחר כריתת כבד חלקית לפרוסקופית22,24. תאי גזע בודדו ממח עצם 18,19,26. תאי הגזע שמקורם ברקמת השומן התקבלו מהמעבדה לטיפול תאי אנושי, מאיו קליניק רוצ'סטר23. תאי דם לבנים אנושיים בודדו מהדם שנאסף שהתקבל מהמחלקה לרפואת עירוי, מאיו קליניק רוצ'סטר25. תאים שונים המשמשים לתיוג רדיו התקבלו ושימשו בהתאם להנחיות המומלצות על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, ועדת המשנה לפיקוח על מחקר תאי גזע במאיו קליניק, ועדת המחקר של המחלקה לרפואת עירוי, הוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית ועל ידי הוועדה לבטיחות קרינה.

1. הכנת [ 89Zr ]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([ 89Zr ]Zr-DBN)

תזמון: ~ 160-220 דקות
הערה: להכנת [89 Zr]Zr-DBN, בודד 89 Zr בצורה של [89 Zr]Zr-מימן פוספט ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) או [89 Zr]Zr-כלוריד ([89Zr]ZrCl4), כאמור בשלב 1.1.

  1. בודד 89Zr מהורה 89Y באמצעות שיטת טיהור מבוססת שרף הידרוקסאמט13,17. בקצרה, תחילה להכין עמודה עם ~ 100 מ"ג של שרף hydroxamate, ולאחר מכן להפעיל את שרף hydroxamate על ידי שטיפת העמוד עם 8.0 מ"ל של אצטוניטריל נטול מים טהור, ואחריו סומק עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר. לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 15 מ"ל של מים deionized, ואחריו עוד סומק עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר, ולאחר מכן לעבור 2.0 מ"ל של 0.50 N HCl (עקבות מתכת בסיס כיתה) ואחריו סומק נוסף עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר. לאחר מכן, לטעון את התמיסה המכילה הן 89 Zr ו 89 Y לשרף hydroxamate לאט, ולשטוף את 89Y unbound מן שרף hydroxamate עם 20 מ"ל של 2.0 N HCl, ואחריו 10 מ"ל של מים deionized סומק עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר.
    הערה: לאחר ההדחה עם האוויר, ניתן לבצע את ההדחה של 89Zr כפי שמוצג להלן.
    1. עבור האדרת 89 Zr בצורה של [89 Zr]Zr(HPO 4)2, תחילה הוסף 0.50 מ"ל של 1.2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO4 buffer (pH 3.5) לעמודה משלב 1.1 ואפשר לו לשבת על העמודה במשך 30 דקות כדי לקדם את שחרורו של 89 Zr כ- [89Zr]Zr(HPO 4)2מהשרף. לאחר מכן, מחק את 89Zr מהעמודה עם 1.50 מ"ל נוספים של 1.2 M K 2 HPO4/KH2PO4 buffer (pH 3.5). לאחר ההדחה של [89 Zr]Zr(HPO 4)2, בצע את השלבים 1.2, 1.2.1 ו-1.2.2 להכנת [89 Zr]Zr-DBN באמצעות [89Zr]Zr(HPO4)2, כפי שמוצג באיור 1.
    2. לקבלת 89 Zr כמו [89 Zr]ZrCl4, הראשון elute 89 Zr כמו [89Zr]Zr-oxalate.
      1. עבור פליטת 89 Zr בצורה של [89 Zr]Zr-oxalate, הוסף 0.50 מ"ל של 1.0 M חומצה אוקסלית לעמודה משלב 1.1 ואפשר לה לשבת על העמוד במשך דקה אחת כדי לקדם את שחרורו של 89 Zr כ-[89Zr]-oxalate מהשרף. לאחר מכן, לטשטש את 89Zr מהעמודה עם תוספת של 2.50 מ"ל של 1.0 M חומצה אוקסלית (סה"כ 3.0 מ"ל)17.
      2. כדי להמיר [89 Zr]Zr-oxalate לתוך [89Zr]ZrCl4 באמצעות עמודת חילופי אניון, כפי שמתואר על ידי Larenkov et al.14, תחילה להפעיל את העמודה על ידי שטיפה עם 6.0 מ"ל acetonitrile, ואחריו סומק עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר. לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 10.0 מ"ל של מלוחים, ואחריו עוד סומק של 5.0-6.0 מ"ל של אוויר. לבסוף, לעבור 10.0 מ"ל של מים deionized, ואחריו סומק עם 5.0-6.0 מ"ל של אוויר.
      3. טען את תמיסת 3.0 מ"ל המכילה [89Zr]Zr-oxalate על עמודת חילופי האניון המופעלת באיטיות, ואחריה שטיפה של 5.0-6.0 מ"ל אוויר. לאחר מכן, שטפו את העמוד הטעון 89Zr עם 50.0 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר יון אוקסלט לא קשור, ואחריו סומק עם 5.0-6.0 מ"ל אוויר.
      4. עבור פליטת 89 Zr בצורה של [89 Zr]ZrCl 4, הוסף 0.10 מ"ל של 1.0 N HCl לעמודה, אפשר לה לשבת על הטור למשך 1.0 דקות כדי לקדם את שחרורו של 89 Zr כ- [89Zr]ZrCl4 מהשרף, ומחק את 89Zr מהעמודה עם 0.40 מ"ל נוספים של 1.0 N HCl (סה"כ 0.5 מ"ל). יבש את המדולל [89Zr]ZrCl4 בבקבוקון בצורת V על ידי הנחתו בבלוק חימום ב 65 ° C תחת זרימה קבועה של גז חנקן במשך 10-30 דקות. לאחר הייבוש, הרכיבו מחדש את ה-ZrCl 4 המיובש במים ועקבו אחר שלבים 1.3 ו-1.3.1 להכנת [89 Zr]Zr-DBN באמצעות [89Zr]ZrCl 4, כפי שמוצג באיור 1.
  2. קח ~ 120 μL של [89Zr]Zr (HPO 4)2, נוסחה בנוסחה של 1.2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO4 (pH 3.5) (10-25 MBq) משלב 1.1.1, ונטרל את התמיסה להשגת pH 7.5-8.0 עם ~100 μL של 1.0 M HEPES-KOH (pH 7.5) ו~ 65 μL של 1.0 M K 2CO3.
    1. כדי להשיג את הכמות המתאימה של DFO-Bn-NCS עבור שלבים 1.2.2 או 1.3.1 עבור ניסוחים שונים של 89 Zr עם פעילות ספציפית מגוונת לכאורה של 89 Zr, בצע סדרה של תגובות כלציה באמצעות נפח קבוע של נוסחה מנוטרלת של [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4 עם טווח של DFO-Bn-NCS (7.5-15 מיקרוגרם). במקרה של [89Zr]Zr(HPO4)2, יש לדגור על תגובת הקלציה ב-37°C בשייקר ב~550 סל"ד למשך 60 דקות. והואיל ובמקרה של [89Zr]ZrCl4, יש לדגור על תגובת הקלציה ב-25°C בשייקר ב~550 סל"ד למשך 30 דקות. השליכו את תגובת הקלציה שמראה זירוז במהלך הדגירה או בסיומה. בסוף הדגירה, בצע כרומטוגרפיה רדיואקטיבית של שכבה דקה (rad-TLC) עם 100 mM diethylenetriamine pentaacetate (DTPA), pH 7.0, כשלב נייד כדי להעריך את יעילות הקלציה של DFO-Bn-NCS עבור כל תגובת כלציה, כפי שנדון להלן בשלב 1.5.
      הערה: בהתבסס על יעילות הקלציה, השתמש בכמות המינימלית של DFO-Bn-NCS בשלבים 1.2.2 או 1.3.1 הדרושים כדי להשיג יעילות קלציה של ≥97% מבלי לגרום למשקעים של DFO-Bn-NCS בנוסחה המנוטרלת של [89 Zr]Zr (HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4. כאן, [89Zr]Zr-DBN סונתז בטוהר רדיוכימי של ≥97%.
    2. הכינו DFO-Bn-NCS טרי של 5.0 mM ב-DMSO נטול מים (3.76 מ"ג/מ"ל) והוסיפו 4.0 μL של 5.0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol או 15 μg) ל~285 μL מנוטרל [89Zr]Zr (HPO4)2 (10-25 MBq) משלב 1.2 וערבבו את התמיסה על ידי פיפטטינג. שמור על ריכוז DMSO הסופי בתערובת הקלציה מתחת ל -2% מהנפח הכולל.
  3. קח ~ 180 μL של [89 Zr]ZrCl4 נוסחה 0.1 N HCl (40-80 MBq) משלב 1.1.2.4 ולנטרל את הפתרון המתקבל כדי להשיג pH 7.5-8.0 עם ~ 25 μL של 1.0 M Na2CO3.
    1. הכן DFO-Bn-NCS טרי של 2.5 mM בדימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) (1.88 מ"ג/מ"ל) והוסף 4.0 μL של 2.5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol או 7.5 μg) ל~205 μL מנוטרל [89 Zr]ZrCl4 (40-80 MBq) משלב 1.3. מערבבים את התמיסה על ידי פיפט. שמור על ריכוז DMSO הסופי בתערובת הקלציה מתחת ל -2% מהנפח הכולל.
  4. המשך עם הקלציה של 89 Zr ב- 37 ° C בשייקר ב~ 550 סל"ד למשך 60 דקות במקרה של [89 Zr]Zr (HPO 4)2, או ב- 25 ° C בשייקר ב~ 550 סל"ד למשך 30 דקות במקרה של [89Zr]ZrCl4.
  5. קבע את יעילות הקלציה של 89Zr על ידי rad-TLC עם DTPA של 100 mM (pH 7.0) כממס הנייד של rad-TLC. צפו ש-[89 Zr]Zr-DBN יציג R f של ~0.021-0.035, [89 Zr]ZrCl 4 יציג R f של ~1.0, ו-[89Zr]Zr(HPO4)2 יציג R f של ~1.0. חשב את יעילות הקלציה (%) באמצעות משוואה (1):
    אחוז של 89 Zr chelated ל- DFO-NCS כדי ליצור [89 Zr]Zr-DBN = [ (רדיואקטיביות ב- R f של [89 Zr]Zr - DBN) / (סכום הרדיואקטיביות ב- R f של [89 Zr]Zr - DBN וב- R   f של [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    הערה: יעילות הקלציה המקובלת של 89Zr כדי להמשיך עם תיוג רדיו סלולרי, כפי שנקבע על ידי rad-TLC, היא ≥97%. הטוהר הרדיוכימי המוצע של ≥97% של [89Zr]Zr-DBN נקבע בהתאם לדרישת הטוהר הרדיוכימי הסטנדרטית עבור תרופות רדיוכימיות אחרות המשמשות בתחום. ראו את rad-TLC המייצג באיור משלים S1 ובאיור משלים S2.

Figure 1
איור 1: סכמה של הכנת [89Zr]Zr-DBN. להכנת [89 Zr]Zr-DBN, נטרלו נוסחה מוכנה [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4 ל-pH של 7.5-8.0. לדגור על הפתרון המנוטרל עם DFO-Bn-NCS. בדוק את יעילות הקלציה של 89Zr ל- DFO-Bn-NCS על ידי rad-TLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ניסוח תואם ביולוגית של [ 89Zr ]Zr-DBN עבור תיוג רדיו תאי (איור 2)

תזמון: ~35 דקות
הערה: בהתחשב בזמן שלוקח להכנת תאים בשלב 3, התחל את שלב 3 כ -20 דקות לפני תחילת שלב 2 עבור ~ 30 דקות דגירה. הדבר מאפשר תיוג רדיו סלולרי בשלב 4 להתחיל תוך ~5-10 דקות לאחר השלמת שלבים 2-3.2.2.

  1. עבור נוסחת [89 Zr]Zr-DBN המיוצרת מ-[89 Zr]ZrCl 4, הוסף 50.0 μL של תערובת תואמת תאים הכוללת ~27.0 μL של 1.2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3.5) + ~23.0 μL של 1.0 M HEPES-KOH buffer (pH 7.5) עד 50.0 μL של [89 Zr]Zr-DBN. דגרו על התערובת [89Zr]Zr-DBN-cell תואמת למשך ~30 דקות בטמפרטורת החדר (25°C).
    הערה: הנוסחה [89 Zr]Zr-DBN המיוצרת מ-[89Zr]Zr(HPO4)2 תואמת ביולוגית לתיוג רדיואקטיבי של תאים ואינה דורשת שלב 2.

Figure 2
איור 2: הכנת הנוסחה התואמת ביולוגית של [89Zr]Zr-DBN לתיוג רדיו תאי. להכנת נוסחה מוכנה לשימוש תואם ביולוגית של סינתון תיוג רדיו, הוסף נפח שווה של תערובת תואמת תאים, הכוללת 1.2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3.5) + 1.0 M HEPES-KOH לנפח שווה של [89Zr]Zr-DBN. דגירה ב 25 ° C במשך ~ 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת תאים לתיוג רדיו

תזמון: ~ 40-50 דקות

  1. טריפסיניזציה ~ 12 × 106 תאים דבקים (תאי גזע, תאי סרטן מלנומה, תאי גזע קרדיופויאטיים, תאים דנדריטיים או הפטוציטים) וצנטריפוגה את התאים בצינור צנטריפוגה חרוטי 15.0 מ"ל ב~ 96 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C.
    1. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את גלולת התא ב~500 מיקרוליטר של PBS, והעבירו את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התאים במיקרוצנטריפוגה ב~ 96 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C.
    2. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב~500 מיקרוליטר של H-HBSS. צנטריפוגה את התאים במיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב~96 × גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב 3.1.2 פעם נוספת והמשך לשלב 4.1.1.
      הערה: H-HBSS היא תמיסת מלח מאוזנת של הנקס עם 0.01 M HEPES (pH 8.0).
  2. במקרה של תאים שאינם דבקים, כגון תאי דם לבנים אנושיים (תאי דם לבנים אנושיים שבודדו זה עתה מהדם), דלג על טריפסיניזציה וצנטריפוגה תרחיף התא המכיל ~ 12 × 106 תאים במיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב~96 × גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
    1. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את גלולת התא ב~500 מיקרוליטר של PBS, וצנטריפוגו את התאים במיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב~96 × גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
    2. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב~500 מיקרוליטר של H-HBSS. צנטריפוגה את התאים במיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב~96 × גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב 3.2.2 פעם נוספת והמשך לשלב 4.1.1.

4. תיוג רדיו של תאים

תזמון: ~ 125-155 דקות

  1. התחלת תיוג רדיו תאי (איור 3)
    1. השתמש בתרחיף התא משלב 3.1.2 או שלב 3.2.2 כדי להכין תרחיף תאים ~ 500 μL עם כ ~ 6 × 106 תאים ב~ 500 μL של H-HBSS ב- pH 7.5-8.0 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. לשם כך, הוסף ~ 100 μL של הנוסחה הביולוגית [89Zr]Zr-DBN משלב 2.
  2. דגירה של תאים לתיוג רדיו (איור 4)
    1. ערבבו את הנוסחה הביולוגית [89 Zr]Zr-DBN ואת תרחיף התא על ידי פיפטציה עדינה מעלה ומטה עם מיקרופיפטה שנקבעה ב~500 μL. מדדו את כמות הרדיואקטיביות בצינור הדגירה באמצעות כיול מינון רדיואקטיבי בהגדרה 489 עבור 89Zr-איזוטופ16.
    2. יש לדגור על התאים ועל תערובת [89Zr]Zr-DBN בשייקר ב~550 סל"ד ב-25-37°C למשך 30-45 דקות לצורך תיוג תאים.
      הערה: טמפרטורת הדגירה תשתנה בהתאם לסוגי התאים המשמשים לתיוג רדיו, כפי שמוצג בטבלה 1.
    3. לאחר הדגירה בשלב 4.2.2, בצע rad-TLC על תגובת תיוג הרדיו של התא באמצעות ממס rad-TLC טרי שהוכן (20 mM נתרן ציטראט [pH 4.9-5.1]:מתנול [1:1, V:V]). לאחר ריצת rad-TLC, חפש [89 Zr]Zr-DBN ו- [89 Zr]ZrCl4 סביב R f = ~0.73-0.81 ו- Rf = ~0.01-0.02 עבור התאים המסומנים ברדיו. חשב את אחוז הרדיואקטיביות ב- Rf = ~ 0.01-0.02 באמצעות משוואה (2).
      אחוז הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 = [ (רדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01 - 0.02) / (סכום הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01 - 0.02 ו- Rf = ~ 0.73 - 0.81) ] × 100 (2)
      הערה: כדי להבין את הפסגות המתוארות ב-R f = ~0.01-0.02 וב-Rf = ~0.73-0.81, ראו את תגובת הרדיו-תיוג של תאי הדם הלבנים באיור המשלים S3.
    4. בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ"ל, ערבבו ~100 μL של הנוסחה הביו-קומפטיבית [89Zr]Zr-DBN עם ~500 μL של H-HBSS ב-pH 7.5-8.0 לשימוש כבקרה ללא תאים לתיקון רקע בשלב 4.2.5. לאחר הדגירה בטמפרטורה ובזמן דומים לשימוש בשלב 4.2.2, בצע rad-TLC. לאחר ריצת rad-TLC, חפש [89 Zr]Zr-DBN ו- [89 Zr]ZrCl4 סביב Rf = ~ 0.73-0.81. חשב את אחוז הרדיואקטיביות ב- Rf = ~ 0.01-0.02 באמצעות משוואה (3).
      רדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 = [ (רדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01 - 0.02) / (סכום הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01 - 0.02 ו- Rf = ~ 0.73 - 0.81) ] × 100 (3)
      הערה: כדי להבין את הפסגות המוצגות ב-Rf = ~0.01-0.02 ו-~0.73-0.81, ראו את rad-TLC של תגובת בקרה ללא תאים באיור משלים S4.
    5. חשב את תיוג הרדיו האפקטיבי של התא (%) על ידי הפחתת אחוז הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 (מ- rad-TLC משלב 4.2.4) מאחוז הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 (מ- rad-TLC משלב 4.2.3).
  3. מרווה של תיוג רדיו ושטיפת תאים (איור 5)
    1. לאחר אישור השלמת תיוג הרדיו על ידי rad-TLC בשלב 4.2.5, בצע מרווה של תגובת תיוג הרדיו על ידי תוספת של ~600 μL של תווך שלם מקורר המתאים לתאים, או על ידי תוספת של H-HBSS, כפי שמוצג בטבלה 1.
    2. צנטריפוגה את התאים במיקרוצנטריפוגה ב~ 96 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
    3. השהה מחדש בעדינות את התאים הכדוריים ב~500 מיקרוליטר של מדיום צונן (מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) + 10% נסיוב בקר עוברי + 5% פניצילין/סטרפטומיצין או Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% נסיוב בקר עוברי + 5% פניצילין/סטרפטומיצין או H-HBSS עבור סוג תא מסוים, כפי שמוצג בטבלה 1. בצע השעיה של גלולת התא על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה עם micropipette להגדיר ב ~ 500 μL.
    4. צנטריפוגה את התאים במיקרוצנטריפוגה ב ~ 96 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    5. חזור על שלבים 4.3.2-4.3.4 פעמיים כדי לשטוף את הרדיואקטיביות הבלתי קשורה.
    6. העבירו את הגלולה לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל עם DMEM + 10% נסיוב בקר עוברי + 5% פניצילין/סטרפטומיצין במקרה של תאי גזע או H-HBSS ומדדו את הרדיואקטיביות בכדורית התא באמצעות כיול מינון בהגדרה 489 עבור 89Zr-איזוטופ16.
    7. חשב את יעילות תיוג הרדיו הסופית לאחר כל השטיפות באמצעות משוואה (4).
      יעילות תיוג רדיו = [(ריקבון תיקן רדיואקטיביות בכדורית התא בשלב 4.3.6) / (ריקבון תיקן רדיואקטיביות בכדוריות התא ו- H-HBSS בשלב 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. כדי להבטיח את איכות התאים המסומנים ברדיו, תחילה בדוק חזותית את ההשעיה הסופית של תאים מסומנים ברדיו לנוכחות גושים כלשהם. אם אין גושים, המשך עם ההשעיה הסופית לשלב הבא. אם יש גושים, אבל הם יכולים להיות resuspended על ידי pipetting או על ידי טלטול עדין, לעשות זאת ולהמשיך לשלב הבא, כמו זה עובר את הבדיקה החזותית. עם זאת, אם הגושים אינם תלויים מחדש על ידי פיפטינג או טלטול עדין, השליכו את המתלים והתחילו מחדש.
    9. אם הבדיקה החזותית עברה, בצע בדיקת כדאיות של טריפאן כחול באמצעות תמיסת טריפאן כחולה 0.4% שהוכנה ב- PBS תוך שעה אחת מהתיוג הרדיופוני ושלבי השטיפה (4.3.3-4.3.7) להערכת כדאיות התא של התאים המסומנים ברדיו.
      1. כדי לבצע את הבדיקה, הוסף 10.0 μL של 0.4% תמיסת טריפאן כחול לתרחיף התאים של 10.0 μL הן של תאים מסומנים ברדיו והן של תאים לא מסומנים וערבב אותם על ידי פיפטציה של תרחיף התא הכחול של טריפאן למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה המוגדרת על 10.0 μL.
      2. טען hemacytometer עם ~ 10.0 μL של תערובת תרחיף תאים כחולים טריפאן, מיד לספור את מספר התאים מוכתמים כחול ואת המספר הכולל של תאים hemacytometer תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה או באמצעות מונה תאים אוטומטי. חשב את אחוז התאים בני קיימא באמצעות משוואה (5).
        אחוז התאים בני קיימא = 100 - [(מספר התאים הכחולים - מוכתמים) / (מספר התאים הכולל)] × 100 (5)
    10. השתמש בתאים המסומנים בתווית רדיו אם אין שינוי באחוז התאים בני קיימא בתרחיף התא המסומן בתווית רדיואקטיבית בהשוואה לתאים המקבילים ללא התווית. מחק את התאים המסומנים בתווית רדיו אם אחוז התאים בני קיימא קטן מהתאים המקבילים ללא תווית.

Figure 3
איור 3: סכמטי של התחלת תיוג רדיו תאי. התחל תיוג רדיואקטיבי של תאים על ידי הוספת הנוסחה הביולוגית [89Zr]Zr-DBN לתרחיף התא שהוכן בתמיסת מלח מאוזנת HEPES חוצצת הנקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סכמטיות של דגירה של תאים עבור תיוג רדיו. ערבבו ביסודיות את הנוסחה הביולוגית [89Zr]Zr-DBN עם תרחיף התא ודגרו על תרחיף התא בבלוק חימום מבוקר טמפרטורה על שייקר למשך 30-60 דקות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: סכמטיות של מרווה של תיוג רדיו ושטיפת תאים. להרוות את radiolabeling של תאים על ידי תוספת של תווך תאים מקורר או H-HBSS, ואחריו צנטריפוגה ב 4 ° C. לשטיפת תאים, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב~500 מיקרוליטר של תווך תא מקורר או H-HBSS. חזור על המחזור של השלכת הסופרנאטנט והשעיה מחדש של גלולת התא בתווך טרי כדי להסיר כל סינתון רדיואקטיבי לא מאוגד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המייצגות המוצגות בכתב יד זה לוקטו ממחקרי הסינתזה הקודמים [89 Zr]Zr-DBN ותיוג רדיו תאי18,19,22,23,24,25. בקצרה, 89Zr יכול להיות מורכב בהצלחה עם DFO-Bn-NCS ב~ 30-60 דקות ב 25-37 ° C באמצעות 7.5-15 מיקרוגרם של DFO-Bn-NCS (טבלה 2). יעילות תיוג הרדיו של התאים נעה בין 20% ל-50% כתשואה לא מתוקנת שנצפתה בכדורית התא המסומנת ברדיו לאחר שטיפה (טבלה 1). 18,19,22,23,24,25 (טבלה 1).

בסך הכל, הושגו ריכוזי הרדיואקטיביות הבאים: 0.1 MBq/10 6 תאים עבור hepatocytes 22,24, 0.50 ± 0.10 MBq/10 6 עבור תאי מלנומה (mMCs)18, 0.47 ± 0.10 MBq/10 6 עבור תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)18, 0.39 ± 0.20 MBq/10 6 עבור תאים דנדריטיים (mDCs)18, 0.27± 0.30 MBq/10 6 עבור תאי דם לבנים 25, ו- 0.70 ± 0.20 MBq/106 עבור תאי גזע קרדיופויטיים19 (טבלה 1). לעומת זאת, לא נצפתה תיוג תאים באמצעות [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl 425. כפי שהודגם בעבר, תוויות רדיו נמצאו יציבות ב-mMCs, hMSCs ו-mDCs, עם אחוז זניח בלבד של זרם שנצפה במשך 7 ימים לאחר ההתוויה (איור 6)18. עבור תאי גזע קרדיופויאטיים, לא נצפתה עלייה במשך יומיים לאחר התיוג19.

טבלה 1: יעילות תיוג רדיו תאים בסוגי תאים שונים עם [89Zr]Zr-DBN. תאי גזע, תאי מלנומה, תאי גזע קרדיופויאטיים, הפטוציטים, תאים דנדריטיים ותאי דם לבנים סומנו ברדיו עם [89Zr]Zr-DBN עם יעילות רדיוטיבית משתנה של תאים. *יעילות תיוג הרדיו של התאים (%) הוערכה כמתואר בשלב 4.3.7. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: יעילות קלציה של 89Zr של DFO-Bn-NCS. יעילות הקלציה של DFO-Bn-NCS עבור 89 Zr באמצעות [89 Zr]Zr (HPO 4)2 ו- [89Zr]ZrCl4 שונה, כפי שנמדדה על ידי rad-TLC. *הערכים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. עם 50 mM DTPA (pH 7.0) כממס rad-TLC, [89 Zr]Zr(HPO4)2 מראה R f של ~0.9 18 ו- [89Zr]Zr-DBN מראה R f של ~0.018. עם 100 mM DTPA (pH 7.0) כממס rad-TLC, [89Zr]ZrCl4 מראה Rf של ~1.0. [89זר] Zr(HPO4)2 מציג R f של ~1.0, ו- [89Zr]Zr-DBN מציג R f של ~0.021-0.035. יעילות כלציה (%) = אחוז של 89 Zr chelated ל- DFO-Bn-NCS ליצירת [89 Zr]Zr-DBN = (רדיואקטיביות ב- R f של [89 Zr]Zr-DBN/(סכום הרדיואקטיביות ב- R f של [89 Zr]Zr-DBN וב- R f של [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4) × 100. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

ההשפעה של תיוג רדיואקטיבי על הכדאיות של התאים המסומנים ברדיו הוערכה ב- mMCs 18, הפטוציטים של חזירים 22,24, hMSCs 18, תאי גזע קרדיופויטיים אנושיים19, ותאי חיסון, כגון תאים דנדריטיים של עכבר (mDCs)18 ותאי דם לבנים 25, באמצעות בדיקת הכדאיות של טריפאן בלו הרחקה. נצפה כי תיוג רדיו לא השפיע לרעה על הכדאיות של התאים; <5% מהתאים המתים נמצאו עד 7 ימים לאחר התיוג הן עבור mMCsהמסומנים ב-Zr-DBN והן עבור hMSCs18 המסומנים ב-Zr-DBN ושאינם מסומנים. תיוג רדיו גם לא השפיע על הכדאיות של הפטוציטים של חזירים22,24 כאשר נבדק תוך שעה אחת מהתיוג הרדיופוני או יומיים לאחר תיוג הרדיו עבור תאי גזע קרדיופויטיים אנושיים מתויגים19.

תיוג הרדיו של תאי דם לבנים אנושיים גם לא השפיע לרעה על יכולת הקיום של תאים, שכן ~90-95% מהתאים ברי קיימא נצפו הן באוכלוסיות התאים הלא מסומנים והן באוכלוסיות התאים המסומנים תוך שעה אחת לאחר תיוג רדיו25. תיוג הרדיו של תאי גזע קרדיופויטיים לא השפיע על המורפולוגיה, הכדאיות או יכולת ההתרבות של תאי גזע קרדיופויטיים אנושיים19. מחקרים פונקציונליים בוצעו עם תאי גזע קרדיופויטיים באוטם שריר הלב מודל19. במחקרים הפונקציונליים, הביטוי האופייני של גורמי שעתוק מזודרמליים ופרו-קרדיוגניים המגדירים את הפנוטיפ הקרדיופויטי נותר ללא שינוי בתאי גזע קרדיופויטיים19. תאי הגזע הקרדיופויטיים הרדיואקטיביים הצליחו לשפר את מקטע הפליטה של החדר השמאלי בלב עכבר עם אוטם כרוני במודל הלב האוטם19.

Figure 6
איור 6: יציבות של תאים שונים המסומנים ברדיו עם 89Zr במשך 7 ימים. השמירה של רדיואקטיביות של 89Zr על ידי תאים מסומנים ברדיו נמצאה יציבה בכל התאים שנחקרו, עם זרם זניח שנצפה במשך 7 ימים לאחר התווית. הערכים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, n = 3. נתון זה לקוח מתוך Bansal et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: רד-TLC מייצג של כלציה 89 Zr עם DFO-Bn-NCS באמצעות [89Zr]Zr (HPO4)2 בתמיסת DTPA (pH 7.0) של 100 mM. Rad-TLC הופעל ב-DTPA של 100 מילימטר (pH 7.0) כשלב הנייד; [89זר] Zr-DBN ; מציג R f של ~0.021-0.035 ו- [89Zr]Zr(HPO4)2 מציג R f של ~1.0. יעילות כלציה (%) = אחוז של 89 Zr chelated ל DFO-Bn-NCS כדי ליצור [89 Zr]Zr-DBN = [רדיואקטיביות ב R f של [89 Zr]Zr-DBN/(סכום הרדיואקטיביות ב R f של [89 Zr]Zr-DBN וב R f של [89Zr]Zr (HPO4)2)] × 100. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: רד-TLC מייצג של כלציה 89 Zr עם DFO-Bn-NCS באמצעות [89Zr]ZrCl4 בתמיסת DTPA (pH 7.0) של 100 mM. Rad-TLC הופעל ב-DTPA של 100 מילימטר (pH 7.0) כשלב הנייד; [89זר] Zr-DBN מציג R f של ~0.021-0.035 ו- [89Zr]ZrCl4 מציג R f של ~1.0. יעילות כלציה (%) = אחוז של 89 Zr chelated ל DFO-Bn-NCS כדי ליצור [89 Zr]Zr-DBN = [רדיואקטיביות ב R f של [89 Zr]Zr-DBN / (סכום הרדיואקטיביות ב R f של [89 Zr]Zr-DBN וב R f של [89Zr]ZrCl4)] × 100. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: rad-TLC מייצג של תגובת תיוג רדיו תאי משלב 4.2.3 בתמיסת נתרן ציטראט של 20 מילימטר (pH 4.9-5.1):מתנול (1:1, V:V). Rad-TLC הופעל בנתרן ציטראט של 20 מילימטר (pH 4.9-5.1):מתנול (1:1, V:V) כשלב הנייד; התאים המסומנים ברדיו מראים R f של ~0.01-0.02 ו-[89 Zr]Zr-DBN ו-[89Zr]ZrCl4 מראים R f של ~0.73-0.81. אחוז הרדיואקטיביות ב- R f של ~ 0.01-0.02 מחושב לפי נוסחה: [(רדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02)/(סכום הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 ו- R f = ~ 0.73-0.81)] × 100. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: rad-TLC מייצג של תגובת בקרה ללא תאים משלב 4.2.4 בתמיסת נתרן ציטראט pH 4.9-5.1 של 20 מילימטר (1:1, V:V). עם 20 mM נתרן ציטראט (pH 4.9-5.1): מתנול (1: 1, V:V) כמו ממס rad-TLC, rad-TLC הופעל 20 mM נתרן ציטראט (pH 4.9-5.1): מתנול (1: 1, V:V) כמו השלב הנייד; [89זר] Zr-DBN ו- [89 Zr]ZrCl4 מציגים Rf של ~0.73-0.81. אחוז הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 מחושב לפי נוסחה: [(רדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02)/(סכום הרדיואקטיביות ב- R f = ~ 0.01-0.02 ו- R f = ~ 0.73-0.81)] × 100. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

להלן שלבים קריטיים בפרוטוקול הזקוקים לאופטימיזציה לתיוג רדיו תאי יעיל. בשלבי פרוטוקול 1.2 ו-1.3, בהתאם לנפח של [89 Zr]Zr(HPO 4)2 או [89Zr]ZrCl4 שנעשה בו שימוש, יש להשתמש בנפח מתאים (מיקרוליטרים) של בסיס; יש להשתמש בתמיסת 1.0 M K 2 CO 3 לנטרול [89 Zr]Zr (HPO 4)2 ו- 1.0 M Na2CO3 לנטרול [89Zr]ZrCl4 להשגת טווח pH של 7.5-8.0. בשלב 2.1, יש להוסיף את התערובת תואמת התאים הכוללת K 2 HPO 4/KH2PO4 ו-HEPES לנוסחה [89 Zr]Zr-DBN, כאשר היא מוכנה מ-[89Zr]ZrCl 4, כדי להגביר את יעילות תיוג הרדיו של התא. יצוין כי desferrioxamine-Bn-NCS עם [89 Zr]ZrCl 4 לא הצליח לתייג תאי גזע אלא אם כן נוספו חוצצי פוספט ו- HEPES בתערובת תיוג התא, מה שמצביע על כך שיש צורך בניסוח מתאים כדי להשתמש [89Zr]ZrCl4 כנוסחה התחלתית.

לצורך אופטימיזציה של יעילות תיוג התא עבור כל סוג תא (שלב פרוטוקול 4.2), יש להגדיל את זמן הדגירה עד ~60 דקות, וטמפרטורת הדגירה עלתה מ -25 ° C ל -37 ° C או שה- pH של תמיסת התיוג עלה ל ~ 8.0. הבחירה של זמן הדגירה, הטמפרטורה וה- pH הם בהתאם לתאימות של סוג התא. לדוגמה, תיוג רדיו של הפטוציטים בוצע ב 27 ° C במשך 45 דקות ב pH ~ 7.522,24, אבל radiolabeling של תאי גזע בוצע ב 37 ° C במשך 30 דקות ב pH ~ 7.518.

בפרוטוקול שלב 4.3, כדי למנוע אובדן תאים במהלך השטיפה, יש להוציא את הסופרנאטנט בזהירות עם הגדרת נפח פיפטה נמוכה יותר מנפח הסופרנאטנט שיש להוציא החוצה. לדוגמה, אם נפח הסופרנאטנט הוא ~600 μL, אז יש להוציא את הסופרנאטנט החוצה בצעדים של ~200-500 μL. זה עוזר למנוע הפרעה לגלולת התא. אם כדורית התא מופרעת בזמן שהיא פולטת סופר-נטנט, אז יש לעצור את הפיפטנט החוצה ולצנטריפוגה שוב כדי לקבל גלולת תא מוגדרת היטב. תאים מסוימים, כגון מונוציטים בתרחיף תאי הדם הלבנים נוטים להיקשר לדפנות הצינור. זה משפיע על ההתאוששות של כל תאי הדם הלבנים המסומנים ברדיו מהצינור לאחר השטיפה.

לאחר תיוג רדיואקטיבי של תאים, בדיקת בדיקה חזותית, בדיקת כדאיות הרחקה כחולה טריפאן וניתוח יציבות/אפלוקס מקובלים כקריטריוני בקרת האיכות. אם כדאיות התא יורדת באופן עקבי בכל ניסיון תיוג רדיו עבור סוג תא מסוים, יש לבדוק את התאים שמסומנים ברדיו כדי לוודא שהם תואמים למדיום התא ולמאגר המשמש במהלך תיוג רדיו התא. מאגרים תואמים שונים ומדיום תאים מסוכמים בטבלה 1. עדיף להשתמש בתנאי תרבית תאים תואמים ידועים למחקרי יציבות/אפלוקס. לדוגמה, מחקרי יציבות/אפלוקס יכולים להתבצע עם תאי גזע, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאים סרטניים, תאי סטרומה נשירים ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים בתנאי תרבית תאים, כפי שמוצג על ידי Bansal et al.18ו- Friberger et al.20.

ניתן לפתור את הבעיות הפוטנציאליות של יעילות כלציה נמוכה או יעילות כלציה לא עקבית, ו/או תפוקה נמוכה של תיוג רדיו תאי או אובדן בכדאיות התא על ידי שינוי שלבים 1.5, 4.3.7 ו- 4.3.10, בהתבסס על הסיבות המסוכמות בטבלה 3.

טבלה 3: פתרון בעיות הקשורות לסינתזה [89Zr]Zr-DBN ותיוג רדיו תאי. סיבות ופתרונות אפשריים ליעילות כלציה נמוכה/לא עקבית, תפוקת תיוג רדיו נמוכה בתאים או אובדן כדאיות התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

הדמיית PET של סחר בתאים מציעה רגישות גבוהה, רזולוציה מרחבית מתאימה ורקענמוך 25 כיתרונות על פני שיטותאחרות 3,4,9,10. התיוג בתיווך [89 Zr]Zr-DBN של חלבוני פני התא עם קשר קוולנטי יציב מציע יציבות של תג תווית הרדיו18,19,20,21,22,23,24,25. כתוצאה מכך, [89Zr]תיוג תאים מבוסס Zr-DBN משפר את האמינות והביטחון באותות הרדיו (פליטת פוזיטרונים וגמא המיוצרים לאחר השמדה) המתקבלים מהתאים המסומנים ברדיו. בינתיים, שיטות אחרות, כגון [89Zr]Zr-oxine-based radiolabeling, ידועות כנתקלות בשטף של תיוג הרדיוטאג לאורך זמן בשל האופי הלא קוולנטי של תיוג הרדיו שלהן, ומייצרות אותות רדיו נמוכים יותר ולא מתויגים27,28.

מגבלה של טכניקת תיוג רדיו תאי זו היא שאותות הרדיואקטיביות בתמונות PET נרכשים לאחר מתן in vivo של תאים בעלי תווית רדיו חיה, אך אינה מספקת מושג אם האות מקורו בתאים מסומנים ברדיו חי או מפסולת של תאים מסומנים ברדיו שיכלו למות בגוף לאחר הממשל.

להדמיית PET לסחר בתאים יש פוטנציאל עצום, שכן היא יכולה לתמוך בפיתוח טיפולים חדשניים מבוססי תאים29,30. רופאים ומדענים העובדים בטיפולים מבוססי תאים לטיפול בסרטן 6,7,8,9,10, אוטם שריר הלב 3,4,5, אי ספיקת שריר הלב1,2, ניוון רשתית 2 ומקולרית 2 וסוכרת 2 ימצאו זאת 89פרוטוקול תיוג תאים מבוסס Zr אינסטרומנטלי, כדי להבין טוב יותר את התגובות של טיפולים מבוססי תאים שלהם, כגון טיפולים בתאי גזע. בנוסף, ל-89תאי גזע המסומנים ב-Zr31, תאי דם לבנים32, תאים דנדריטיים 33,34 ותאי CAR T35 יש פוטנציאל גדול להיכנס לתחום הקליני תוך 3-5 שנים. יתר על כן, חברות תרופות עשויות להשתמש בטכניקה זו כדי לפתח ולאמת את החומרים הטיפוליים מבוססי התאים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרס כלכלי מתחרה אך הם הממציאים של טכנולוגיה זו (פטנט # US20210330823A1).

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, מענקי NIH R01HL134664 ו- DOE DE-SC0008947, הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית, וינה, המחלקה לרפואה גרעינית במאיו קליניק, המחלקה לרדיולוגיה ומרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, רוצ'סטר, מינסוטה. כל הדמויות נוצרו באמצעות BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).

Tags

חקר הסרטן גיליון 200
טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הדמיה של סחר בתאים: שיטה של תיוג רדיו תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey,… More

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter