Summary
Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.
Abstract
Lysosomen kommunizieren häufig mit einer Vielzahl von Biomolekülen, um den Abbau und andere verschiedene zelluläre Funktionen zu erreichen. Lysosomen sind entscheidend für die menschliche Gehirnfunktion, da Neuronen postmitotisch sind und stark auf den Autophagie-Lysosomen-Weg angewiesen sind, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Trotz Fortschritten im Verständnis verschiedener lysosomaler Funktionen ist die Erfassung der hochdynamischen Kommunikation zwischen Lysosomen und anderen zellulären Komponenten technisch schwierig, insbesondere im Hochdurchsatz. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die kürzlich veröffentlichte endogene (knock-in) Lysosomen-Proximity-Markierungsmethode in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen bereitgestellt.
Sowohl lysosomale Membranproteine als auch Proteine, die Lysosomen in einem Umkreis von 10-20 nm umgeben, können in lebenden menschlichen Neuronen sicher identifiziert und genau quantifiziert werden. Jeder Schritt des Protokolls wird detailliert beschrieben, d.h. hiPSC-Neuronenkultur, Proximity-Markierung, Neuronenernte, Fluoreszenzmikroskopie, biotinylierte Proteinanreicherung, Proteinverdauung, LC-MS-Analyse und Datenanalyse. Zusammenfassend bietet diese einzigartige endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode ein robustes Analysewerkzeug mit hohem Durchsatz, um die hochdynamischen lysosomalen Aktivitäten in lebenden menschlichen Neuronen zu untersuchen.
Introduction
Lysosomen sind katabole Organellen, die Makromoleküle über den lysosomalen Autophagieweg1 abbauen. Neben dem Abbau sind Lysosomen an verschiedenen zellulären Funktionen wie Signaltransduktion, Nährstofferkennung und Sekretion beteiligt 2,3,4. Störungen der lysosomalen Funktion wurden mit lysosomalen Speicherstörungen, Krebs, Alterung und Neurodegeneration in Verbindung gebracht 3,5,6,7. Für postmitotische und stark polarisierte Neuronen spielen Lysosomen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen zellulären Homöostase, der Freisetzung von Neurotransmittern und dem Ferntransport entlang der Axone 8,9,10,11. Die Untersuchung von Lysosomen in menschlichen Neuronen war jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Neuronentechnologien haben die Kultur lebender menschlicher Neuronen ermöglicht, die zuvor unzugänglich waren, und die Lücke zwischen Tiermodellen und menschlichen Patienten überbrückt, um das menschliche Gehirn zu untersuchen12,13. Insbesondere integriert die fortschrittliche i3Neuron-Technologie stabil den Neurogenin-2-Transkriptionsfaktor in das iPSC-Genom unter einem Doxycyclin-induzierbaren Promotor, wodurch iPSCs dazu gebracht werden, sich in 2 Wochen in reine kortikale Neuronen zu differenzieren14,15.
Aufgrund der hochdynamischen lysosomalen Aktivität ist die Erfassung lysosomaler Interaktionen mit anderen zellulären Komponenten technisch anspruchsvoll, insbesondere im Hochdurchsatz. Die Proximity-Markierungstechnologie eignet sich gut zur Untersuchung dieser dynamischen Wechselwirkungen, da sie sowohl stabile als auch transiente/schwache Proteininteraktionen mit außergewöhnlicher räumlicher Spezifität erfassen kann16,17. Technisch hergestellte Peroxidase oder Biotinligase können genetisch mit dem Köderprotein verschmolzen werden. Nach der Aktivierung werden hochreaktive Biotinradikale erzeugt, um benachbarte Proteine kovalent zu markieren, die dann durch Streptavidin-beschichtete Beads für die nachgeschaltete Bottom-up-Proteomik über flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattformen (LC-MS) 17,18,19,20,21 angereichert werden können.
Eine endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode wurde kürzlich entwickelt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in i3Neuronen22 zu erfassen. Die technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2) wurde auf den C-Terminus des lysosomal assoziierten Membranproteins 1 (LAMP1) in iPSCs eingeschlagen, die dann in kortikale Neuronen differenziert werden können. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer lysosomaler Marker23. LAMP1 wird auch in späten Endosomen exprimiert, die zu Lysosomen reifen; Diese späten Endosomen-Lysosomen und nicht-degradativen Lysosomen werden in diesem Protokoll alle als Lysosomen bezeichnet. Diese endogene LAMP1-APEX-Sonde, die auf physiologischer Ebene exprimiert wird, kann LAMP1-Fehllokalisations- und Überexpressionsartefakte reduzieren. Hunderte von lysosomalen Membranproteinen und lysosomalen Interaktoren können mit hervorragender räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen identifiziert und quantifiziert werden.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit weiteren Verbesserungen der kürzlich veröffentlichten Methode22 beschrieben. Der gesamte Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasst die hiPSC-abgeleitete Neuronenkultur, die Aktivierung der Proximity-Markierung in Neuronen, die Validierung der APEX-Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie, die Bestimmung eines optimalen Verhältnisses von Streptavidin-Perlen zu Eingangsproteinen, die Anreicherung biotinylierter Proteine, die Proteinverdauung auf Perlen, die Entsalzung und Quantifizierung von Peptiden, die LC-MS-Analyse und die Analyse von Proteomik-Daten. Richtlinien zur Fehlerbehebung und experimentelle Optimierungen werden ebenfalls diskutiert, um die Qualitätskontrolle und Leistung der Proximity-Kennzeichnung zu verbessern.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Biosicherheits- und Ethikkommission der George Washington University genehmigt. Die Zusammensetzungen der in diesem Protokoll verwendeten Medien und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die hier verwendeten kommerziellen Produktinformationen finden Sie im Materialverzeichnis.
1. Humane iPSC-abgeleitete Neuronenkultur
- Humane iPSC-Kultur und LAMP1-APEX-Sondenintegration (7 Tage)
- Matrigel-Stammlösung in einem Eiskübel bei 4 °C über Nacht auftauen, 500 μL der Lösung in kalte sterile Röhrchen geben und die Aliquots bei −80 °C lagern. Bereiten Sie 50 ml Beschichtungslösung vor, indem Sie 500 μL des Matrigel-Schaftes in 49,5 ml kaltes DMEM/F12-Medium geben.
HINWEIS: Halten Sie das Matrigel kalt und verwenden Sie vorgekühlte konische Röhrchen und Pipettenspitzen, um eine Polymerisation zu verhindern. Die Beschichtungslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. - Eine 10 cm große Zellkulturschale mit 4 mL Beschichtungslösung für 1 h in einem 37 °C Inkubator beschichten.
HINWEIS: Vitronectin kann eine alternative Beschichtungslösung bei 5 μg/ml Konzentration und 2 h Beschichtung für die iPSC-Kultur sein. Vitronectin (einzelne Proteinkomponente) ist teurer als Matrigel, hat aber weniger Chargenvariationen und sauberere Hintergrundsignale als Matrigel, das aus Maustumoren mit zahlreichen extrazellulären Matrixproteinen extrahiert wird. Für die Invitronektin-Beschichtung wird eine unbehandelte Gewebekulturplatte benötigt. Die Matrigelbeschichtung funktioniert sowohl für behandelte als auch für unbehandelte Gewebekulturplatten. - Auftauen und Platte 1-3 Millionen hiPSCs auf jeder beschichteten 10-cm-Schale, die mit 8 mL Essential E8 Komplettmedium vorgeladen ist, ergänzt mit ROCK-Inhibitor (Endkonzentration 10 μM Y-27632 oder 50 nM Chroman1).
HINWEIS: Die Zugabe von ROCK-Inhibitor (Y-27632 oder Chroman1) zum Stammzellkulturmedium minimiert die dissoziationsinduzierte Apoptose nach Spaltung und kryogener Konservierung. Chroman1 hat sich kürzlich als wirksamer als Y-27632 bei der Hemmung von ROCK1 und ROCK224 erwiesen. - Wechsel zu 10 ml E8 Komplettmedium ohne ROCK-Inhibitor, nachdem die iPSCs Kolonien gebildet haben, typischerweise nach 1-2 Tagen. Pflegen Sie die iPSC-Kultur im E8-Komplettmedium und ersetzen Sie den Überstand jeden zweiten Tag durch frisches Medium.
- Integration des Proximity-Markierungsenzyms, technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2), in den C-Terminus des endogenen LAMP1-Gens durch CRISPR-Genom-Engineering. Detaillierte Schritte zur Erzeugung einer technisch stabilen Zelllinie finden Sie in der zuvor veröffentlichten Methode (Frankenfield et al). 22.
- Matrigel-Stammlösung in einem Eiskübel bei 4 °C über Nacht auftauen, 500 μL der Lösung in kalte sterile Röhrchen geben und die Aliquots bei −80 °C lagern. Bereiten Sie 50 ml Beschichtungslösung vor, indem Sie 500 μL des Matrigel-Schaftes in 49,5 ml kaltes DMEM/F12-Medium geben.
- Humane iPSC-Neuronendifferenzierung (3 Tage)
- Vor der Differenzierung eine 10 cm große Zellkulturschale über Nacht mit 4 ml Matrigel-Beschichtungslösung in einem 37 °C Inkubator beschichten.
- Halten Sie die hiPSCs bis ~70% Konfluenz aufrecht. Waschen Sie die hiPSCs vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 2x, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Das PBS absaugen und 3 ml Accutase in die 10 cm lange Zellschale geben. Schütteln Sie die Platte für eine gleichmäßige Verteilung und inkubieren Sie für 8 min in einem 37 °C Inkubator.
- Fügen Sie 2 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen und von der Platte zu heben, und sammeln Sie die gesamte Zelllösung in einem 15-ml-konischen Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Platte 2-4 × 106 hiPSCs auf eine Matrigel-beschichtete Platte, die mit 8 mL warmem Neuroneninduktionsmedium vorgeladen ist (Tabelle 1). Die Zellen gleichmäßig verteilen und in einen 37 °C heißen Inkubator geben.
HINWEIS: Die Neuronendifferenzierung wird durch einen Doxycyclin-induzierbaren Transkriptionsfaktor, Neurogenin-2 (NGN2), angetrieben, der in dieser stabilen hiPSC-Zelllinie15 überexprimiert wurde. - Waschen Sie hiPSCs am Tag 1 der Differenzierung vorsichtig mit PBS, um abgestorbene Zellablagerungen zu entfernen. Ersetzen Sie durch 10 ml warmes Induktionsmedium ohne ROCK-Inhibitor.
- Wechsel mit warmem Induktionsmedium ohne ROCK-Inhibitor jeden Tag bis Tag 3 der Differenzierung.
HINWEIS: Neuronen sind bereit, in ein neuronales Medium umgewandelt zu werden.
- Plattierung von Neuronen und Aufrechterhaltung der Neuronenkultur (10 Tage)
- 0,1 mg/ml Poly-L-Ornithin (PLO)-Beschichtungslösung in Boratpuffer herstellen (Tabelle 1).
- Beschichten Sie eine Zellkulturschale mit der PLO-Beschichtungslösung in einem 37 °C-Inkubator für mindestens 1 Stunde oder über Nacht, bevor Sie Tag 3 Neuronen plattieren. Waschen Sie die Schale dreimal mit 4 ml sterilem Wasser und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen.
- Dissoziieren Sie Tag 3 Neuronen von jeder 10 cm Schale mit 3 ml Accutase und Platte 8-10 Millionen Zellen auf jede 10 cm PLO-beschichtete Schale, die mit warmem kortikalem Neuronmedium vorgeladen ist (Tabelle 1).
- Führen Sie alle 2-3 Tage einen Halbmittelwechsel mit warmem Neuronenmedium durch, bisdiei3-Neuronen in 2 Wochen nach der Differenzierung die Reifung erreichen.
2. In situ Proximity-Markierung und Neuronenlyse (2 h)
- 500 mM Biotin-Phenol (BP)-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) herstellen und bei −20 °C lagern. Am Tag der Proximity-Markierung die BP-Stammlösung mit warmem Neuronenmedium verdünnen und die Neuronen in einer Endkonzentration von 500 μM für 30 min in einem 37 °C Inkubator behandeln.
HINWEIS: Doxycyclin wird in das Neuronenmedium gegeben, wodurch die APEX-Enzymexpression aktiviert wird. Doxcyclin muss mindestens 24 Stunden vor dem Proximity-Markierungsexperiment zugegeben werden. - Die Markierungsreaktion wird durch Zugabe vonH2O2in einer Endkonzentration von 1 mM in die Neuronenkultur eingeleitet und genau 1 min inkubiert. Das Medium sofort absaugen und 3-mal mit Abschreckpuffer abspülen (Tabelle 1).
HINWEIS:H2O2-Lösungsollte vor der Etikettierreaktion frisch hergestellt werden. Die H2O2-Aktivierung muss genau 1 min betragen, um die experimentelle Variation zu reduzieren und oxidativen Stress zu minimieren, der durch eine längereH 2 O2-Behandlungverursacht wird. - Neigen Sie die Platte, um den gesamten Restpuffer abzusaugen. Fügen Sie einen eiskalten Zelllysepuffer (Tabelle 1) direkt auf die Neuronenplatte auf. Verwenden Sie 100 μL Zelllysepuffer pro 1 Million Neuronen. Schwenken Sie die Platte für eine ausreichende Zelllyse und legen Sie sie auf Eis.
- Schaben Sie die Zelllysate in kalte 1,5 ml Röhrchen. In einem eiskalten Wasserbad mit einem Badesonikator (>100 W) für 15 min mit abwechselnden 40 s eingeschalteten, 20 s ausgeschalteten Zyklen beschallen.
HINWEIS: Ausreichend lysierte Proteinlösung sollte ohne Pellets oder übermäßige Blasen klar sein. Eine ausreichende Beschallung von Zelllysat ist entscheidend, um Nukleinsäuren zu scheren und die Klebrigkeit des Zelllysats zu reduzieren, um die unspezifische Bindung in nachgeschalteten Verfahren zu reduzieren. Ein Sondenbeschaller kann auch verwendet werden, um eine stärkere und schnellere Zelllyse zu ermöglichen, aber das Waschen der Sonde zwischen den Proben ist erforderlich, um Kreuzkontamination und Probenverlust zu minimieren. - Kaltes Aceton (−20 °C) wird der Probe mit einem 4-fachen Volumen Lysepuffer zugegeben. Wirbeln Sie kurz und inkubieren Sie bei −20 °C für 3 h.
- Bei 16.500 × g 10 min bei 2 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Proteinpellet zu stören. Das Pellet wird 2x mit 1 ml −20 °C Aceton gewaschen und nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt.
- Trocknen Sie das Proteinpellet mit einem Vakuumkonzentrator für 1 min. Fügen Sie Zelllysepuffer hinzu, um das Pellet vollständig aufzulösen. Bei Bedarf kurz beschallen. Lagern Sie die Proben bei −80 °C.
HINWEIS: Acetonfällung kann Rückstände von Biotinphenol in der Probe entfernen, was die nachgeschaltete Anreicherung von biotinylierten Proteinen stören kann.
3. Fluoreszenzmikroskopie zur Validierung der APEX-Lokalisierung und -Aktivität (1,5 Tage)
- Inkubieren Sie die i3Neuronen, die endogene LAMP1-APEX exprimieren, mit 500 μM BP für 30 min bei 37 °C. Aktivieren Sie die Markierung mit 1 mMH2O2-Behandlungfür nur 1 s, um die Diffusion der Biotin-Wolke zu begrenzen.
- Die Zellen sofort mit 4% Paraformaldehyd im Quenchpuffer fixieren und 3x vorsichtig mit PBS waschen.
HINWEIS: Für eine 10 cm Schüssel werden 4-6 ml für eine ausreichende Wäsche benötigt. - Blockieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 3% Eselserum und 0,1% Saponin in PBS für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Inkubieren Sie die Zellen mit primärem Anti-LAMP1-Antikörper (Maus monoklonal H3A4, 1:1.000) über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Neuronen 3 x vorsichtig mit PBS. Inkubieren Sie die Neuronen mit sekundären Anti-Maus-AF561-Antikörpern (1:1.000) und Streptavidin-680 (1:1.000) für 1 h bei RT.
- 2x mit PBS waschen und mit Hoechst oder 4',4-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Kernmarker für 10 min bei RT inkubieren. Spülen Sie die Zellen 2x mit PBS aus.
- Visualisieren Sie die fixierten Neuronen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Beobachten Sie biotinylierte Proteine, die mit Streptavidin gefärbt und mit LAMP1 kolokalisiert sind, außerhalb des Zellkerns, um den korrekten Ort der APEX-Aktivität zu validieren.
4. Bestimmung des Streptavidin-Beads-to-Input-Protein-Verhältnisses (1,5 Tage)
- Durchführung eines waschmittelkompatiblen Proteintests (DCA) zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentrationen in Zelllysaten
- Rinderserumalbumin (BSA) -Proteinstandard im Zelllysepuffer in einer Konzentration von 4 mg/ml auflösen. Bereiten Sie eine Reihe von BSA-Proteinstandardlösungen (0,2-2 mg / ml, 5 Verdünnungen) unter Verwendung des Zelllysepuffers vor.
- Übertragen Sie 5 μL aus jeder Proteinprobe, BSA-Proteinstandardlösung und Leerzelllysepuffer in dreifacher Ausfertigung in jede Vertiefung in einer 96-Well-Platte.
- Fügen Sie 2 μL Reagenz S pro 1 ml Reagenz A hinzu, um Reagenz A' zu erhalten. Fügen Sie 25 μL Reagenz A' in jede Vertiefung hinzu. Fügen Sie 200 μL Reagenz B in jede Vertiefung hinzu. Mischen und platzen Sie Blasen, falls vorhanden.
- Inkubieren Sie diese 96-Well-Platte bei RT für 15 Minuten, lesen Sie die Absorption bei 750 nm in einem Mikrotiterplattenleser ab und quantifizieren Sie die Konzentrationen von Proteinproben basierend auf der BSA-Standardkurve.
- Beads Titration Dot Blot Assay (1,5 Tage)
- Übertragen Sie eine Reihe von Streptavidin-Magnetkügelchen (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) in PCR-Streifenröhrchen. Legen Sie die PCR-Streifenröhrchen auf ein Magnetgestell, waschen Sie die Perlen 3x mit 100 μL 2% SDS-Puffer und entfernen Sie den Waschpuffer vollständig, während Sie sich auf dem Magnetgestell befinden.
- Fügen Sie 50 μg Proteinprobe in jedes Röhrchen hinzu. Fügen Sie mehr Lysepuffer zu einem Gesamtvolumen von 80 μL hinzu. Verschließen Sie jedes Röhrchen fest und drehen Sie es über Nacht bei 4 °C.
- Zentrifugieren Sie die PCR-Streifenröhrchen kurz auf einer Tisch-Mikrozentrifuge. Legen Sie die PCR-Streifenröhrchen für 1 min auf ein Magnetgestell. 2 μL Überstand aus jedem Röhrchen auf eine trockene Nitrozellulosemembran aufspüren und die Membran vollständig trocknen lassen.
HINWEIS: Wenn die Signalintensität niedrig ist, können mehr als 2 μL auf der Membran entdeckt werden. Das Volumen kann erhöht werden, indem mehrmals an derselben Stelle gespottet wird, nachdem die Membran zwischen jedem Mal luftgetrocknet wurde. Ein Bio-Dot-Gerät kann ebenfalls verwendet werden. - Inkubieren Sie die Membran in Blockierpuffer (TBS) für 1 h. Inkubieren Sie die Membran in Streptavidin Alexa Fluor 680 Konjugat (1:1.000 im Blockierpuffer) für 1 h. Dann waschen Sie die Membran 5x mit TBS-T (Tabelle 1).
HINWEIS: Eine Alternative zum Dot-Blot-Assay ist das Western Blotting mit einem Streptavidin-Antikörper. - Messen Sie das Fluoreszenzsignal jedes Punktes auf der Membran unter 680 nm Wellenlänge und erzeugen Sie ein Streudiagramm mit Fluoreszenzsignal über das Volumen der Perlen. Wählen Sie das optimale Volumen an Perlen, das für 50 μg der Eingangsproteinprobe benötigt wird, basierend darauf, wo der exponentielle Zerfall der Kurve endet.
HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität stellt die Häufigkeit biotinylierter Proteine im Überstand dar, die mit zunehmender Menge an Perlen abnehmen sollte.
5. Anreicherung biotinylierter Proteine und Aufperlenverdauung (3 Tage)
- Proteinlysatproben von −80 °C übertragen und die Proben in 1,5-ml-Röhrchen für 30 s in einem Badsonikator beschallen, um die Lösungen schnell aufzutauen. Vortex und legen Sie die Probenröhrchen auf Eis.
- Übertragen Sie 250 μL Streptavidin (SA) magnetische Beads Slurry in jedes 1,5 ml Röhrchen. Stellen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell, waschen Sie die Perlen 3x mit 1 ml Waschpuffer A (2% SDS) und entfernen Sie den Restpuffer.
- Basierend auf den Ergebnissen des Dot-Blot-Assays und des DC-Protein-Assays wird die Menge an Proteinprobe (μg) berechnet, die für 250 μL der Streptavidin-Magnetperlenaufschlämmung benötigt wird.
HINWEIS: In dieser endogen exprimierten LAMP1-APEX-Sonde werden 5 μL Perlen für 50 μg Eingangsprotein benötigt. Daher werden 2,5 mg Gesamtprotein zu 250 μL Perlen hinzugefügt. Weniger als 250 μL SA-Perlen können für begrenztes Eingangsprobenmaterial verwendet werden. - Das Röhrchen mit dem magnetischen Bead-Lysat-Gemisch wird mit einem Zelllysepuffer auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gefüllt und über Nacht bei 4 °C gedreht.
HINWEIS: Proben aus verschiedenen Gruppen oder Replikaten sollten auf die gleiche Proteinkonzentration, das gleiche Volumen und die gleiche Menge an Perlen normalisiert werden, um experimentelle Variationen zu reduzieren. - Drehen Sie alle Röhrchen kurz auf einer Tisch-Mikrozentrifuge herunter und legen Sie die Röhrchen für 1 Minute auf ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Überstand, während Sie sich auf dem Magnetgestell befinden.
HINWEIS: Es ist wichtig, jedes Mal 1 Minute zu warten, nachdem die Probenröhrchen auf das Magnetgestell gelegt wurden. Dies kann den Perlenverlust aufgrund der unsichtbaren kleinen Menge von Perlen minimieren, die sich immer noch in Richtung des Magneten in der Lösung bewegen. - Waschen Sie die Perlen 2x mit 1 ml Waschpuffer A bei RT (jeweils 5 min Umdrehung). Wiederholen Sie den Vorgang mit jedem Waschpuffer 2x nacheinander bei 4 °C. (Puffer B, Puffer C und Puffer D; Tabelle 1).
HINWEIS: Eine hohe Konzentration von SDS-Lösung kann bei kalten Temperaturen ausfallen. Die erste Wäsche muss bei RT durchgeführt werden. - Legen Sie die Schläuche auf das Magnetgestell. Waschen Sie die Perlen 2x mit Buffer D, um den Reinigungsmittelrest vollständig zu entfernen. Resuspendieren Sie die Beads in 100 μL 50 mM Tris-Puffer und fügen Sie 5 mM TCEP (Endkonzentration) hinzu, um 30 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer zu inkubieren und bei 1.200 U/min zu schütteln.
- Zu jedem Röhrchen 15 mM Iodacetamid (IAA, Endkonzentration) geben und 30 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer inkubieren, wobei bei 1.200 U/min im Dunkeln geschüttelt wird (Mischerkappe auf).
HINWEIS: IAA ist lichtempfindlich und sollte 5 Minuten vor diesem Schritt frisch gemacht werden. - Fügen Sie 5 mM TCEP (Endkonzentration) hinzu, um überschüssige IAA zu löschen. Inkubieren Sie für 10 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer mit Schütteln bei 1.200 U/min (Mischerkappe ab).
- Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen kurz und legen Sie sie für 1 Minute auf ein Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 200 μL 5 mM TCEP in 50 mM Tris-Puffer hinzu, um die Beads zu resuspendieren. 1 μg Trypsin/Lys-C-Mischung in die Probe geben und 14 h bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer unter Schütteln bei 1.200 U/min inkubieren.
- Fügen Sie weitere 0,2 μg Trypsin/Lys-C-Mischung hinzu und verdauen Sie sie für 3 h.
- Drehen Sie die Probenröhrchen kurz herunter und legen Sie die Röhrchen für 1 min auf ein Magnetgestell. Übertragen Sie den Peptidüberstand, um die Röhrchen auf einem Magnetgestell zu reinigen. Waschen Sie die Perlen mit 50 μL 50 mM Tris-Puffer (5 min schütteln) und mischen Sie die Peptidüberstände.
- Geben Sie 30 μL 10% Trifluoressigsäure (TFA) in das Röhrchen, das den Peptidüberstand enthält, um einen pH-Wert <3 zu erhalten.
6. Entsalzung und Fraktionierung von Peptiden (2 h)
- Befeuchten Sie die Umkehrphasen-Festphasenextraktionsplatte (nur die Vertiefungen zur Verwendung) mit 200 μL Methanol (MeOH) in HPLC-Qualität 3x auf dem Vakuumverteiler. Fügen Sie 200 μL 1% TFA in HPLC-Wasser 3x hinzu, um die Platte auszugleichen.
- Laden Sie die Peptidproben in die Platte und schalten Sie das Vakuum langsam für eine Flussgeschwindigkeit von weniger als 3 Tröpfchen / s ein, um den Probenverlust zu minimieren.
- Waschen Sie die Absaugplatte 3x mit 200 μL 1% TFA. Waschen Sie die Extraktionsplatte erneut mit 200 μL 1% TFA mit 2% MeOH (v/v). Halten Sie die Strömungsgeschwindigkeit niedriger als 3 Tröpfchen/s.
- Ersetzen Sie die Sammelplatte durch eine Sammelplatte mit 96 Vertiefungen. Wenn keine Fraktionierung erforderlich ist, eluieren Sie die Peptidproben 3x mit 100 μL 1% TFA mit 80% MeOH und mischen Sie sie in einem neuen Probenröhrchen. Trocknen Sie die Peptidproben in einem Vakuumkonzentrator ohne Hitze.
HINWEIS: Wenn eine Fraktionierung gewünscht wird, können Peptidproben anschließend in 4 Fraktionen eluiert werden, wobei 200 μL 1% TFA mit 15%, 35%, 50% bzw. 90% MeOH in einer anderen Sammelplatte verwendet werden.
7. Kolorimetrischer Peptidquantifizierungstest (fakultativ) (1 h)
- Resuspendieren Sie Peptidproben in 50 μL LC-MS-Wasser und nehmen Sie 20 μL Aliquots, um den Peptidtest durchzuführen.
HINWEIS: Dieser Schritt verbraucht eine große Menge an Peptidproben, kann aber eine genaue Quantifizierung der Peptidkonzentration vor der LC-MS-Analyse liefern. Dies wird in der Regel nur einmal pro Probentyp für Tests vor der großflächigen Probenvorbereitung durchgeführt. - Herstellen serieller Verdünnungen der Peptidstandardlösungen (im kolorimetrischen Assay-Kit enthalten) in LC-MS-Wasser. Bereiten Sie das Arbeitsreagenz vor, indem Sie 50% Reagenz A, 48% Reagenz B und 2% Reagenz C mischen.
- 20 μL jeder Peptidstandardlösung (drei Replikate) und die unbekannte Peptidprobe werden in eine 96-Well-Mikroplatte überführt. Geben Sie 180 μL des Arbeitsreagenzes in jede Vertiefung, mischen Sie gut und inkubieren Sie die Platte für 30 min bei RT.
- Lesen Sie die Absorption bei 480 nm in einem Mikrotiterplatten-Reader ab und quantifizieren Sie die Konzentrationen von Peptidproben basierend auf der Peptidstandardkurve.
8. LC-MS-Analyse
- Resuspendieren Sie die Peptidproben in LC-Puffer A (2% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure, LC-MS-Qualität). Zentrifugieren Sie bei 16.500 × g für 10 min bei 4 °C, um mögliche Partikel zu entfernen.
- Übertragen Sie den Überstand in LC-MS-Durchstechflaschen. Analysieren Sie die Proben mit einem nanoLC-MS-Gerät.
HINWEIS: Detaillierte LC-MS/MS-Parameter sind geräteabhängig und wurden zuvor22,25,26 beschrieben. - Generieren Sie eine benutzerdefinierte LC-MS-Ausschlussliste mit einer Reihe von Retentionszeiten für sehr häufige kontaminierende Peptidpeaks wie Streptavidin und Trypsin mit einer Massengenauigkeit von 5 ppm 22 (z. B. sind häufige Streptavidinpeptidpeaks m/z 402,5435 [Ladung 3], m/z 603,3117 [Ladung 2], m/z 654,9733 [Ladung 3], m/z 678,6812 [Ladung 3], m/z 1017,5182 [Ladung 2], etc.; Häufige Trypsinpeptid-Peaks sind M/Z 421,7584 [Ladung 2], M/Z 523,2855 [Ladung 2] und M/Z 737,7062 [Ladung 3]).
9. Proteomik-Datenanalyse
- Analysieren Sie die LC-MS-Rohdaten mit Proteomik-Datenanalysesoftware wie Proteome Discoverer, MaxQuant27 oder MS-Fragger28. Fügen Sie zwei FASTA-Bibliotheken für die Datenanalyse hinzu: 1) eine Swissprot Homo Sapiens-Referenzdatenbank ; 2) eine neu generierte universelle Schadstoff-FASTA-Bibliothek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), die nachweislich die Identifizierung der Proteomik verbessert und falsche Entdeckungen verringert29.
- Richten Sie die Proteomik-Datenanalyseparameter mit einem FDR-Cutoff (False Discovery Rate) von 1% für Protein- und Peptidspektralvergleichsidentifikationen (PSM) ein. Wählen Sie den Trypsinaufschluss mit maximal drei verpassten Spaltungen, einer festen Modifikation der Cysteincarbamidomethylierung und einer variablen Modifikation der Methioninoxidation und der Protein-N-terminalen Acetylierung. Verwenden Sie Peptid-MS1-Spitzenintensitäten für eine markierungsfreie Quantifizierung. Normalisieren Sie die Peptidintensitäten auf die endogen biotinylierte Carboxylase, Propionyl-CoA-Carboxylase (PCCA), um Variationen der Proximity-Markierung zu reduzieren, wie zuvor beschrieben22.
HINWEIS: Die PCCA-Normalisierung kann in der Proteome Discoverer-Software ausgewählt werden, indem eine PCCA-Proteinsequenz-FASTA-Datei eingeschlossen wird. Alternativ kann eine PCCA-Normalisierung in der nachgelagerten Datenanalyse durchgeführt werden. - Exportieren Sie Ergebnisse auf Proteinebene aus der Proteomik-Software. Entfernen Sie kontaminierende Proteine vor der statistischen Analyse29. Entfernen Sie Proteine mit nur 1 PSM oder ohne Quantifizierungsergebnis. Führen Sie eine Protein-Gen-Ontologie (GO)-Termanalyse mit Enrichr30 und Proteinnetzwerkanalyse mit STRING31 durch.
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Representative Results
Diese Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Studie wurde an humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen durchgeführt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in situ in lebenden Neuronen zu erfassen. Zellmorphologien von hiPSCs und hiPSC-abgeleiteten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Abbildung 2A dargestellt. Humane iPSCs wachsen in Kolonien in E8-Medium. Die Differenzierung wird eingeleitet, indem iPSCs in Doxycyclin-haltiges Neuroneninduktionsmedium plattiert werden. Neuritenerweiterungen werden während der 3-tägigen Differenzierung jeden Tag sichtbarer. Nach dem Wechsel zu PLO-beschichteten Platten im Neuronenmedium bilden die Neuriten ein Netzwerk zwischen Neuronen, und axonale Erweiterungen werden sichtbarer, wenn die Neuronen in 2 Wochen reifen. In i3Neuronen wird die Lokalisation der APEX-Sonde durch Fluoreszenzmikroskopie nach schneller APEX-Aktivierung validiert. Biotinylierte Proteine werden mit Streptavidin (SA)-Antikörpern gefärbt, und Lysosomen werden mit Anti-LAMP1-Antikörpern gefärbt. Das zusammengeführte Bild validiert die korrekte Lokalisierung von LAMP1-APEX zum Köderprotein (Abbildung 2B).
Der Bead-Titrations-Assay ist entscheidend, um das optimale Beads-to-Protein-Verhältnis zu bestimmen, so dass die Menge an Streptavidin-Beads ausreicht, um alle biotinylierten Proteine anzureichern, aber nicht so übermäßig ist, um eine ernsthafte Streptavidin-Kontamination bei LC-MS zu verursachen. Das optimale Volumen an Perlen, das für 50 μg der Eingangsproteinprobe benötigt wird, wird auf der Grundlage ausgewählt, wo der exponentielle Zerfall der Kurve endet (Abbildung 3A) Wie in Abbildung 3A gezeigt, nahmen die Dot-Blot-Signale vom Beads-Protein-Inkubationsüberstand ab, da mehr biotinylierte Proteine mit erhöhten Mengen der Streptavidin-Beads erfasst wurden. Für endogene LAMP1-APEX-Proben waren 5 μL Streptavidin-Beads optimal für 50 μg Eingangsprotein (hervorgehoben in Abbildung 3A). Nach der Anreicherung ist die Menge an Protein, die von den Streptavidin-Perlen eingefangen wird, unbekannt. Überschüssiges proteolytisches Enzym (Trypsin) kann die Enzymautoverdauung erhöhen, mit reichlich Trypsinpeptid-Peaks bei LC-MS. Übermäßiges Trypsin kann auch mehr Streptavidinpeptide in den Proben verdauen. Daher sollte die Menge an Protease, die für die Aufperlenverdauung benötigt wird, optimiert werden. Im Vergleich zu Trypsin allein führte die Auf-Perlen-Verdauung mit Trypsin / Lys-C-Mischung zur Identifizierung von mehr Proteinen und Peptiden und weniger verpassten Spaltungen (Abbildung 3B). Darüber hinaus waren 1-1,5 μg Protease pro 250 μL Streptavidin-Magnetkügelchen optimal, um die höchste Anzahl identifizierter Proteine und den niedrigsten Prozentsatz an verpassten Spaltungen zu erhalten (Abbildung 3C). Bei einem optimalen Verhältnis von Perlen zu Protein sollte die gleiche Menge an Perlen die gleiche Menge an biotinylierten Proteinen erfassen. Daher kann diese optimierte Proteasemenge für alle Experimente verwendet werden, die biotinylierte Proteine mit den gleichen Streptavidin-Magnetkügelchen anreichern.
Peroxidase-basierte Proximity-Markierungsenzyme werden durch Biotin-Phenol-Inkubation und kurzeH2O2-Behandlung(1 min) aktiviert. Dieser Schritt ist eine Hauptquelle für Variationen in der Proximity-Labeling-Proteomik. Wir haben bereits festgestellt, dass die Normalisierung auf die am häufigsten vorkommende, endogene biotinylierte Carboxylase, PCCA, experimentelle Variationen signifikant reduzieren kann, was den Vergleich von Proximity-Markierungsproteomik-Daten über verschiedene experimentelle Chargen hinweg ermöglicht (Abbildung 4)22. Für endogene LAMP1-APEX-Neuronen wurde die Elternlinie ohne LAMP1-APEX-Sondenexpression als Kontrollgruppe verwendet. Kontrollneuronen wurden ebenfalls mit Biotin-Phenol undH2O2behandelt. Die Verteilung der Proteinverhältnisse von LAMP1-APEX im Vergleich zur Kontrollgruppe ist in Abbildung 5A dargestellt. Alle endogen biotinylierten Carboxylasen wurden mit Streptavidin-beschichteten Perlen angereichert, blieben aber unverändert. Wie in der GO-Term-Analyse und der Proteinnetzwerkanalyse (Abbildung 5B,C) gezeigt, wurden sowohl stabile lysosomale Membranproteine als auch transiente lysosomale Interaktoren im Zusammenhang mit endolysosomalem Transport und Transport in LAMP1-APEX-Proteomik32,33,34 angereichert.
Abbildung 1: Gesamt-Workflow für die Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik in hiPSC-abgeleiteten Neuronen. Abkürzungen: hiPSC = human induced pluripotent stem cell; LAMP1 = lysosomal assoziiertes Membranprotein 1; APEX = Ascorbatperoxidase; Dox = Doxycyclin; BP = Biotin-Phenol; DCA = Detergenzien-kompatibler Proteinassay; SA = Streptavidin; LC-MS/MS = Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie; PCCA = Propionyl-CoA-Carboxylase, ein endogen biotinyliertes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikroskopische Bildgebung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen und LAMP1-APEX-Aktivität. (A) Hellfeldmikroskopie-Bilder verschiedener Stadien von hiPSCs und hiPSC-abgeleiteten Neuronen. (B) Fluoreszenzbildgebung der LAMP1-APEX-Aktivität im Neuron. Biotinylierte Signale, die gegen Streptavidin gefärbt sind, kolokalisieren mit LAMP1-Färbung außerhalb des Zellkerns (HOECHST). Maßstabsbalken = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Abkürzungen: hiPSC = human induced pluripotent stem cell; LAMP1 = lysosomal assoziiertes Membranprotein 1; APEX = Ascorbatperoxidase; SA = Streptavidin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Optimierung des Verhältnisses von Beads zu Input-Protein und die enzymatische Proteinverdauung können die Proteinidentifikation verbessern und Interferenzen reduzieren . (A) Beispiel für Beads-Titrations-Assay-Ergebnisse aus dem Dot-Blot-Assay unter Verwendung von 50 μg Eingangsprotein und unterschiedlichen Mengen von Streptavidin-Beads. (B) Die Trypsin/Lys-C-Mischung führte zu einer besseren Protein-/Peptididentifizierung und weniger verpassten Spaltungen als Trypsin allein. (C) Optimierung der Menge an Trypsin/Lys-C für die Auf-Perlen-Verdauung. Diese Zahl wurde von Frankenfield et al.22 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Normalisierung der Proximity-Markierungs-Proteomik-Daten auf eine endogene biotinylierte Carboxylase, PCCA, kann Quantifizierungsvariationen zwischen biologischen Replikaten reduzieren. Diese Zahl wurde von Frankenfield et al.22 modifiziert. Abkürzung: PCCA = Propionyl-CoA-Carboxylase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik reicherte lysosomale Membranproteine und lysosomal interagierende Proteine in Neuronen an. (A) Streudiagramm der Proteinhäufigkeitsverhältnisse von LAMP1-APEX versus keine APEX-Kontrolle mit angereicherten lysosomalen Membranproteinen und unveränderten endogen biotinylierten Proteinen. (B) GO-Term-Analyse von Proteomik-Ergebnissen, die eine angereicherte zelluläre Komponente am Lysosom belegen. (C) STRING-Proteinnetzwerkanalyse, die zeigt, dass Proteine direkt mit dem Köderprotein (LAMP1), lysosomalen Membranproteinen und lysosomalen Interaktoren wie Membrantransportproteinen interagieren. Diese Zahl wurde von Frankenfield et al.22 modifiziert. Abkürzungen: LAMP1 = lysosomal associated membrane protein 1; APEX = Ascorbatperoxidase; GO = Genontologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Mittel/Puffer | Bestandteil | Protokoll | ||
| Basalmembranmatrix (Matrigel) Beschichtungslösung | 1% Basalmembranmatrixmaterial, 99% DMEM/F12-Medium | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronectin-Beschichtungslösung | 5 μg/ml Endkonzentration in PBS | 1.1 | ||
| E8 Komplettmedium mit ROCK-Inhibitor | 98% E8 mittel, 2% E8 Ergänzung, 10 μM Y-27632 oder 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Neuronen-Induktionsmedium | 97% DMEM/F12 mit HEPES, 1% N2-Ergänzung, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin, 2 μg/ml Doxycyclin und ROCK-Inhibitor (10 μM Y-27632 oder 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO Beschichtungslösung | 0,1 mg/ml Poly-L-Ornithin (PLO), 100 mM Borsäure, 25 mM Natriumtetraborat, 75 mM Natriumchlorid, 1 M Natriumhydroxid | 1.3 | ||
| Neuron Medium | 98% kortikales Neuronenmedium, 2% B27-Ergänzung, 10 ng/ml neurotropher Faktor (BDNF), 10 ng/ml glial-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF), 10 ng/ml NT-3, 0,2 μg/ml Laminin, 2 μg/ml Doxycyclin | 1.3 | ||
| Quench-Puffer | 10 mM Natriumazid, 10 mM Natriumascorbat, 5 mM TROLOX in PBS | 2.2 | ||
| Zelllysepuffer | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 10 mM Natriumazid, 10 mM Natriumascorbat, 5 mM TROLOX, Proteaseinhibitor-Cocktail | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Puffer A | 2% SDS-Puffer | 5.2 | ||
| Puffer B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Puffer C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Puffer D | 2 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Medien und Puffer.
| Problem | Protokoll | Lösung/Vorschlag | ||||
| iPSC-Kultur schält sich vom Teller | 1.1 | Erhöhen Sie die Invitronektin-Beschichtungskonzentration oder -zeit. | ||||
| Einige iPSCs differenzierten sich nicht in Neuronen | 1.2 | Verlängern Sie die Behandlungszeit der Zellablösung, um iPS-Zellen während der d0-Differenzierung vollständig zu dissoziieren. | ||||
| Neuronenkultur schält sich vom Teller | 1.3 | Das Waschen und Wechseln des Mediums muss schonend und von der Seitenwand der Platte aus erfolgen. | ||||
| Proteine lösen sich nach Acetonfällung nicht vollständig auf | 2.7 | Verkürzen Sie die Trocknungszeit des Proteinpellets. Erhöhen Sie das Volumen des Lysepuffers und beschallen Sie kurz, um die Auflösung zu unterstützen. | ||||
| Schwache Streptavidin-Färbesignale | 3 | Erhöhen Sie dieH2O2-Behandlungszeit auf 2-3 s und schwenken Sie die Platte für eine gleichmäßige Verteilung. | ||||
| Niedriges Signal des Beads-Titrationsassays | 4.2 | Warten Sie, bis die Membran vollständig getrocknet ist, und fügen Sie mehr Überstand an der gleichen Stelle hinzu (kann bis zu 3x wiederholt werden), um die Signalintensität zu erhöhen. | ||||
| Magnetische Kügelchen, die nicht in Richtung Magnetgestell pelletieren | 5 | Die Beweglichkeit der magnetischen Perlen nimmt in einem nicht waschmittelhaltigen Puffer ab. Im Waschpuffer D können höhere Harnstoffkonzentrationen bis 4 M oder LC-MS-kompatibles Waschmittel verwendet werden. | ||||
| Magnetischer Perlenverlust beim Waschen von Perlen | 5 | Verlängern Sie die Wartezeit beim Platzieren der Probenröhrchen auf den Magnetkügelchen (1 min oder länger), bevor der Überstand aus den Röhrchen entnommen wird. | ||||
| Einzeln geladene Kontaminationsspitzen bei LC-MS | 6 | Peptidreinigung nicht ausreichend. Erhöhen Sie das Waschvolumen und die Waschzeiten während der Peptidentsalzung. | ||||
| Peptid-Assay niedriges Signal | 7 | Resuspendieren Sie Peptidproben in geringerem Volumen, um die Peptidkonzentration zu erhöhen. | ||||
| Überwältigende Streptavidin-Signale bei LC-MS | 8 | Reduzieren Sie die Menge an Streptavidin-Perlen. Wenn der Trypsin-Peak ebenfalls reichlich vorhanden ist, reduzieren Sie die Trypsinmenge. | ||||
| Zu viele unspezifische Kennzeichnungshintergründe | 9 | Streptavidin Perlen waschen war nicht ausreichend. Entfernen Sie bei jedem Waschschritt alle Restflüssigkeiten. Erhöhen Sie die Zeit und das Volumen für das Waschen von Perlen. | ||||
Tabelle 2: Problembehandlung und Lösungen.
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Discussion
Mit dieser LAMP1-APEX-Sonde werden Proteine auf und in der Nähe der lysosomalen Membran biotinyliert und angereichert. Angesichts des typischen Lysosomendurchmessers von 100-1.200 nm bietet diese Methode eine hervorragende intrazelluläre Auflösung mit einem Markierungsradius von 10-20 nm. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer Marker für Lysosomen, der als hervorragendes Köderprotein für die lysosomale APEX-Markierung auf endogener Expressionsebene dient. Einschränkungen bestehen jedoch auch bei der Verwendung von LAMP1 zum Targeting von Lysosomen, da LAMP1 auch in späten Endosomen und nicht abbauenden Lysosomenvorhanden ist 35. Die meisten lysosomalen Marker werden auch in späten Endosomen exprimiert, die schließlich zu Lysosomen reifen. Alternative Köderproteine gegen Lysosomen sind LAMPTOR, LAMP2 und TMEM19235,36,37. Es ist wichtig zu beachten, dass reaktive Biotinradikale die Membran nicht durchdringen. Daher werden die meisten lysosomalen Lumen-only-Proteine in dieser LAMP1-APEX-Proteomik-Methode nicht erfasst. Lysosomale Lumenproteine können durch lysosomale Isolierung mittels der traditionellen Gradientenzentrifugationsmethode oder lysosomalen Immunreinigung erhalten werden 4,38. Proteine auf der lysosomalen Membran können jedoch während der lysosomalen Isolierung gestört werden und die Informationen für transiente und dynamische lysosomale Wechselwirkungen verlieren. Daher können lysosomale Proximity-Markierung und lysosomale Isolierung kombiniert werden, um eine vollständige Momentaufnahme der lysosomalen Aktivitäten sowohl außerhalb als auch innerhalb von Lysosomen zu erhalten.
Um die Variabilität der iPSC-Neuronenkultur zu minimieren, muss die Neuronenplattierungsdichte über alle biologischen Replikate und Vergleichsgruppen hinweg konsistent sein. Das gleiche Maß an neuronaler Reifung und Gesundheit ist aus diesem Grund ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Während der APEX-Aktivierung muss die Zugabe von Biotinphenol undH2O2zu den Zellen erfolgen, indem zuvor mit warmem Kulturmedium gemischt und dann die Mischung zu den Zellen gegeben wird, gefolgt von sofortigem, sanftem Schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Die Verwendung vonH2O2wirft auch Bedenken hinsichtlich oxidativen Stresses und Störungen in der dynamischen Mikroumgebung der Zelle auf. Obwohl keine signifikanten Veränderungen auf der Proteinhäufigkeitsebene gefunden wurden, wurden mehr Peptide durch Methioninoxidation in den H2O2-behandelten versus Kontrollneuronenmodifiziert 22. Daher ist eine strenge Kontrolle derH2O2-Aktivierungszeit (1 min) entscheidend, um oxidativen Stress zu minimieren und die Diffusion der Biotinwolke zu reduzieren, um einen spezifischen Markierungsradius um das Köderprotein herum zu gewährleisten.
Für nicht-polarisierte Zelllinien wie HEK und U2OS können Zellen durch Pelletierung nach Proximity-Markierung geerntet werden, um den Überstand mit freiem Biotin zu entfernen. Neuronen müssen jedoch geerntet werden, indem der Platte direkt Zelllysepuffer hinzugefügt und in Röhrchen geschabt wird, um Neuritenschäden und Probenverlust während der Pelletierung zu vermeiden. Das Vorhandensein von freiem Biotin kann die Streptavidin-Perlen sättigen. Die vollständige Entfernung von freiem Biotin kann durch mehrfaches Waschen und Inkubation mit Quenchpuffer in Neuronen und/oder Proteinfällung nach Zelllyse erreicht werden. Da verschiedene Köderproteine unterschiedliche Expressionsniveaus haben, muss für jede neue APEX-Sonde ein Dot-Blot-Assay durchgeführt werden. Sobald das optimale Verhältnis von Perlen und Proteinen bestimmt ist, sollte die Menge an Ausgangsprotein und Perlenvolumen für alle Replikate für dieselbe APEX-Sonde konsistent sein. Beim Vergleich verschiedener Sonden, wie LAMP1-APEX versus Cytosol-APEX, wird empfohlen, das gleiche Volumen an Perlen zu verwenden, aber die Menge des Ausgangsproteins zu variieren, um das optimale Beads/Protein-Verhältnis für verschiedene APEX-Sonden widerzuspiegeln. Um experimentelle Variationen weiter zu reduzieren und den Durchsatz zu erhöhen, kann eine stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) durchgeführt werden39. Multiplexierte isobare Markierung kann auch verwendet werden, um Peptide nach Proteinverdauung über TMT/iTRAQ/DiLeu-Tags 20,40,41,42 chemisch zu markieren.
Die Proximity-Markierung wurde häufig angewendet, um die zelluläre und molekulare Mikroumgebung in verschiedenen Organismen zu erfassen43. Die Proximity-Markierung steht jedoch noch vor vielen technischen Herausforderungen, wie der Kontamination durch Streptavidinsignale, der Verwendung von Wasserstoffperoxid zur Enzymaktivierung und dem Vorhandensein endogen biotinylierter mitochondrialer Carboxylasen. Daher erfordern Proximity-Labeling-Proteom-Experimente eine sorgfältige Planung und Qualitätskontrolle. Um Forschern bei der Problembehandlung ihres Proximity-Labeling-Experiments zu helfen, bieten wir in Tabelle 2 eine kurze Anleitung für häufige Probleme und Lösungen. Zuletzt wurde eine spaltbare Proximity-Markierungsmethode unter Verwendung von Thiol-spaltbarem Biotin25 entwickelt. Biotinylierte Proteine können daher mit einem reduzierenden Reagenz wie TCEP von Perlen abgespalten werden, ohne dass eine Aufperlenverdauung erforderlich ist. Diese spaltbare Biotinmethode kann Interferenzsignale von Streptavidin, endogen biotinylierten Carboxylasen und unspezifischer Bindung drastisch reduzieren. Laufende Bemühungen werden diese spaltbare Biotinmethode auf die LAMP1-APEX-Proteomik anwenden, um die Markierungsspezifität und -genauigkeit zu verbessern. Proximity-Markierungssonden können auch so ausgelegt sein, dass sie auf andere subzelluläre Kompartimente abzielen44. Die Menge und Art der identifizierten Proteine hängt von der Art des Köderproteins, seiner intrazellulären Umgebung und dem Expressionsgrad der Proximity-Markierungssonde ab. Diese endogene LAMP1-APEX-Proteomik-Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um die dynamische lysosomale Aktivität in menschlichen Neuronen zu untersuchen. Die detaillierte Protokoll- und Methodenoptimierung ist auch auf andere Proximity-Markierungssonden und die chemische Biotinylierung anwendbar und dienen als nützliche Ressource für die Proteomik-Community.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wird durch den NIH-Zuschuss (R01NS121608) unterstützt. A.M.F. dankt dem ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship und dem Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Wir danken dem Michael Ward Labor am National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) für die molekularbiologische Unterstützung und die Entwicklung der i3Neuron-Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
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