Summary
ここでは、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける動的リソソーム微小環境を特徴付けるために、ニューロンリソソーム近接標識プロテオミクスプロトコルについて説明します。リソソーム膜タンパク質およびリソソームと相互作用するタンパク質(安定または一過性)は、生きたヒトニューロンにおいて優れた細胞内空間分解能でこの方法では正確に定量することができる。
Abstract
リソソームは、さまざまな生体分子と頻繁に通信して、分解やその他の多様な細胞機能を実現します。ニューロンは有糸分裂後であり、細胞の恒常性を維持するためにオートファジー-リソソーム経路に大きく依存しているため、リソソームは人間の脳機能にとって重要です。さまざまなリソソーム機能の理解が進んでいるにもかかわらず、リソソームと他の細胞成分との間の非常に動的なコミュニケーションをキャプチャすることは、特にハイスループットの方法で技術的に困難です。ここでは、最近発表されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンにおける内因性(ノックイン)リソソーム近接標識プロテオミクス法の詳細なプロトコルを提供します。
ライソソーム膜タンパク質と半径10〜20 nm以内のリソソーム周囲のタンパク質の両方を、生きたヒトニューロンで確実に同定し、正確に定量することができます。プロトコルの各ステップ、すなわち、hiPSCニューロン培養、近接標識、ニューロン収穫、蛍光顕微鏡、ビオチン化タンパク質濃縮、タンパク質消化、LC-MS分析、およびデータ分析が詳細に説明されています。要約すると、このユニークな内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、生きたヒトニューロンにおける非常に動的なリソソーム活性を研究するためのハイスループットで堅牢な分析ツールを提供します。
Introduction
リソソームは、リソソーム-オートファジー経路1を介して高分子を分解する異化細胞小器官です。分解に加えて、リソソームはシグナル伝達、栄養感知、分泌などの多様な細胞機能に関与しています2,3,4。リソソーム機能の摂動は、リソソーム蓄積障害、癌、老化、および神経変性に関与しています3,5,6,7。有糸分裂後および高度に分極したニューロンの場合、リソソームは、ニューロン細胞の恒常性、神経伝達物質の放出、および軸索に沿った長距離輸送において重要な役割を果たします8、9、10、11。しかし、ヒトのニューロンのリソソームを調べることは困難な作業でした。人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン技術の最近の進歩により、以前はアクセスできなかった生きたヒトニューロンの培養が可能になり、動物モデルとヒト患者の間のギャップを埋めてヒト脳を研究するようになりました12,13。特に、高度なi3Neuron技術は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下で神経ゲニン-2転写因子をiPS細胞ゲノムに安定的に組み込み、iPS細胞を2週間で純粋な皮質ニューロンに分化させる14,15。
非常に動的なリソソーム活性のため、他の細胞成分とのリソソーム相互作用を捕捉することは、特にハイスループット方式で技術的に困難です。近接標識技術は、並外れた空間特異性で安定したタンパク質相互作用と一過性/弱いタンパク質相互作用の両方を捕捉できるため、これらの動的相互作用の研究に適しています16,17。操作されたペルオキシダーゼまたはビオチンリガーゼは、ベイトタンパク質に遺伝的に融合することができる。活性化されると、反応性の高いビオチンラジカルが生成され、隣接するタンパク質に共有結合で標識され、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォームを介して下流のボトムアッププロテオミクス用のストレプトアビジンコーティングビーズによって濃縮されます17、18、19、20、21。
内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、i3Neurons22の動的リソソーム微小環境を捕捉するために最近開発されました。操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)は、iPS細胞のリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)のC末端にノックインされ、皮質ニューロンに分化することができます。LAMP1は、豊富なリソソーム膜タンパク質であり、古典的なリソソームマーカー23である。LAMP1は後期エンドソームでも発現し、リソソームに成熟します。これらの後期エンドソームリソソームおよび非分解性リソソームは、すべてこのプロトコルではリソソームと呼ばれる。この内因性LAMP1-APEXプローブは、生理学的レベルで発現し、LAMP1の誤局在および過剰発現アーティファクトを低減することができる。数百のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用物質を、生きたヒトニューロンにおいて優れた空間分解能で同定および定量することができます。
ここでは、ヒトiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスのための詳細なプロトコルを、最近公開された方法22からのさらなる改良を加えて説明する。全体的なワークフローを 図 1 に示します。このプロトコルには、hiPSc由来のニューロン培養、ニューロンにおける近接標識活性化、蛍光顕微鏡によるAPEX活性の検証、最適なストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定、ビオチン化タンパク質の濃縮、ビーズ上のタンパク質消化、ペプチドの脱塩と定量、LC-MS分析、およびプロテオミクスデータ分析が含まれます。トラブルシューティングのガイドラインと実験的な最適化についても説明し、近接ラベリングの品質管理とパフォーマンスを向上させます。
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Protocol
すべての手順は、ジョージワシントン大学のバイオセーフティおよび倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用される媒体およびバッファーの組成を 表1に示します。ここで使用している商用製品情報は、 材料表に記載されています。
1. ヒトiPS細胞由来ニューロン培養
- ヒトiPS細胞培養とLAMP1-APEXプローブ統合(7日間)
- マトリゲルストック溶液をアイスバケットで4°Cで一晩解凍し、500 μLの溶液を冷たい滅菌チューブに分注し、アリコートを-80°Cで保存します。 500 μLのマトリゲルストックを49.5 mLの冷たいDMEM/F12培地に加え、50 mLのコーティング溶液を調製します。
注意: マトリゲルを冷たく保ち、重合を防ぐために予冷した円錐形のチューブとピペットチップを使用してください。コーティング溶液は4°Cで2週間保存できます。 - 10 cmの細胞培養皿に4 mLのコーティング溶液を37°Cのインキュベーターで1時間コーティングします。
注:ビトロネクチンは、iPS細胞培養用の5 μg/mL濃度および2時間のコーティングの代替コーティング溶液です。ビトロネクチン(単一タンパク質成分)はマトリゲルよりも高価ですが、多数の細胞外マトリックスタンパク質を持つマウス腫瘍から抽出されるマトリゲルよりもバッチの変動が少なく、バックグラウンドシグナルがクリーンです。ビトロネクチンコーティングには未処理の組織培養プレートが必要です。マトリゲルコーティングは、処理された組織培養プレートと未処理の組織培養プレートの両方で機能します。 - ROCK阻害剤を添加した8 mLのエッセンシャルE8完全培地(最終濃度10 μM Y-27632または50 nM Chroman1)をプリロードした各コーティングされた10 cmディッシュに1〜300万個のhiPS細胞を解凍してプレートします。
注:ROCK阻害剤(Y-27632またはChroman1)を幹細胞培養培地に添加すると、分裂および極低温保存後の解離誘発性アポトーシスが最小限に抑えられます。Chroman1は最近、Y-27632よりもROCK1とROCK2の両方を阻害する強力であることが示されています24。 - iPS細胞がコロニーを形成した後、通常は1〜2日後に、ROCK阻害剤を含まない10mLのE8完全培地に変更します。iPS細胞培養液をE8完全培地に維持し、上清を1日おきに新鮮な培地に交換します。
- 近接標識酵素である操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)を、CRISPRゲノムエンジニアリングによって内因性 LAMP1 遺伝子のC末端に組み込みます。操作された安定細胞株を生成するための詳細な手順については、以前に公開された方法(Frankenfieldら)を参照してください。22.
- マトリゲルストック溶液をアイスバケットで4°Cで一晩解凍し、500 μLの溶液を冷たい滅菌チューブに分注し、アリコートを-80°Cで保存します。 500 μLのマトリゲルストックを49.5 mLの冷たいDMEM/F12培地に加え、50 mLのコーティング溶液を調製します。
- ヒトiPS細胞-ニューロン分化(3日間)
- 分化前に10 cmの細胞培養皿に4 mLのマトリゲルコーティング溶液4 mLを37°Cのインキュベーターで一晩コーティングします。
- ~70%のコンフルエントになるまでhiPS細胞を維持します。hiPS細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回穏やかに洗浄し、死細胞を除去します。PBSを吸引し、10 cmの細胞皿に3 mLのアキュターゼを加えます。プレートを振って均一に分配し、37°Cのインキュベーターで8分間インキュベートします。
- 2 mLのPBSを加えて細胞を洗浄し、プレートから持ち上げ、15 mLのコニカルチューブにすべての細胞溶液を回収します。300 × g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。プレート2-4×10個の6 hiPS細胞を、8 mLの温かいニューロン誘導培地をプリロードしたマトリゲルコーティングプレート上に配置します(表1)。細胞を均等に分配し、37°Cのインキュベーターに入れます。
注:ニューロンの分化は、この安定したhiPS細胞株15で過剰発現したドキシサイクリン誘導性転写因子であるニューロゲニン-2(NGN2)によって駆動されます。 - 分化1日目にhiPS細胞をPBSでやさしく洗浄し、死細胞の破片を取り除きます。ROCK阻害剤を含まない10mLの温かい誘導培地と交換してください。
- 分化3日目まで毎日ROCK阻害剤を含まない温かい誘導培地で交換する。
注:ニューロンは、ニューロン媒体に再メッキする準備ができています。
- ニューロンのプレーティングとニューロン培養の維持(10日間)
- ホウ酸塩バッファー中で0.1 mg/mLのポリ-L-オルニチン(PLO)コーティング溶液を調製します(表1)。
- 細胞培養皿にPLOコーティング溶液を37°Cのインキュベーター内で少なくとも1時間または一晩コーティングし、3日目のニューロンをプレーティングする前に一晩コーティングします。皿を4mLの滅菌水で3回洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で完全に風乾させます。
- 3 mLのアキュターゼと8〜1,000万個の細胞を各10 cmのPLOコーティング皿から3日目のニューロンを解離し、温かい皮質ニューロン培地をプリロードした各10 cmPLOコーティング皿にプレートします(表1)。
- i 3ニューロンが分化後2週間で成熟に達するまで、温かいニューロン培地で2〜3日ごとに半培地交換を行います。
2. in situ 近接標識とニューロン溶解(2時間)
- ジメチルスルホキシド(DMSO)中の500 mMビオチン-フェノール(BP)ストック溶液を調製し、-20°Cで保存します。 近接標識の日に、BPストック溶液を温かいニューロン培地で希釈し、37°Cのインキュベーター内で30分間、終濃度500 μMのニューロンを処理します。
注:ドキシサイクリンがニューロン培地に添加され、APEX酵素発現が活性化されます。ドクスサイクリンは、近接標識実験の少なくとも24時間前に追加する必要があります。. - H 2 O2を終濃度1 mMでニューロン培養物に添加して標識反応を開始し、正確に1分間インキュベートします。直ちに培地を吸引し、クエンチバッファーで3回すすぐ(表1)。
注:H2 O2溶液は、標識反応の前に新鮮にする必要があります。H2O2の活性化は、実験の変動を減少させ、長期のH2O2処理によって引き起こされる酸化ストレスを最小化するために、正確に1分である必要がある。 - プレートを傾けて、すべての残留バッファーを吸引します。氷冷した細胞溶解バッファー(表1)をニューロンプレートに直接加えます。100万ニューロンあたり100 μLの細胞溶解バッファーを使用してください。十分な細胞溶解のためにプレートを旋回させ、氷の上に置きます。
- 細胞ライセートを冷たい1.5 mLチューブにこすり落とします。バス超音波処理器(>100 W)を使用して氷冷水浴中で15分間、交互に40秒オン、20秒オフサイクルで超音波処理します。
注:十分に溶解したタンパク質溶液は、ペレットや過度の気泡がなく透明でなければなりません。細胞ライセートの十分な超音波処理は、核酸を剪断し、細胞ライセートの粘着性を低減して、下流の手順での非特異的結合を減少させるために重要です。プローブ超音波処理器を使用して、より強力で高速な細胞溶解を提供することもできますが、クロスコンタミネーションとサンプル損失を最小限に抑えるには、サンプル間でプローブを洗浄する必要があります。 - 冷アセトン(−20°C)を4倍容量の溶解バッファーでサンプルに加えます。短時間ボルテックスし、-20°Cで3時間インキュベートします。
- 16,500 × g で2°Cで10分間遠心分離します。 タンパク質ペレットを乱すことなく上清を除去する。ペレットを1 mLの-20°Cアセトン2xで洗浄し、遠心分離後に上清を除去します。
- タンパク質ペレットを真空濃縮器で1分間乾燥させます。細胞溶解バッファーを添加してペレットを完全に溶解します。必要に応じて簡単に超音波処理します。サンプルは-80°Cで保存してください。
注:アセトン沈殿は、サンプル中の残留ビオチン-フェノールを除去する可能性があり、ビオチン化タンパク質の下流濃縮を妨げる可能性があります。
3. APEXの局在と活性を検証するための蛍光顕微鏡(1.5日)
- 内因性LAMP1-APEXを発現するi3ニューロンを500 μM BPで37°Cで30分間インキュベートします。 1 mM H 2 O2処理でわずか1秒間標識を活性化し、ビオチン雲の拡散を制限します。
- クエンチバッファー中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を直ちに固定し、PBSで3回穏やかに洗浄します。
注意: 10 cmの皿の場合、十分な洗浄には4〜6 mLが必要です。 - PBS中の3%ロバ血清と0.1%サポニンを使用して、室温(RT)で30分間細胞をブロックして透過処理します。
- 細胞を一次抗LAMP1抗体(マウスモノクローナルH3A4、1:1,000)で4°Cで一晩インキュベートします。
- PBSでニューロンを3回穏やかに洗います。抗マウスAF561二次抗体(1:1,000)およびストレプトアビジン-680(1:1,000)でニューロンをRTで1時間インキュベートします。
- PBSで2回洗浄し、ヘキストまたは4',4-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)核マーカーとRTで10分間インキュベートします。 細胞をPBSで2回すすぎます。
- 固定されたニューロンを蛍光顕微鏡で可視化します。ストレプトアビジンで染色され、核外でLAMP1染色で共局在したビオチン化タンパク質を観察して、APEX活性の正しい位置を検証します。
4.ストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定(1.5日)
- 界面活性剤適合性タンパク質アッセイ(DCA)を実行して、細胞ライセート中の総タンパク質濃度を測定
- ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質標準物質を細胞溶解バッファーに4 mg/mLの濃度で溶解します。細胞溶解バッファーを使用して、一連のBSAタンパク質標準溶液(0.2-2 mg/mL、5希釈液)を調製します。
- 各タンパク質サンプル、BSAタンパク質標準溶液、およびブランク細胞溶解バッファーから5 μLを3連で96ウェルプレートの各ウェルに移します。
- 試薬A1 mLあたり2 μLの試薬Sを加えて、試薬A'を得ます。25 μLの試薬A'を各ウェルに加えます。200 μLの試薬Bを各ウェルに加えます。泡がある場合は混ぜてポップします。
- その96ウェルプレートをRTで15分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで750 nmの吸光度を読み取り、BSA標準曲線に基づいてタンパク質サンプルの濃度を定量します。
- ビーズ滴定ドットブロットアッセイ(1.5日)
- 一連のストレプトアビジン磁気ビーズスラリー(20 μL、15 μL、12 μL、10 μL、8 μL、4 μL、1 μL、0 μL)をPCRストリップチューブに移します。PCRストリップチューブを磁気ラックに置き、ビーズを100 μLの2%SDSバッファーで3回洗浄し、磁気ラックで洗浄バッファーを完全に取り外します。
- 各チューブに50 μgのタンパク質サンプルを追加します。溶解バッファーを追加して総容量 80 μL にします。 各チューブをしっかりと閉じ、4°Cで一晩回転させます。
- PCRストリップチューブをベンチトップマイクロ遠心分離機で短時間遠心分離します。PCRストリップチューブを磁気ラックに1分間置きます。各チューブの上清2 μLを乾燥したニトロセルロースメンブレンにスポットし、メンブレンを完全に乾燥させます。
注:信号強度が低い場合は、2 μL以上がメンブレン上にスポットされる可能性があります。体積は、膜を毎回風乾した後、同じ場所に数回点光することによって増加させることができる。バイオドット装置も使用できます。 - メンブレンをブロッキングバッファー(TBS)中で1時間インキュベートします。メンブレンをストレプトアビジンAlexa Fluor 680コンジュゲート(ブロッキングバッファー中で1:1,000)で1時間インキュベートします。その後、膜をTBS-T(表1)5倍で洗浄した。
注:ドットブロットアッセイの代替法は、ストレプトアビジン抗体を用いたウェスタンブロッティングです。 - 波長680 nmのメンブレン上の各ドットの蛍光シグナルを測定し、ビーズの体積にわたって蛍光シグナルを含む散布図を生成します。50 μgの入力タンパク質サンプルに必要なビーズの最適量を、曲線の指数関数的減衰がどこで終わるかに基づいて選択します。
注:蛍光強度は、上清中のビオチン化タンパク質の存在量を表し、ビーズの量が増えるにつれて減少するはずです。
5.ビオチン化タンパク質の濃縮とビーズ上の消化(3日間)
- タンパク質溶解物サンプルを-80°Cから移し、バス超音波処理器で30秒間1.5mLチューブでサンプルを超音波処理し、溶液を素早く解凍します。渦巻き、サンプルチューブを氷の上に置きます。
- 250 μLのストレプトアビジン(SA)磁気ビーズスラリーを各1.5 mLチューブに移します。チューブを磁気ラックに置き、1 mLの洗浄バッファーA(2% SDS)でビーズを3回洗浄し、残留バッファーを除去します。
- ドットブロットアッセイとDCタンパク質アッセイの結果に基づいて、250 μLのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーに必要なタンパク質サンプルの量(μg)を計算します。
注:この内因的に発現するLAMP1-APEXプローブでは、50 μgの入力タンパク質に対して5 μLのビーズが必要です。したがって、2.5 mgの総タンパク質が250 μLのビーズに添加されます。250 μL未満のSAビーズは、限られた投入サンプル材料に使用できます。 - 磁気ビーズ-ライセート混合物を含むチューブに細胞溶解バッファーを全容量1 mLまで加え、4°Cで一晩回転させます。
注:異なるグループまたは反復からのサンプルは、実験の変動を減らすために、同じタンパク質濃度、体積、およびビーズの量に正規化する必要があります。 - ベンチトップのマイクロ遠心分離機ですべてのチューブを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。磁気ラックの上にいる間に上澄み液を取り除きます。
注意: 毎回、サンプルチューブを磁気ラックに置いた後、1分間待つことが重要です。これにより、目に見えない少量のビーズがまだ溶液中の磁石に向かって移動することによるビーズ損失を最小限に抑えることができます。 - ビーズを1 mLの洗浄バッファーAでRTで2回洗浄します(毎回5分間回転)。各洗浄バッファーを用いて4°Cで順次2回このプロセスを繰り返します。 (バッファB、バッファC、およびバッファD; 表 1)。
注意: 高濃度のSDS溶液は、低温で沈殿する可能性があります。最初の洗浄はRTで実行する必要があります。 - チューブを磁気ラックに置きます。ビーズをバッファーDで2回洗浄して、残留洗剤を完全に取り除きます。ビーズを100 μLの50 mM Trisバッファーに再懸濁し、5 mM TCEP(最終濃度)を加えて、温度制御ミキサーで37°C、1,200 rpmで振とうしながら30分間インキュベートします。
- 各チューブに15 mMヨードアセトアミド(IAA、最終濃度)を加え、温度制御ミキサーで37°Cで30分間インキュベートし、暗所で1,200 rpmで振とうします(ミキサーキャップをオンにします)。
注意: IAAは光に敏感であり、この手順の5分前に新鮮にする必要があります。 - 5 mM TCEP(最終濃度)を添加して、過剰なIAAを消光します。温度制御されたミキサーで37°Cで10分間インキュベートし、1,200 rpmで振とうします(ミキサーキャップを外します)。
- サンプルチューブを短時間遠心分離し、磁気ラックに1分間置き、上清を除去します。50 mM Trisバッファーに200 μLの5 mM TCEPを加え、ビーズを再懸濁します。1 μgのトリプシン/Lys-Cミックスをサンプルに加え、温度制御されたミキサーで37°Cで1,200 rpmで振とうしながら14時間インキュベートします。
- さらに0.2 μgのトリプシン/Lys-Cミックスを加え、3時間消化します。
- サンプルチューブを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。ペプチド上清を移して、磁気ラック上でチューブを洗浄します。ビーズを50 μLの50 mM Trisバッファー(5分間振とう)で洗浄し、ペプチド上清を混ぜ合わせます。
- ペプチド上清を含むチューブに30 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、pH <3を取得します。
6. ペプチド脱塩および分画(2時間)
- 逆相固相抽出プレート(使用するウェルのみ)を200 μLのHPLCグレードメタノール(MeOH)で3倍に溶かします。HPLCグレードの水に200 μLの1%TFAを3回添加して、プレートを平衡化します。
- ペプチドサンプルをプレートにロードし、3液滴/秒未満の流速でゆっくりと真空をオンにして、サンプルの損失を最小限に抑えます。
- 抽出プレートを200 μLの1%TFAで3回洗浄します。抽出プレートを、2%MeOH(v/v)を含む1%TFA200 μLで再度洗浄します。流速を3液滴/秒未満に保ちます。
- 収集プレートを96ウェル収集プレートと交換します。分画が不要な場合は、80%のMeOHを含む1%TFAの100 μLでペプチドサンプルを3回溶出し、新しいサンプルチューブで結合します。ペプチドサンプルを真空濃縮器で熱なしで乾燥させます。
注:分画が必要な場合は、ペプチドサンプルを4つの画分に溶出し、その後、異なる収集プレートでそれぞれ15%、35%、50%、および90%のMeOHを含む1%TFAの200 μLを使用します。
7.比色ペプチド定量アッセイ(オプション)(1時間)
- ペプチドサンプルを50 μLのLC-MSグレードの水に再懸濁し、20 μLのアリコートを取り、ペプチドアッセイを実行します。
注:このステップは大量のペプチドサンプルを消費しますが、LC-MS分析の前にペプチド濃度を正確に定量することができます。これは通常、大規模なサンプル調製の前にテストするために、サンプルタイプごとに1回だけ実施されます。 - ペプチド標準溶液(比色アッセイキットに付属)の連続希釈液をLC-MSグレードの水で調製します。50%試薬A、48%試薬B、および2%試薬Cを混合して、作業試薬を準備します。
- 各ペプチド標準液(3回反復)と未知のペプチドサンプル20 μLを96ウェルマイクロプレートに移します。180 μLの作業試薬を各ウェルに加え、よく混合し、プレートをRTで30分間インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーで480 nmの吸光度を読み取り、ペプチド標準曲線に基づいてペプチドサンプルの濃度を定量します。
8. LC-MS分析
- ペプチドサンプルをLCバッファーA(2%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸、LC-MSグレード)に再懸濁します。16,500 × g で4°Cで10分間遠心分離し、粒子を取り除きます。
- 上清をLC-MSバイアルに移します。ナノLC-MS装置を使用してサンプルを分析します。
注:詳細なLC-MS/MSパラメータは機器に依存し、以前に説明されています22、25、26。 - ストレプトアビジンやトリプシンなどの非常に豊富な夾雑ペプチドピークの保持時間の範囲を含むカスタムLC-MS除外リストを5 ppmの質量精度で生成します22(たとえば、一般的なストレプトアビジンペプチドピークはm/z 402.5435 [電荷3]、m/z 603.3117 [電荷2]、m/z 654.9733 [電荷3]、m/z 678.6812 [電荷3]、 m/z 1017.5182 [電荷2]、 等。;一般的なトリプシンペプチドピークは、m/z 421.7584 [電荷2]、m/z 523.2855 [電荷2]、およびm/z 737.7062 [電荷3])です。
9. プロテオミクスデータ解析
- プロテオームディスカバラー、MaxQuant27、MS-Fragger28などのプロテオミクスデータ解析ソフトウェアを使用して、LC-MS生データを解析します。データ分析用に2つのFASTAライブラリを含める:1)スイスプロ トホモサピエンス 参照データベース。2)新たに生成されたユニバーサル汚染物質FASTAライブラリ(https://github.com/HaoGroup-ProtContLib)は、プロテオミクスの同定を改善し、誤った発見を減らすことが証明されました29。
- タンパク質およびペプチドスペクトルマッチング(PSM)同定のための1%偽発見率(FDR)カットオフでプロテオミクスデータ解析パラメータを設定します。最大3回の切断漏れ、システインカルバミドメチル化の固定修飾、およびメチオニン酸化とタンパク質N末端アセチル化の可変修飾を伴うトリプシン消化を選択します。ペプチドMS1ピーク強度を使用して、ラベルフリー定量を行います。ペプチド強度を内因的にビオチン化カルボキシラーゼ、プロピオニル−CoAカルボキシラーゼ(PCCA)に正規化して、近接標識変動を減少させることは、前述のように22。
注:PCCA正規化は、PCCAタンパク質配列FASTAファイルを含めることにより、プロテオームディスカバラーソフトウェアで選択できます。あるいは、PCCA正規化は、ダウンストリームデータ分析で実施することができる。 - プロテオミクスソフトウェアからタンパク質レベルの結果をエクスポートします。統計分析の前に汚染物質タンパク質を除去します 29.PSMが1つしかない、または定量結果が得られないタンパク質を除去します。Enrichr30 を使用してタンパク質遺伝子オントロジー (GO) ターム解析を実行し、STRING31 を使用してタンパク質ネットワーク解析を行います。
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Representative Results
このリソソーム近接標識プロテオミクス研究は、ヒトiPS細胞由来のニューロンで実施され、生きたニューロンの動的なリソソーム微小環境 をin situ でキャプチャしました。異なる時点におけるhiPS細胞およびhiPSC由来ニューロンの細胞形態を 図2Aに示す。ヒトiPS細胞はE8培地中のコロニーで増殖する。分化は、iPS細胞をドキシサイクリン含有ニューロン誘導培地にプレーティングすることによって開始されます。神経突起の伸長は、3日間の分化中に毎日より目に見えるようになります。ニューロン媒体中でPLOコーティングプレートに切り替えた後、神経突起はニューロン間にネットワークを形成し、ニューロンが2週間で成熟するにつれて軸索伸長がより目に見えるようになります。i3ニューロンでは、APEXプローブの局在は、急速なAPEX活性化後の蛍光顕微鏡によって検証されます。ビオチン化タンパク質はストレプトアビジン(SA)抗体を用いて染色され、リソソームは抗LAMP1抗体を用いて染色される。マージされた画像は、ベイトタンパク質へのLAMP1-APEXの正しい局在を検証します(図2B)。
ビーズ滴定アッセイは、ストレプトアビジンビーズの量がすべてのビオチン化タンパク質を濃縮するのに十分であるが、LC-MSで深刻なストレプトアビジン汚染を引き起こすほど過剰にならないように、最適なビーズ対タンパク質比を決定するために重要です。50 μgのインプットタンパク質サンプルに必要なビーズの最適量は、曲線の指数関数的減衰がどこで終わるかに基づいて選択されます(図3A)図3Aに示すように、ビーズ-タンパク質インキュベーション上清からのドットブロットシグナルは、ストレプトアビジンビーズの量を増やすとより多くのビオチン化タンパク質が捕捉されるにつれて減少しました。内因性のLAMP1-APEXサンプルでは、50 μgのインプットタンパク質に対して5 μLのストレプトアビジンビーズが最適でした(図3Aで強調表示)。濃縮後、ストレプトアビジンビーズによって捕捉されたタンパク質の量は不明です。過剰なタンパク質分解酵素(トリプシン)は、LC-MSに豊富なトリプシンペプチドピークがあり、酵素の自己消化を増加させることができます。過剰なトリプシンはまた、サンプル中のより多くのストレプトアビジンペプチドを消化する可能性があります。したがって、ビーズ上の消化に必要なプロテアーゼの量を最適化する必要があります。トリプシン単独と比較して、トリプシン/Lys-Cミックスによるビーズ上での消化により、より多くのタンパク質とペプチドが同定され、切断漏れが少なくなりました(図3B)。さらに、ストレプトアビジン磁気ビーズ250 μLあたり1〜1.5 μgのプロテアーゼが、同定されたタンパク質の数が最も多く、切断漏れの割合が最も低いのに最適です(図3C)。最適なビーズとタンパク質の比率では、同じ量のビーズが同じ量のビオチン化タンパク質を捕捉するはずです。したがって、この最適化されたプロテアーゼ量は、同じストレプトアビジン磁気ビーズを使用してビオチン化タンパク質を濃縮するすべての実験に使用できます。
ペルオキシダーゼベースの近接標識酵素は、ビオチン-フェノールインキュベーションおよび短時間のH2O2処理(1分)によって活性化されます。このステップは、近接標識プロテオミクスにおける変動の主な原因です。我々は以前、最も豊富で内因的にビオチン化カルボキシラーゼであるPCCAへの正規化が実験の変動を大幅に減少させ、異なる実験バッチ間で近接標識プロテオミクスデータを比較できることを発見しました(図4)22。内因性のLAMP1-APEXニューロンについては、LAMP1-APEXプローブ発現のない親株を対照群として用いた。対照ニューロンはまた、ビオチンフェノールおよびH2O2で処理した。対照群に対するLAMP1-APEXのタンパク質比の分布を図5Aに示す。すべての内因性ビオチン化カルボキシラーゼは、ストレプトアビジン被覆ビーズによって濃縮されましたが、変化しませんでした。GO-term解析およびタンパク質ネットワーク解析(図5B、C)に示すように、安定なリソソーム膜タンパク質およびエンドリソソーム輸送および輸送に関連する一過性リソソーム相互作用物質の両方が、LAMP1-APEXプロテオミクスにおいて濃縮された32,33,34。
図1:hiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスの全体的なワークフロー。 略語:hiPSC =ヒト人工多能性幹細胞;LAMP1 = リソソーム関連膜タンパク質1;APEX = アスコルビン酸ペルオキシダーゼ;ドックス=ドキシサイクリン;BP =ビオチンフェノール;DCA = 界面活性剤適合性タンパク質アッセイ;SA =ストレプトアビジン;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析;PCCA=プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、内因性ビオチン化タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:iPS細胞由来のニューロンとLAMP1-APEX活性 の顕微鏡イメージング。 (A)iPS細胞およびhiPS細胞由来のニューロンの異なる段階の明視野顕微鏡画像。(B)ニューロンにおけるLAMP1-APEX活性の蛍光イメージング。ストレプトアビジンに対して染色されたビオチン化シグナルは、核外のLAMP1染色(HOECHST)と共局在します。スケールバー=(A)50μm、(B)1μm。略語:hiPSC =ヒト人工多能性幹細胞;LAMP1 = リソソーム関連膜タンパク質1;APEX = アスコルビン酸ペルオキシダーゼ;SA =ストレプトアビジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ビーズとインプットタンパク質の比率と酵素タンパク質消化の最適化により、タンパク質の同定を改善し、干渉を減らすことができます 。 (A)50 μgのインプットタンパク質と異なる量のストレプトアビジンビーズを使用したドットブロットアッセイのビーズ滴定アッセイ結果の例。(B)トリプシン/Lys-Cミックスは、トリプシン単独よりもタンパク質/ペプチドの同定が良く、切断漏れが少なかった。(C)ビーズ消化のためのトリプシン/Lys-Cの量の最適化。この図はフランケンフィールドら22から修正された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:近接標識プロテオミクスデータを内因性ビオチン化カルボキシラーゼ(PCCA)に正規化することで、生物学的反復間の定量的変動を減らすことができます。 この図はフランケンフィールドら22から修正された。略称:PCCA =プロピオニルCoAカルボキシラーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:リソソーム近接標識プロテオミクスは、ニューロン内のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用タンパク質を濃縮しました。 (A)濃縮されたリソソーム膜タンパク質と未変化の内因性ビオチン化タンパク質を示すLAMP1-APEX対照のタンパク質存在比の散布図。(B)リソソームの細胞成分が濃縮されていることを証明するプロテオミクス結果のGOターム解析。(C)タンパク質がベイトタンパク質(LAMP1)、リソソーム膜タンパク質、および膜輸送タンパク質などのリソソーム相互作用因子と直接相互作用することを示すSTRINGタンパク質ネットワーク解析。この図はフランケンフィールドら22から修正された。略語:LAMP1 =リソソーム関連膜タンパク質1;APEX = アスコルビン酸ペルオキシダーゼ;GO =遺伝子オントロジー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メディア/バッファ | コンポーネント | 議定書 | ||
| 基底膜マトリックス(マトリゲル)塗布液 | 1%基底膜マトリックスストック、99%DMEM/F12培地 | 1.1, 1.2 | ||
| ビトロネクチンコーティング液 | PBS中の最終濃度5 μg/mL | 1.1 | ||
| ROCK阻害剤を含むE8完全培地 | 98% E8 培地、2% E8 サプリメント、10 μM Y-27632 または 50 nM クロマン1 | 1.1 | ||
| ニューロン誘導培地 | HEPESを含む97%DMEM/F12、1%N2サプリメント、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%L-グルタミン、2 μg/mLドキシサイクリンおよびROCK阻害剤(10 μM Y-27632または5 nMクロマン1) | 1.2 | ||
| ニューロンPLOコーティングソリューション | 0.1 mg/mL ポリ-L-オルニチン(PLO)、100 mM ホウ酸、25 mM 四ホウ酸ナトリウム、75 mM 塩化ナトリウム、1 M 水酸化ナトリウム | 1.3 | ||
| ニューロン媒体 | 98%皮質ニューロン培地、2%B27サプリメント、10 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、10 ng/mLグリア由来神経栄養因子(GDNF)、10 ng/mL NT-3、0.2 μg/mLラミニン、2 μg/mLドキシサイクリン | 1.3 | ||
| クエンチバッファ | 10 mM アジ化ナトリウム、10 mM アスコルビン酸ナトリウム、5 mM トロロックス PBS | 2.2 | ||
| 細胞溶解バッファー | 50 mM トリス塩酸塩、500 mM NaCl、0.2% SDS、1% トリトン、1 mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、10 mM アジ化ナトリウム、10 mM アスコルビン酸ナトリウム、5 mM トロロックス、プロテアーゼ阻害剤カクテル | 2.3 | ||
| TBS-T | 0.05% トゥイーン20, 20 mM トリス, 150 mM NaCl (pH 7.5) | 4.2 | ||
| バッファ A | 2% SDS バッファー | 5.2 | ||
| バッファ B | 50 mM トリス塩酸塩、500 mM NaCl、2% トリトン-X | 5.6 | ||
| バッファ C | 50 mM トリス塩酸塩, 250 mM NaCl, 0.5% SDS, 0.5% トリトン-X | 5.6 | ||
| バッファ D | 2 M 尿素、50 mM トリス塩酸塩 | 5.6 | ||
表1:このプロトコルで使用されるメディアとバッファーの組成。
| 問題 | 議定書 | 解決策/提案 | ||||
| プレートを剥がすiPS細胞培養液 | 1.1 | ビトロネクチンコーティング濃度または時間を増やします。 | ||||
| 一部のiPS細胞はニューロンに分化しなかった | 1.2 | 細胞剥離溶液の処理時間を長くして、d0分化中にiPS細胞を完全に解離させます。 | ||||
| プレートを剥がすニューロン培養 | 1.3 | 媒体の洗浄と交換は穏やかで、プレートの側壁から行う必要があります。 | ||||
| タンパク質はアセトン沈殿後に完全に溶解しない | 2.7 | タンパク質ペレットの乾燥時間を短縮します。溶解バッファーの量を増やし、溶解を助けるために短時間超音波処理します。 | ||||
| 弱いストレプトアビジン染色シグナル | 3 | H 2 O 2処理時間を2〜3秒に増やし、プレートを回転させて均一に分配します。 | ||||
| ビーズ滴定アッセイの低シグナル | 4.2 | 膜が完全に乾くまで待ち、同じ場所に上清を追加して(最大3倍まで繰り返すことができます)、シグナル強度を高めます。 | ||||
| 磁気ラックに向かってペレット化しない磁気ビーズ | 5 | 磁気ビーズの移動度は、非界面活性剤含有バッファーでは低下します。洗浄バッファーDでは、最大4 Mの高濃度尿素またはLC-MS対応の界面活性剤を使用できます。 | ||||
| ビーズ洗浄時の磁気ビーズ損失 | 5 | サンプルチューブを磁気ビーズの上に置くときの待ち時間を増やします(1分以上)チューブから上清を取り出します。 | ||||
| LC-MSにおける単一荷電汚染ピーク | 6 | ペプチドのクリーンアップが不十分です。ペプチド脱塩中の洗浄量と時間を増やします。 | ||||
| ペプチドアッセイ低信号 | 7 | ペプチド濃度を上げるために、ペプチドサンプルを少量で再懸濁します。 | ||||
| LC-MSにおける圧倒的なストレプトアビジンシグナル | 8 | ストレプトアビジンビーズの量を減らします。トリプシンピークも豊富にある場合は、トリプシン量を減らす。 | ||||
| 非特異的な標識の背景が多すぎます | 9 | ストレプトアビジンビーズ洗浄は十分ではなかった。各洗浄ステップ中にすべての残留液を取り除きます。ビーズ洗浄の時間と量を増やします。 | ||||
表 2: トラブルシューティングの問題と解決策
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Discussion
このLAMP1-APEXプローブを使用して、リソソーム膜上および近傍のタンパク質をビオチン化し、濃縮します。典型的なリソソーム直径が100〜1,200 nmの場合、この方法は10〜20 nmの標識半径で優れた細胞内分解能を提供します。LAMP1は豊富なリソソーム膜タンパク質であり、ライソソームの古典的マーカーであり、内因性発現レベルでのリソソームAPEX標識のための優れたベイトタンパク質として機能します。しかしながら、LAMP1は後期エンドソームおよび非分解性リソソームにも存在するため、リソソームを標的とするためにLAMP1を使用する場合にも制限が存在する35。ほとんどのリソソームマーカーは後期エンドソームでも発現し、最終的にはリソソームに成熟します。リソソームを標的とする代替餌タンパク質は、LAMPTOR、LAMP2、およびTMEM19235,36,37である。反応性ビオチンラジカルは膜を貫通しないことに注意することが重要です。したがって、ほとんどのリソソームルーメンのみのタンパク質は、このLAMP1-APEXプロテオミクス法では捕捉されません。リソソーム内腔タンパク質は、従来の勾配遠心分離法またはリソソーム免疫精製法を介したリソソーム単離によって得ることができる4,38。しかし、リソソーム膜上のタンパク質は、リソソーム単離中に破壊され、一過性および動的なリソソーム相互作用の情報を失う可能性があります。したがって、リソソーム近接標識とリソソーム単離を組み合わせて、リソソームの外側と内側の両方でリソソーム活性の完全なスナップショットを得ることができます。
iPS細胞ニューロン培養によるばらつきを最小限に抑えるには、ニューロンのプレーティング密度がすべての生物学的複製および比較グループで一貫していなければなりません。このため、同じレベルのニューロンの成熟と健康も重要です。APEX活性化中、細胞へのビオチン-フェノールおよびH2O2の添加は、事前に温かい培養培地と混合し、次いで混合物を細胞に加え、その後、均一な分布を確実にするために即時かつ穏やかに振とうすることによって行わなければならない。H 2 O2の使用はまた、細胞の動的微小環境における酸化ストレスおよび摂動についての懸念を提起する。タンパク質存在量レベルで有意な変化は見られなかったが、より多くのペプチドがH2O2処理対対照ニューロン22においてメチオニン酸化で修飾された。したがって、H2O2活性化時間(1分)の厳密な制御は、酸化ストレスを最小限に抑え、ビオチン雲の拡散を低減して餌タンパク質を取り囲む特定の標識半径を確保するために重要である。
HEKやU2OSなどの非分極細胞株の場合、遊離ビオチンを含む上清を除去するために近接標識後にペレット化することにより、細胞を回収できます。ただし、ニューロンは、細胞溶解バッファーをプレートに直接添加し、チューブに掻き取ることによって収集し、ペレット化中の神経突起の損傷やサンプルの損失を回避する必要があります。遊離ビオチンの存在はストレプトアビジンビーズを飽和させる可能性があります。遊離ビオチンの完全な除去は、細胞溶解後にニューロンおよび/またはタンパク質沈殿中のクエンチバッファーによる複数回の洗浄およびインキュベーションによって達成できます。ベイトタンパク質が異なれば発現レベルも異なるため、新しいAPEXプローブごとにドットブロットアッセイを実施する必要があります。最適なビーズ/タンパク質比が決定されると、開始タンパク質の量とビーズの体積は、同じAPEXプローブのすべての反復で一定になります。LAMP1-APEXとサイトソール-APEXなど、異なるプローブを比較する場合は、同じ量のビーズを使用することをお勧めしますが、異なるAPEXプローブの最適なビーズ/タンパク質比を反映するために、開始タンパク質の量を変えることをお勧めします。実験のばらつきをさらに減らし、スループットを向上させるために、細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識(SILAC)を実施することができます39。多重鎖アイソバリック標識は、TMT/iTRAQ/DiLeuタグ20,40,41,42を介してタンパク質消化後にペプチドを化学的に標識するためにも使用できます。
近接標識は、様々な生物43における細胞および分子微小環境を捕捉するために広く適用されている。しかし、近接標識は、ストレプトアビジンシグナルによる汚染、酵素活性化のための過酸化水素の使用、内因的にビオチン化されたミトコンドリアカルボキシラーゼの存在など、依然として多くの技術的課題に直面しています。したがって、近接標識プロテオミクス実験には慎重な計画と品質管理が必要です。研究者が近接ラベリング実験のトラブルシューティングを行うのに役立つように、 表2に一般的な問題と解決策の簡単なガイドを提供します。ごく最近、チオール切断性ビオチン25を用いた切断可能な近接標識法が開発された。したがって、ビオチン化タンパク質は、ビーズ上での消化を必要とせずに、TCEPなどの還元試薬を使用してビーズから切断することができます。この切断可能なビオチン法は、ストレプトアビジン、内因性ビオチン化カルボキシラーゼ、および非特異的結合からの干渉シグナルを劇的に低減することができます。この切断可能なビオチン法をLAMP1-APEXプロテオミクスに適用し、標識特異性と精度を向上させるための継続的な取り組みが進められています。近接標識プローブは、他の細胞内区画44を標的とするように設計することもできる。同定されたタンパク質の量および種類は、ベイトタンパク質の性質、その細胞内環境、および近接標識プローブの発現レベルに依存する。この内因性LAMP1-APEXプロテオミクス法は、ヒトニューロンにおける動的リソソーム活性を研究するための貴重なツールを提供します。詳細なプロトコルと方法論の最適化は、他の近接標識プローブや化学ビオチン化にも適用でき、プロテオミクスコミュニティにとって有用なリソースとして機能します。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金(R01NS121608)によってサポートされています。AMFは、ARCS-メトロワシントン支部奨学金とバーボンF.スクリブナー基金フェローシップを認めています。国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)のマイケル・ウォード研究室の分子生物学支援とi3ニューロン技術開発に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
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