Summary
الحصول على التعقيم ضروري لزراعة أنسجة القصبة الهوائية. هنا ، نقدم بروتوكول تعقيم باستخدام جرعة منخفضة من أشعة جاما التي تتحملها الأعضاء بالكامل.
Abstract
أحد الجوانب الرئيسية في ضمان تطور عملية الزرع بشكل صحيح هو عقم الوسط. يتضمن زرع القصبة الهوائية منزوع الخلايا زرع عضو كان في الأصل على اتصال بالبيئة ، وبالتالي لم يكن عقيما منذ البداية. في حين أن بروتوكول إزالة الخلايا (من خلال عرض المنظفات [2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم] ، والتحريك المستمر ، والصدمات التناضحية) يتم إجراؤه بما يتماشى مع التدابير المعقمة ، فإنه لا يوفر التعقيم. لذلك ، فإن أحد التحديات الرئيسية هو ضمان العقم قبل زرع الجسم الحي . على الرغم من وجود بروتوكولات تعقيم بأشعة غاما للمواد غير العضوية ، لا توجد مثل هذه التدابير للمواد العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تطبيق البروتوكولات المعمول بها للمواد غير العضوية على المواد العضوية ، لأن جرعة الإشعاع المحددة (25 كيلو جراي) ستدمر الغرسة تماما. تدرس هذه الورقة تأثير جرعة الإشعاع المتصاعدة في القصبة الهوائية للأرانب منزوعة الخلايا. حافظنا على نطاق الجرعة (kGy) واختبرنا الجرعات المتصاعدة حتى العثور على الحد الأدنى من الجرعة التي يتم عندها التعقيم. بعد تحديد الجرعة ، درسنا آثارها على العضو ، نسيجيا وميكانيكيا حيويا. قررنا أنه في حين أن 0.5 كيلو جراي لم تحقق العقم ، فإن جرعات كل من 1 كيلو جراي و 2 كيلو جراي ، مع 1 كيلو جراي ، وبالتالي ، فهي الحد الأدنى للجرعة اللازمة لتحقيق التعقيم. أظهرت الدراسات المجهرية عدم وجود تغييرات ذات صلة مقارنة بالأعضاء غير المعقمة. لم يتم تغيير الخصائص الميكانيكية الحيوية المحورية على الإطلاق ، ولم يلاحظ سوى انخفاض طفيف في القوة لكل وحدة طول يمكن للعضو تحملها شعاعيا. لذلك يمكننا أن نستنتج أن 1 kGy يحقق التعقيم الكامل للقصبة الهوائية للأرانب decellarized مع الحد الأدنى من الآثار ، إن وجدت ، على العضو.
Introduction
تعقيم الغرسة هو شرط أساسي لصلاحيتها. في الواقع ، الأطراف الاصطناعية التي أثبتت نجاحها هي تلك المزروعة في المناطق المعقمة (الأوعية الدموية والقلب والعظام وما إلى ذلك) 1. القصبة الهوائية لها سطحان: سطح ملامس للبيئة الخارجية ، وبالتالي فهو غير معقم ، وسطح باتجاه المنصف ، وهو معقم. لذلك ، من لحظة استخراج القصبة الهوائية ، فهي ليست عضوا معقما. على الرغم من أن عملية إزالة الخلايا اللاحقة تتم في ظروف معقمة قصوى ، إلا أنها ليست خطوة تعقيم2. ينطوي زرع المواد الغريبة في حد ذاته على خطر الإصابة بالعدوى بسبب البيئة المكروية البكتيرية التي تنتجها3وخطر يصل إلى 0.014٪ لانتقال المرض من المتبرع إلى المتلقي ، حتى لو تم تعقيم المادة4. لضمان الأوعية الدموية الصحيحة للقصبة الهوائية ، في جميع بروتوكولات الزرع التجريبية تقريبا ، تخضع أولا لزرع غير متجانس5،6،7 إلى منطقة معقمة (العضلات ، اللفافة ، الثرب ، تحت الجلد ، إلخ) ؛ وذلك لأن زرع عنصر غير معقم في هذا الوسط من شأنه أن يؤدي إلى إصابة المنطقة3.
هناك مجموعة من الاستراتيجيات الممكنة للحصول على غرسة معقمة. باستخدام CO2فوق الحرج حقق التعقيم النهائي 8,9. حصلت طرق أخرى ، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو العلاج بمواد مثل حمض البيراسيتيك والإيثانول وبيروكسيد الأكسجين والماء المحلل كهربائيا ، على معدلات نجاح مختلفة في التعقيم ، دائما تقريبا اعتمادا على جرعاتها ، ولكن ثبت أنها تؤثر على الخصائص الميكانيكية الحيوية للزرع. في الواقع ، يمكن لبعض المواد ، مثل أكسيد الإيثيلين ، أن تغير بشكل كبير بنية المصفوفة المزروعة ويمكن أن تسبب تأثيرات مناعية غير مرغوب فيها. لهذا السبب ، لا يمكن تطبيق العديد من هذه الاستراتيجيات على النماذج البيولوجية2،10،11،12،13.
استراتيجية التعقيم الأكثر دراسة وقبولا على نطاق واسع هي تلك التي وضعها معيار ISO 11737-1: 2006 لتعقيم الأجهزة الطبية المزروعة في البشر ، بجرعة إشعاع جاما تبلغ 25 كيلو جراي. ومع ذلك ، تركز هذه اللائحة فقط على تعقيم العناصر الخاملة وغير البيولوجية14,15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جرعات العلاج الإشعاعي في العلاج الجذري للسرطان أقل بثلاث مرات من تلك المستخدمة لتعقيم الأجهزة الطبية1. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يمكننا أن نستنتج أن الجرعة المذكورة لن تقتل الجراثيم فحسب ، بل ستدمر أيضا البنية البيولوجية للزرع وتغير جذريا. هناك أيضا احتمال أن يولد الدهون المتبقية عند التحلل ، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا وتسريع التدهور الأنزيمي للسقالة 13،14،15،16،17 ، حتى عند استخدام جرعات منخفضة تصل إلى 1.9 كيلو جراي ومع ضرر يتناسب طرديا مع جرعة الإشعاع المتلقاة 17.
وبالتالي ، فإن الهدف من هذه الورقة هو محاولة تحديد جرعة الإشعاع التي تسمح بالحصول على غرسة معقمة مع الحد الأدنى من الآثار الضارة الناجمة عن التشعيع2،18،19. تضمنت الاستراتيجية التي اتبعناها تشعيع القصبة الهوائية منزوعة الخلايا والمشعة بجرعات متصاعدة مختلفة ضمن نطاق من الكيلوجراي (0.5 ، 1 ، 2 ، 3 كيلو جراي ، إلخ) ، حتى تحقيق ثقافة سلبية. تم إجراء اختبارات إضافية لتلك الجرعات التي حققت ثقافات سلبية ، من أجل تأكيد التعقيم. بعد تحديد الحد الأدنى للجرعة للحصول على التعقيم ، تم فحص التأثير الهيكلي والميكانيكي الحيوي للإشعاع على القصبة الهوائية. تمت مقارنة جميع المقاييس مع القصبة الهوائية للأرانب الأصلية الضابطة. ثم تم اختبار تعقيم البناء في الجسم الحي عن طريق زرع القصبة الهوائية في الأرانب البيضاء النيوزيلندية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الالتزام بالتوجيه الأوروبي 20170/63 / EU لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة فالنسيا (القانون 86/609 / EEC و 214/1997 والقانون 2018 / VSC / PEA / 0122 Type 2 لحكومة فالنسيا ، إسبانيا).
1. إزالة الخلايا من القصبة الهوائية
ملاحظة: تم الإبلاغ عن طريقة إزالة الخلايا في مكان آخر20.
- القتل الرحيم ذكر الأرانب البيضاء النيوزيلندية البالغة (Oryctolagus cuniculus) التي تزن 3.5-4.1 كجم مع 133 ملغم / كغم من الصوديوم البنتوباربيتال ، باستخدام حقن 200 ملغ / مل من خلال الوريد المحيطي للأذن.
- مع ضمان الظروف العقيمة ، قم بإجراء بضع عنق الرحم الطولي المركزي ، وتشريح عضلات عنق الرحم ، واقترب من القصبة الهوائية. تشريح العضو محيطيا وطوليا. أخيرا ، مقطع تحت الحلقة الأولى وفوق كارينا مباشرة.
- باستخدام مشرط ، قسم القصبة الهوائية إلى قطع 2 سم. باستخدام المقص ، قم بإزالة النسيج الضام المحيط وطبقة الغشاء المخاطي الداخلي6.
- اغمر العينات في 12 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 5٪ بنسلين ستربتومايسين و 5٪ أمفوتريسين ب.
- ضع القصبة الهوائية للتحريك المستمر باستخدام محرك مغناطيسي عند 400 دورة في الدقيقة لمدة 5 أسابيع في درجة حرارة الغرفة. استبدل محلول إزالة الخلايا أسبوعيا بعد صدمة تناضحية لمدة 2 ساعة ، عن طريق غمر القصبة الهوائية في الماء المقطر.
- قم بتبريد العينات باستخدام خليط 12 مل من 80٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية.
- عندما يتم استخدام القصبة الهوائية (بعد 13-15 يوما) ، قم بإذابتها في حمام مائي عند 37 درجة مئوية واغسلها عن طريق غمرها في برنامج تلفزيوني بعد اكتمال الذوبان.
2. التعقيم
- الاشعاع
- ضع دفعات من أربع قطع قصبة هوائية قياس 2 سم لكل منها في 20 مل من الميثاكريلات في دورق ثقافة T25 مملوء ب PBS حتى يتم الوصول إلى الحجم الإجمالي 30 مل. احرص على منع تكون الفقاعات ، مما قد يتسبب في انتشار الطاقة في واجهة الهواء والسائل.
- إجراء التشعيع باستخدام مسرع خطي ، مع فوتونات من الطاقة الاسمية من 10 MV تسطيح الحزم الحرة مرشح. تطبيق معدل جرعة قدره 2400 وحدة مراقبة في الدقيقة في مركز النظائر ، ووضع القصبة الهوائية على مسافة سطح المصدر 100 سم ليتم تشعيعها ، بعمق مجال 2.5 سم لمجال إشعاع 10 سم × 10 سم لتغطية الحاوية بأكملها المقابلة لجرعة 24 غراي / دقيقة.
- تصعيد الجرعات مع كل دفعة من أربع قطع ؛ ستخضع أربع قطع ل 0.5 كيلو جراي ، وأربعة إلى 1 كيلو جراي ، وأربعة إلى 2 كيلو جرام ، وما إلى ذلك ، حتى يتم الوصول إلى التعقيم.
- ثقافة
- أدخل القطع في 30 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ FBS معطل بدون مضادات حيوية أو مضادات الفطريات.
- استزراعهم في حاضنة الأنسجة القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة أسبوعين وافحصهم كل 24 ساعة.
ملاحظة: معلمات التلوث هي تغيرات في الرقم الهيدروجيني لوسط الاستزراع ، وبالتالي تغيرات في لون وعكارة الوسط. تم حصاد القصبة الهوائية من lagomorphs الخالية من الجراثيم ، والتي لم تكن مريضة ، وبالتالي ، من المتوقع أن تكون خالية من البكتيريا اللاهوائية في القصبة الهوائية.
3. التحليل النسيجي
ملاحظة: قم بتلطيخ القطع باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين21 ، ثلاثي الألوان ماسون ، وأورسين22.
- دابي تلطيخ
- تحديد صلاحية الأنسجة باستخدام DAPI (4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول). ترتبط هذه البقعة الفلورية الزرقاء بقوة بالمناطق الغنية بالأدينين والثايمين في تسلسل الحمض النووي ، وبالتالي تسمح بمشاهدة الحمض النووي عبر الفحص المجهري الفلوري.
- قم بتضمين عينات الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
- قطع العينات باستخدام cryostat.
- اغسل العينة المراد صبغها ثلاث مرات في الماء المقطر لإزالة OCT. ضعه في وسط تركيب يتضمن محلول 30 نانومتر من DAPI.
- تصور مضان باستخدام المجهر مضان.
- تحليل محتوى الحمض النووي
- قطع أجزاء من القصبة الهوائية يبلغ طولها حوالي 3 مم باستخدام مشرط.
- احتضان لمدة 2 ساعة في البروتيناز K (جدول المواد).
- استخراج الحمض النووي مع مجموعة استخراج الحمض النووي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- عن طريق القياس الطيفي ، حدد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاص عند 260/280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- قم بقياس حجم عينات الحمض النووي المستخرجة باستخدام كروماتوغرافيا الشعيرات الدموية باستخدام محلل حيوي.
4. دراسة الميكانيكا الحيوية
ملاحظة: يتم قياس مقاومة القصبة الهوائية للقوى الطولية والعرضية من خلال اختبارات الشد المحوري والضغط الشعاعي23.
- قياس القصبة الهوائية
- قم بقياس طول القصبة الهوائية وسمك الجدار والقطر الخارجي باستخدام فرجار Vernier.
- احسب متوسط القيم من ثلاثة قياسات عشوائية لكل متغير.
- في اختبارات الضغط الشعاعي ، احسب القطر الأمامي الخلفي عن طريق اكتشاف النقطة التي تتلامس عندها اللوحة مع العينة.
- إجراء جميع الاختبارات في درجة حرارة الغرفة.
- اختبارات الشد
- قم بإجراء اختبارات الشد على التحكم في إزاحة آلة اختبار سطح المكتب (UTM) ، ومجهزة بحمل 100 نيوتن (دقة قوة 0.1 نيوتن ، 0.001 مم من الموضع ، و 0.1 ثانية). تم تجهيز آلة الاختبار بأجهزة استشعار للقوة والموضع ، وهي متصلة بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج مصمم خصيصا من قبل الشركة المصنعة23.
- سجل البيانات كل 0.4 ثانية وقم بتصديرها إلى جدول بيانات.
- بناء فكوك شد تتكيف مع العيار المتوسط لقصبة الأرانب من أنابيب مجوفة من كلوريد البولي فينيل البلوري النقي غير السام (PVC) بقطر خارجي 1 سم وسمك جدار 1.5 مم.
- قسم التصرفات إلى شرائح بطول 3 سم.
- حفر 12 حفرة مسبقة التشكيل لخياطة المحطة النهائية ، 2 مم من حافة الفكين ومفصولة بمسافة 2.5 مم ، لمنع التحيز بسبب الغرز.
- قم بتوصيل الأنابيب الزجاجية البلاستيكية بالقصبة الهوائية للأرانب عن طريق مفاغرة طرفية مع خياطة مستمرة من خلال ثقوب بديلة مسبقة التشكيل (كل 5 مم) ، على بعد 2 مم من حافة القصبة الهوائية وبخياطة أحادية الشعيرات من النايلون 6-0.
- قم بتمديد جميع القطع بمعدل إزاحة يبلغ 5.0 مم / دقيقة.
- سجل أقصى إجهاد للمتغيرات (σ كحد أقصى ، في N / mm2) والإجهاد (εكحد أقصى ، بدون وحدات) ، جنبا إلى جنب مع الطاقة المخزنة لكل وحدة من حجم القصبة الهوائية (W / Vol ، في mJ / mm) ، ومعامل Young (E ، في MPa).
- اختبارات الضغط الشعاعي
- قم بإجراء اختبارات الضغط الشعاعي على UTM لسطح مكتب الضغط ، المجهز بخلية تحميل 15 نيوتن (دقة القوة 0.001 نيوتن ، الموضع 0.001 مم ، والوقت 0.1 ثانية) للحصول على بيانات القوة (N) ، والموضع (مم) ، والوقت (الأوقات). تسجيل البيانات وتصديرها إلى جدول بيانات على فترات 0.5 ثانية.
- ضع القصبة الهوائية مع وضع المنطقة الغشائية على اللوحة السفلية. ترتفع اللوحة تدريجيا نحو اللوحة العلوية بسرعة ثابتة تبلغ 5 مم / دقيقة.
- احسب كل وحدة لكل وحدة طول العينة (f في N / mm) ، والصلابة (R في Mpa · mm) ، والطاقة لكل وحدة من مساحة السطح (W / S في mJ / mm2) اللازمة لإغلاق القصبة الهوائية تماما.
5. التقنية الجراحية
ملاحظة: تم الإبلاغ عن التقنية الجراحية على نطاق واسع في مكان آخر20.
- ضع دعامة PVC معقمة داخل اللمعة ، بحجم 14 Fr (مما يسمح لها بالانزلاق بحرية دون ضغط الجدران) ، بهامش 3-4 مم في كل طرف.
- ثبت الدعامة بغرزة واحدة من النايلون 6-0 من خلال الفضاء بين الغضروف للغضروف الأول.
- المضي قدما في تخدير الأرانب.
- قبل علاج الأشخاص (3.65-4.05 كغ من ذكور الأرانب البيضاء النيوزيلندية) بالمسكنات العضلية (35 ملغ/كغ من الكيتامين) مع مهدئ ومرخي للعضلات ومسكن (2.5 ملغ/كغ زيلازين).
- احلق منطقة الشق خارج منطقة العملية ونظف منطقة الجراحة لإزالة الشعر.
- تطبيق المسكنات بالإضافة إلى العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية: 0.05 ملغ/ كغ من البوبرينورفين العضلي و10 ملغ/ كغ من الإنروفلوكساسين.
- ضع قسطرة وريدية في الوريد الهامشي لكل أرنب.
- التخدير التعريفي بجرعة 10 ملغ/كغ من البروبوفول في الوريد.
- راقب العلامات الحيوية للحيوان باستخدام مخطط كهربية القلب ثلاثي الرصاص ، وقياس التأكسج النبضي ، وقياس الضغط غير الباضع. كل 30 دقيقة ، ضعي المصل الفسيولوجي على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- تحقق من مستوى التخدير باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم.
- الحفاظ على التخدير مع استنشاق isoflurane في 1.5 ٪ -2 ٪ من الحد الأدنى للتركيز السنخية دون فقدان التهوية التلقائية وتوفير الدعم الحراري للأرنب مع وسادة التدفئة.
- تطهير منطقة شق عدة مرات في حركة دائرية مع فرك القائم على اليود. في ظل ظروف معقمة في جميع الأوقات وبمواد معقمة ، قم بعمل شق صدري مركزي طولي 3 سم ، وحصاد اللوحات الثنائية المكونة من اللفافة الصدرية ومكون عضلي.
- لف القصبة الهوائية مع رفرف في أربعة أرانب ، واحدة على كل hemithorax (وبالتالي ، ما مجموعه ثمانية القصبة الهوائية).
- عند اكتمال الجراحة ، عكس التخدير عن طريق مقاطعة إعطاء الأيزوفلوران.
- فترة ما بعد الجراحة
- احتفظ بالحيوانات في غرفة العمليات حتى تتعافى تماما من التخدير. عندما يتعافون تماما ، يعودون إلى بيئتهم مع الأرانب الأخرى.
- عالج الأرانب بالمضادات الحيوية (0.5 مل/كغ من 2.5٪ إينروفلوكساسين) والمسكنات (5 ملغ/مل ميلوكسيكام؛ 0.05 مل/كغ ميتاكام) كل 24 ساعة لمدة 5 أيام.
- اترك الغرسات في الموقع للوقت المطلوب.
- قبل القتل الرحيم، يجب علاج الأرانب مسبقا بالمسكنات العضلية (35 ملغ/كغ من الكيتامين) والمسكنات والمسكنات (2.5 ملغ/كغ من الزيلازين). ثم القتل الرحيم للأرانب ب 133 مجم / كجم من صوديوم بنتوباربيتال باستخدام حقن 200 مجم / مل من خلال وريد الأذن الهامشي وحصاد القصبة الهوائية.
- إجراء الاختبارات الميكانيكية الحيوية والنسيجية على القصبة الهوائية.
6. التحليل الإحصائي
- اضبط جميع الطرز بطريقة Bayesian على برنامج R ، الإصدار 3.5.3 R Core (مؤسسة R للحوسبة الإحصائية. 2019).
- تحليل متغيرات الدراسة ، باستثناء f و R ، باستخدام نماذج الانحدار الخطي المتعددة.
- بالنسبة للمتغيرات f و R ، قم بتطبيق نماذج الانحدار الخطي المختلط. في هذه النماذج ، بالإضافة إلى المتغيرات ذات الأهمية المتعلقة بعلاج وحالة كل قصبة هوائية ، أدخل النسبة المئوية للانسداد كتأثير رتيب ومصطلح مستقل لكل القصبة الهوائية كعامل عشوائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إزالة الخلوية
يظهر تلطيخ DAPI عدم وجود الحمض النووي ، ولم يتم الكشف عن قيم الحمض النووي أعلى من 50 نانوغرام في أي من القصبة الهوائية عن طريق الرحلان الكهربائي ، مع كون جميع الشظايا أصغر من 200 bp20.
الثقافة الميكروبية
أظهرت قطعتان من القطع الثمانية التي تعرضت ل 0.5 kGy تغير اللون في أقل من أسبوع واحد. لم تظهر أي من القطع المشععة عند 1 كيلو جراي و 2 كيلو جراي أي تغيير في اللون (الشكل 1).
التحليل النسيجي
لم يتم الكشف عن أي تغييرات في نمط توزيع الكولاجين أو الألياف المرنة في أي من العينات التي تم تحليلها (الشكل 2).
تحديد جرعة الإشعاع
بالنظر إلى النتائج الموضحة أعلاه ، والتي أظهرت أن التشعيع عند 0.5 كيلو جراي لم يضمن تعقيم العينة ، في حين أن جرعات 1 كيلو جراي و 2 كيلو جراي فعلت ذلك ، فقد حددنا الحد الأدنى الممكن لجرعة التشعيع لتحقيق تعقيم الأنسجة على أنه 1 كيلو جراي. لذلك ، اختبرنا التأثير الميكانيكي الحيوي لهذه الجرعة على القصبة الهوائية2،17،23.
دراسة الميكانيكا الحيوية
اختبارات الشد المحوري
البيانات التي تم الحصول عليها في اختبار الشد على القصبة الهوائية المشععة موضحة في الجدول 1. يوضح الشكل 3 منحنيات الإجهاد والإجهاد المقابلة ونقاط الانهيار.
وبالتالي ، فإن تعريض قطع القصبة الهوائية لإشعاع جاما لأغراض التعقيم ، على الرغم من الزيادة الطفيفة في القيم المكتشفة ، لا يسبب تأثيرات كبيرة على الخصائص الميكانيكية الحيوية المحورية للأعضاء. ومن ثم ، فإن كلا σالأقصى الذي يمكن أن تتحمله القصبة الهوائية (0.05 ميجا باسكال ؛ CI [-0.046, 0.144] ميجا باسكال)، وكذلك εكحد أقصى (0.096 CI [-0.096, 0.281]), (0.022 ميجا باسكال; CI [-0.23 ، 0.274] ميجا باسكال) ، و W / Vol (من 0.044 مللي جول / مم3 ؛ CI [-0.018 ، 0.106] مللي جول / مم3) ، زادت بشكل طفيف جدا في هذه العينة ، ولكنها لا تنطبق بأي حال من الأحوال على تقدير السكان.
اختبارات الضغط الشعاعي
يوضح الجدول 2 اختبارات الضغط التي أجريت على كل من القصبة الهوائية الأصلية (الضوابط) وعلى القصبة الهوائية منزوعة الخلايا والمحفوظة بالتبريد والمشععة. يمكن رؤية الرسوم البيانية المقابلة في الشكل 4.
ولا يسبب تشعيع غاما سوى انخفاض ضئيل ولكنه كبير في الخصائص الميكانيكية الحيوية الشعاعية في القوة المتغيرة لكل وحدة طول، والتي تختلف بمقدار -0.017 نيوتن/مم؛ CI [-0.042, -0.004] N/mm، في حين أن الحد الأدنى من الاختلافات المكتشفة في W/Vol (0.044 mJ/mm3; CI [-0.018, 0.106] mJ/mm3), R (-0.018 ميجا باسكال · مم; CI [-0.145، 0.083] ميجا باسكال · مم)، وW/S (-0.081 مللي جول/مم2; CI [-0.95 ، 0.74] مللي جول / مم2) ، لا تنطبق بأي حال من الأحوال على تقدير السكان (الشكل 5).
غرس
الفحص العياني
لم تظهر أي من الحيوانات أعراضا التهابية أو معدية خلال فترة ما بعد الجراحة. أعيد نظامهم الغذائي كما هو مخطط له وتم تعليق المضادات الحيوية والمسكنات في اليوم الخامس. عند القتل الرحيم ، لوحظ تكامل القصبة الهوائية والسديلة بالمنظار ، مع عدم وجود علامات واضحة للالتهاب.
الفحص النسيجي
أظهر الفحص النسيجي أن السديلة تشكل نسيجا ضاما منظما للغاية - يرتبط ارتباطا وثيقا بحلقات القصبة الهوائية ، مما يدل على الاستمرارية بينها وبين الأنسجة - في شكل محيط القصبة الهوائية الأصلية. كان الغضروف سليما ولم تظهر عليه أي علامات نخر. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود الضامة وبعض الخلايا العملاقة المعزولة التي تشكل أوراقا. بخلاف الوجود النادر للحمضات ، لوحظ وجود خلوية التهابية حادة خفيفة بعد الجراحة (الشكل 6). كما لوحظ الأوعية الدموية الجديدة الأولية حول القصبة الهوائية.
التقييم الميكانيكي الحيوي
بعد زرعها في lagomorph ، ظلت خصائص القصبة الهوائية دون تغيير ، باستثناء القوة لكل وحدة طول ، والتي استعادت خصائص القصبة الهوائية الأصلية بعد أسبوعين فقط من عملية الزرع (0.006 نيوتن / مم ، CI [-0.026 ، 0.04] نيوتن / مم) (الشكل 7).
الشكل 1: القصبة الهوائية المشععة في DMEM بدون مضادات حيوية أو مضادات فطريات. تغير لون العينتين على اليسار (0.5 كيلو جراي) ، مما يشير إلى حدوث تغير في درجة الحموضة ، وهو علامة غير مباشرة على نمو البكتيريا. هناك أيضا زيادة في التعكر في العينة الأولى على اليسار. لا تظهر العينتان على اليمين (1 كيلو جراي) أي تغيير في اللون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إزالة الخلايا من القصبة الهوائية وتشعيعها بجرعات مختلفة. كل صف يتوافق مع تلطيخ مختلف وكل عمود لجرعة تعقيم مختلفة. 1) الهيماتوكسيلين يوزين. منظر بانورامي للغضروف والغشاء المخاطي وتحت المخاطية والمصل. 2) بقعة ماسون ثلاثية الألوان. تحت المخاطية القصبة الهوائية. 3) الهيماتوكسيلين يوزين. عرض مفصل للغضروف الرغامي. (أ) القصبة الهوائية غير المشععة (السيطرة). (ب) القصبة الهوائية المشععة عند 0.5 كيلو غراي. (ج) القصبة الهوائية المشععة عند 1 كيلو غراي. (د) القصبة الهوائية المشععة عند 2 كيلو غراي. لوحظ عدم وجود تغييرات نسيجية موضوعية فيما يتعلق بجرعة الإشعاع. اختصار: N = القصبة الهوائية الأصلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات إجهاد الإجهاد للقصبة الهوائية منزوعة الخلايا والمشععة. تم تمييز نقطة الانهيار باللون البرتقالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنيات النسبة المئوية للانسداد المقابلة لاختبارات الجر في القصبة الهوائية منزوعة الخلايا والمشععة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الاستجابة الميكانيكية الحيوية للتشعيع. (أ) رسم بياني للتأثيرات الحدية على القوة المتغيرة لكل وحدة طول، وفقا لنسبة انسداد تفاعل التشعيع. (ب) رسم بياني للتأثيرات الحدية على القوة المتغيرة لكل وحدة طول، وفقا لنسبة انسداد تفاعل التشعيع. (ج) مخطط الاعتماد الجزئي للطاقة المخزنة لكل وحدة مساحة نموذج لمتغير التشعيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: منظر القصبة الهوائية المزروعة في 2 أسابيع. أ: تلطيخ ثلاثي الألوان لماسون. لوحظ النسيج الضام الحديث للسطح الخارجي للقصبة الهوائية المنظم في طبقات متحدة المركز من الألياف والخلايا. ب: الهيماتوكسيلين-يوزين. منظر بانورامي للغضروف المحفوظ تماما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: رسم بياني للتأثيرات الهامشية للتفاعل بين القوة لكل وحدة طول والنسبة المئوية للانسداد والسيطرة (الأصلية) القصبة الهوائية مقابل غرسات القصبة الهوائية في 2 أسابيع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: اختبارات الشد على القصبة الهوائية المشععة. الضوابط هي القصبة الهوائية الأرانب الأصلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: اختبارات الضغط على القصبة الهوائية المشععة ومنزوعة الخلايا. الضوابط هي القصبة الهوائية الأرانب الأصلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من استراتيجيات التعقيم الموجودة. CO2فوق الحرج يخترق الأنسجة بالكامل ، ويحمض الوسط ويفكك طبقة الفوسفوليبيد الخلوية المزدوجة مع التخلص البسيط عن طريق إزالة الضغط من الغرسة8،14،25. كما تم استخدام الأشعة فوق البنفسجية ، وتم نشر فعاليتها في القصبة الهوائية للقوارض ، على الرغم من وجود عدد قليل من التقارير في الأدبيات10. تشمل الطرق الأخرى المستخدمة تطبيق مواد مثل حمض البيراسيتيك أو الإيثانول أو بيروكسيد الأكسجين أو الماء المحلل بالكهرباء ، والتي أعطت نتائج غير منتظمة وثبت أنها تؤثر بشكل كبير على الأنسجة11,12. وعلى النقيض من الاستراتيجيات المذكورة أعلاه، لم يثبت تشعيع أشعة غاما فعاليته الكاملة من حيث التعقيم فحسب، بل تمت دراسته أيضا بدقة وغزارة، فيما يتعلق بكل من الجرعة وآثار التعقيم. في الواقع ، لقد تمت دراسته كثيرا لدرجة أن هناك معيار ISO لاستخدام إشعاع جاما في التعقيم ، حيث يتم تحديد جرعة تعقيم المواد الخاملة المراد زرعها في البشر عند 25 كيلو جراي13،14،15.
من ناحية أخرى ، بالإضافة إلى تعقيم المواد ، ثبت أيضا أن التشعيع يسبب آثارا جانبية كقيد على التقنية. وتشمل هذه تدمير وتغيير المصفوفات عن طريق تغيير طبيعة جزيئات البروتين ، بما في ذلك الكولاجين ، وتوليد جزيئات متبقية ، والتي يمكن أن تصبح سامة. وبالتالي فإن هذا التدهور في بنية العضو يؤثر على كل من خصائصه البيولوجية والميكانيكية الحيوية ، حيث تتناسب الآثار الضارة للإشعاع تناسبا طرديا مع جرعته ويتم ملاحظته عند جرعات منخفضة نسبيا13،14،15،16،17. هنا ، كان الهدف ذا شقين: من ناحية ، الحصول على بنية معقمة من أجل ضمان زرع قابل للحياة ، ومن ناحية أخرى للحفاظ على الخصائص البيولوجية والميكانيكية الحيوية للمصفوفة ، لأن الزرع سيكون عديم الجدوى ما لم يتم الحفاظ على كليهما26. وبالتالي ، كان التحدي هو اختيار استراتيجية تسمح بالتوازن بين التعقيم الناجح والحفاظ على بنية الأنسجة.
هنا ، تم تحديد 1 kGy كحد أدنى لجرعة التعقيم. أظهر الفحص النسيجي أن هذه الجرعة من التشعيع ليس لها أي تأثير على الأنسجة. علاوة على ذلك ، حدد التوصيف الميكانيكي الحيوي للقصبة الهوائية المشععة أن استخدام التشعيع لا يحدث فرقا على الإطلاق في معلمات الجر. كان هناك انخفاض طفيف ولكنه ذو دلالة إحصائية في القوة لكل وحدة طول تمكنت القصبة الهوائية من تحملها في اختبارات الضغط الشعاعي ، ولكن هذا لا يؤثر على خصائصها الشعاعية الأخرى.
في حين أن هناك بعض الأوراق التي تناقش استحالة التعقيم والتدمير الناجم عن جرعات منخفضة تصل إلى 1.5 kGy 19 ، فإن الغالبية العظمى تتماشى مع البيانات المقدمة2،18،19. بهذه الطريقة ، يلاحظ المؤلفون أن تعقيم العظام بجرعات 10 و 15 و 20 و 25 كيلو جراي يحقق التعقيم الكامل ، على الرغم من أنه في مقابل انخفاض في قدرة حضانة الخلايا وزيادة في منتجات تحلل الكولاجين بجرعات أعلى من 15 كيلو جراي18. جرعة من 1.5 kGy لم تحصل على تعقيم في صمامات القلب decellarized ، ولكنها تسببت في تلف الصفات الميكانيكية للعينات في كل من الجسم الحي والمختبر. وفي الوقت نفسه ، حققت جرعة 3 كيلو جراي التعقيم ، لكنها تسببت في التدمير والتليف19. فيما يتعلق بالقصبة الهوائية ، قارن جونسون وآخرون آثار التعقيم بجرعة ISO البالغة 25 كيلو جراي بجرعة 5 كيلو جراي. حصلت كلتا الجرعتين على تعقيم نهائي ، مع جرعة 5 كيلو جراي تغير قليلا بنية العينة وجرعة 25 كيلو جراي تدمر القصبة الهوائية 2تماما.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأكيد التعقيم الفعال بفضل عدم وجود أحداث معدية فيما يتعلق بالزرع بعد 2 أسابيع ، مع التعقيم الذي تتحمله الأعضاء بالكامل. أيضا ، تم الحفاظ على الهيكل بالكامل ، مع عدم وجود نخر أو تمسخ للعضو. علاوة على ذلك ، كنتيجة إضافية ، لوحظ أن التغيير الطفيف في الخصائص الميكانيكية الحيوية - إلى القوة التي تستطيع القصبة الهوائية تحملها لكل وحدة طول - عاد إلى قيم القصبة الهوائية الأصلية بعد 2 أسابيع فقط من الزرع ؛ لذلك ، يمكن تجاهل هذا التأثير وفقا للإدارة النهائية للبناء.
لذلك ، تقدم هذه الورقة إمكانية الحصول على أعضاء معقمة تماما بجرعات أقل بكثير من الجرعة الموصى بها البالغة 25 كيلو جراي. يقوم الاقتراح باستكشاف أخطاء تعقيم القصبة الهوائية للأرانب النيوزيلندية بجرعة 1 كيلو جراي. تضمن هذه الجرعة الحفاظ على الخصائص النسيجية والهيكلية والميكانيكية الحيوية لهذه الأعضاء ، وتظهر تسامحا تاما مع الزرع. أحد قيود الدراسة هو أنها تجرى فقط على القصبة الهوائية الأرنب المعقمة ، والتي تتطلب عموما جرعة أقل بسبب كونها أصغر في الحجم. ومع ذلك ، يمكن الاستنتاج أن الأرقام العالية بشكل مفرط المحددة في معيار ISO للزرع الخامل ليست ضرورية لتعقيم القصبة الهوائية المنزوعة الخلايا ، وبالتالي فهي إنجاز كبير بسبب الضرر المنخفض بشكل كبير للأنسجة. علاوة على ذلك ، في الدراسات المستقبلية ، اعتمادا على الحيوان ، وبالتالي على حجم القصبة الهوائية ، يمكن تعديل هذه الجرعات إلى جرعات أقل بكثير وبالتالي تكون أكثر احتراما لهيكل العضو ووظيفته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الورقة من قبل منحة الجمعية الإسبانية لجراحة الصدر لعام 2018 للدراسة الوطنية متعددة المراكز [رقم 180101 الممنوحة لنيستور جيه مارتينيز هيرنانديز] و PI16-01315 [الممنوحة لمانويل ماتا رويج] من قبل معهد الصحة كارلوس الثالث. يتم تمويل CIBERER من قبل الخطة الوطنية السادسة للبحث والتطوير والابتكار 2018-2011 ، Iniciativa Ingenio 2010 ، برنامج Consolider ، CIBER Actions ، ومعهد Salud Carlos III ، بمساعدة من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
