La esterilización es esencial para el trasplante de tejido traqueal. En este documento, presentamos un protocolo de esterilización utilizando irradiación gamma de baja dosis que es totalmente tolerada por los órganos.
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Artículo de método
Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados
En este artículo
Resumen
Resumen
Uno de los principales aspectos clave para asegurar que un trasplante evoluciona correctamente es la esterilidad del medio. El trasplante traqueal descelularizado implica implantar un órgano que originalmente estaba en contacto con el medio ambiente, por lo que no es estéril desde el principio. Si bien el protocolo de descelularización (a través de la exposición con detergente [dodecil sulfato de sodio al 2%, agitación continua y choques osmóticos) se lleva a cabo de acuerdo con las medidas asépticas, no proporciona esterilización. Por lo tanto, uno de los principales desafíos es garantizar la esterilidad previa a la implantación in vivo . Aunque existen protocolos establecidos de esterilización por radiación gamma para materiales inorgánicos, no existen tales medidas para materiales orgánicos. Además, los protocolos establecidos para materiales inorgánicos no se pueden aplicar a materiales orgánicos, ya que la dosis de radiación establecida (25 kGy) destruiría completamente el implante. Este artículo estudia el efecto de una dosis de radiación escalada en una tráquea de conejo descelularizada. Mantuvimos el rango de dosis (kGy) y probamos las dosis escalonadas hasta encontrar la dosis mínima a la que se logra la esterilización. Después de determinar la dosis, estudiamos los efectos de la misma en el órgano, tanto histológica como biomecánicamente. Determinamos que mientras 0,5 kGy no alcanzaban la esterilidad, las dosis de 1 kGy y 2 kGy sí lo hacían, siendo 1 kGy, por lo tanto, la dosis mínima necesaria para lograr la esterilización. Los estudios microscópicos no mostraron cambios relevantes en comparación con los órganos no esterilizados. Las características biomecánicas axiales no se alteraron en absoluto, y solo se observó una ligera reducción en la fuerza por unidad de longitud que el órgano puede tolerar radialmente. Por lo tanto, podemos concluir que 1 kGy logra la esterilización completa de la tráquea de conejo descelularizada con un efecto mínimo, si es que tiene alguno, en el órgano.
Introducción
La esterilización de un implante es un requisito básico para su viabilidad; De hecho, las prótesis que han demostrado ser exitosas son aquellas implantadas en áreas estériles (vasos sanguíneos, corazón, hueso, etc.) 1. La tráquea tiene dos superficies: una superficie en contacto con el ambiente externo, que por lo tanto no es estéril, y una superficie hacia el mediastino, que es estéril. Por lo tanto, desde el momento en que se extrae la tráquea, no es un órgano estéril. A pesar de que el proceso de descelularización posterior se lleva a cabo en condiciones máximas estériles, no es una etapa de esterilización2. La implan....
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Protocolo
Se adhirió a la directiva europea 20170/63/UE para el cuidado y uso de animales de laboratorio y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universitat de València (Ley 86/609/CEE y 214/1997 y Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 de la Generalitat Valenciana, España).
1. Descelularización traqueal
NOTA: El método de descelularización ha sido reportado en otra parte20.
- Eutanasia a conejos blancos adultos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) que pesan 3.5-4.1 kg con 133 mg/kg de pentobarbital sódico, usando una inyección de 200 mg/ml ....
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Resultados
Descelularización
La tinción DAPI muestra la ausencia de ADN, y no se detectaron valores de ADN superiores a 50 ng en ninguna de las tráqueas por electroforesis, siendo todos los fragmentos menores de 200 pb20.
Cultivo microbiano
Dos de las ocho piezas sometidas a 0,5 kGy mostraron cambio de color en menos de 1 semana. Ninguna de las piezas irradiadas a 1 kGy y 2 kGy mostró ningún cambio de color (Figura 1
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Discusión
Existen varias estrategias de esterilización. ElCO2supercrítico penetra completamente en los tejidos, acidificando el medio y deconstruyendo la bicapa de fosfolípidos celulares con eliminación simple mediante la despresurización del implante 8,14,25. También se ha utilizado radiación ultravioleta y se ha publicado su efectividad en la tráquea de roedores, aunque hay pocos relatos en la literatura10
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por la Beca 2018 de la Sociedad Española de Cirugía Torácica al Estudio Nacional Multicéntrico [Número 180101 otorgado a Néstor J.Martínez-Hernández] y PI16-01315 [otorgado a Manuel Mata-Roig] por el Instituto de Salud Carlos III. El CIBERER está financiado por el VI Plan Nacional de I&D&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Programa Consolider, Acciones CIBER y el Instituto de Salud Carlos III, con la ayuda del Fondo Europeo de Desarrollo Regional.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sutura de monofilamento de nailon 6-0 | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, EE. UU. | SN-5698G | |
| Anfotericina B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA EE. UU. | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU. | G2939BA | |
| Buprenorfina | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Microtest de compresión de sobremesa UTM | , Madrid, España | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, EE. UU | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU. | de 11965084 | |
| kit de extracción DNeasy Quiagen, Hilden, Alemania | 4368814 | ||
| Enrofloxacina, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemania | 0035-0002 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, España | SH20898.03IR | |
| Microscopio de fluorescencia | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Alemania) | DM2500?? | |
| Contenedor de congelación | Señor Frosty. Termo Pescador; Madrid, España | 5100-0001 | |
| isofluorano | isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, España | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Acelerador lineal | "Rayo verdadero". Varian, Palo Alto, California, EE. UU | H191001 | |
| Agitador magnético | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemania | 6283-MV | |
| Penicilina-estreptomicina 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA EE. UU | . 15140122 | |
| Pentobarbital sódico | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, Españ una | 3.60587E+ | |
| ; MO, EE. UU. | P2272 | ||
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| proteinasa K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, EE. UU | S3020 | |
| Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italia | hhdddyyZ | ||
| stent de PVC | ArgyleTM Medtronic; Estambul, Turquía | 019 5305 1 | |
| R software, versión 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing R | 3.5.3 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, EE. UU. | 8,17,034 | |
| Espectrofotómetro | Nanodrop, Life Technologies; Ciencias de la vida de Isogen. Utrech, Países Bajos | Hoja de cálculo ND-ONEC-W | |
| Microsoft | Excel para Mac, versión 16.23, Redmond, WA, EE. UU | . 2864993241 | |
| Máquina de prueba universal de tracción | Máquinas de prueba, Veenendaal, Países Bajos | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, EE. UU. | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Medio de montaje | Vector Labs, Burlingame; CA; Estados Unidos | H-1000-10 | |
| Xilagesic | xilacina. Calier; Barcelona, Españ A | 20102-003 |
Referencias
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M.
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Reimpresiones y permisos
