Summary
绝育对于气管组织移植至关重要。在这里，我们提出了一种使用器官完全耐受的低剂量伽马辐照的灭菌方案。
Abstract
确保移植正确发展的主要关键方面之一是培养基的无菌性。脱细胞气管移植涉及植入最初与环境接触的器官，因此从一开始就不是无菌的。虽然脱细胞方案（通过洗涤剂暴露[2%十二烷基硫酸钠]，连续搅拌和渗透冲击）是按照无菌措施进行的，但它不提供灭菌。因此，主要挑战之一是在 体内 植入之前确保无菌。虽然对无机材料有既定的伽马辐射灭菌规程，但对有机材料没有这样的措施。此外，无机材料的协议不能应用于有机材料，因为既定的辐射剂量（25 kGy）会完全破坏植入物。本文研究了辐射剂量递增对去细胞化兔气管的影响。我们维持剂量范围（kGy）并测试递增剂量，直到找到达到灭菌的最小剂量。确定剂量后，我们研究了它对器官的组织学和生物力学的影响。我们确定，虽然0.5 kGy没有达到无菌，但1 kGy和2 kGy的剂量都可以，因此1 kGy是实现灭菌所需的最小剂量。显微镜研究显示，与未消毒的器官相比，没有相关变化。轴向生物力学特性根本没有改变，并且仅观察到器官可以径向耐受的每单位长度的力略有减少。因此，我们可以得出结论，1 kGy实现了脱细胞兔气管的完全灭菌，对器官的影响很小（如果有的话）。
Introduction
植入物的灭菌是其生存能力的基本要求;事实上，已被证明成功的假肢是植入无菌区域（血管、心脏、骨骼等）的假肢。1.气管有两个表面：一个与外部环境接触的表面，因此不是无菌的，另一个是朝向纵隔的表面，它是无菌的。因此，从提取气管的那一刻起，它就不是无菌器官。尽管随后的脱细胞过程是在最大无菌条件下进行的，但它不是灭菌步骤2。异物的植入本身就存在感染的风险，因为它产生的前细菌微环境3，即使材料已经过灭菌，疾病从供体传播到受体的风险高达0.014%4。为了确保气管的正确血管化，在几乎所有实验移植方案中，它首先将异位植入物5,6,7到无菌区域（肌肉，筋膜，网膜，皮下等）;这是因为在该培养基中植入非无菌元件会导致区域3 的感染。
有一系列可能的策略可以获得无菌植入物。使用超临界CO2实现了终端灭菌8,9。其他方法，例如紫外线辐射或用过氧乙酸，乙醇，过氧化氧和电解水等物质进行处理，在灭菌中获得了不同的成功率，几乎总是取决于它们的剂量，但它们已被证明会影响植入物的生物力学特性。事实上，一些物质，如环氧乙烷，可以显著改变植入基质的结构，甚至会引起不良的免疫原性效应。因此，许多这些策略不能应用于生物模型2,10,11,12,13。
最广泛研究和接受的灭菌策略是由ISO 11737-1：2006标准建立的，用于对植入人体的医疗器械进行灭菌，伽马辐射剂量为25 kGy。但是，该法规仅侧重于惰性，非生物元素的灭菌14,15。此外，在癌的根治治疗中，放射治疗剂量比用于对医疗器械进行灭菌的剂量低三个数量级1。考虑到这一点，我们可以得出结论，所述剂量不仅会杀死微生物群，还会破坏并从根本上改变植入物的生物结构。它还有可能在降解时产生残留脂质，这可能具有细胞毒性并加速支架13,14,15,16,17的酶降解，即使使用低至1.9 kGy的剂量并且损害与接受的辐射剂量成正比17。
因此，本文的目的是尝试确定允许获得无菌植入物的辐射剂量，而辐射引起的有害影响最小2,18,19。我们遵循的策略涉及在千格雷范围内（0.5、1、2、3 kGy等）以不同的递增剂量照射脱细胞和辐照气管，直到培养结果为阴性。对培养结果为阴性的剂量进行了额外的测试，以确认灭菌。在确定获得灭菌的最小剂量后，检查照射对气管的结构和生物力学影响。将所有指标与对照组本地兔气管进行比较。然后将气管植入新西兰白兔体内，在体内测试结构的灭菌。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
遵守关于实验动物护理和使用的欧洲指令 20170/63/EU，研究方案得到瓦伦西亚大学伦理委员会的批准（西班牙瓦伦西亚政府第 86/609/EEC 和 214/1997 号法律以及代码 2018/VSC/PEA/0122 Type 2）。
1.气管脱细胞
注意：去细胞化方法已在其他地方报道20.
- 使用200 mg / mL通过边缘耳静脉注射，对体重3.5-4.1kg的雄性新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）进行安乐死，重3.5-4.1公斤的五巴比妥钠。
- 在确保无菌条件的同时，进行中央纵向宫颈切开术，解剖颈肌，并接近气管。圆周和纵向解剖器官。最后，在第一个环下方和隆突上方横断面。
- 用手术刀将气管切成2厘米的碎片。用剪刀去除周围的结缔组织和内粘膜层6.
- 将标本浸没在含有 2% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、5% 青霉素-链霉素和 5% 两性霉素 B 的 12 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中。
- 在室温下用磁力搅拌器以400rpm恒定搅拌气管5周。在渗透休克2小时后，通过将气管浸入蒸馏水中，每周更换脱细胞溶液。
- 在-80°C的冷冻容器中使用80%胎牛血清（FBS）和20%二甲基亚砜（DMSO）的12mL混合物对标本进行低温化。
- 当气管将被使用时（13-15天后），将它们在37°C的水浴中解冻，并在解冻完成后将它们浸入PBS中洗涤。
2. 灭菌
- 辐照
- 将每批四个气管片各测量 2 cm 放入装有 PBS 的 T25 培养瓶中的 20 mL 甲基丙烯酸酯中，直到达到 30 mL 的总体积。注意防止气泡形成，这可能会导致气液界面中的能量扩散。
- 使用直线加速器进行照射，标称能量为 10 MV 的光子扁平滤光片自由光束。在等中心施加每分钟2,400个监测单位的剂量率，将气管放置在100厘米的源面距离处进行照射，对于10厘米x 10厘米的辐射场，景深为2.5厘米，以覆盖整个容器 - 对应于24 Gy/min的剂量。
- 每批四件批增加剂量;四件将进行0.5 kGy，四至1 kGy，四至2 kG等，直到达到灭菌。
- 文化
- 将碎片引入 30 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中，其中灭活的 10% FBS 不含抗生素或抗真菌药。
- 在37°C和5%CO 2的标准组织培养箱中培养2周，每24小时检查一次。
注意：污染参数是培养基pH值的变化，因此是培养基颜色和浊度的变化。气管是从无菌的lagomorphs中收获的，这些lagomorphs没有生病，因此预计它们的气管中没有厌氧细菌。
3. 组织学分析
注意：使用苏木精和伊红21、马森三色和果菌素22 对碎片进行染色。
- DAPI 染色
- 使用DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）确定组织活力。这种蓝色荧光染色剂与DNA序列中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的区域强烈结合，因此可以通过荧光显微镜 观察 DNA。
- 将组织样品嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中。
- 使用低温恒温器切割样品。
- 在蒸馏水中洗涤待染色样品三次以除去OCT。 置于包含 30 nM DAPI 溶液的封片剂中。
- 使用荧光显微镜观察荧光。
- 脱氧核糖核酸含量分析
- 用手术刀切割长约 3 毫米的气管段。
- 在蛋白酶K中孵育2小时（材料表）。
- 按照制造商的说明，使用 DNA 提取试剂盒提取 DNA。
- 通过分光光度法，通过使用分光光度计测量260/280处的吸光度来确定DNA的浓度。
- 使用毛细管色谱法和生物分析仪测量提取的DNA样品的大小。
4. 生物力学研究
注意：气管对纵向和横向力的抵抗力是通过轴向拉伸和径向压缩测试23测量的。
- 气管测量
- 使用游标卡尺测量气管长度、壁厚和外径。
- 计算每个变量的三个随机测量值的平均值。
- 在径向压缩测试中，通过检测板与试样接触的点来计算前后直径。
- 在室温下进行所有测试。
- 拉伸试验
- 在配备 100 N 载荷（0.1 N 力分辨率、0.001 mm 位置和 0.1 s）的牵引台式万能试验机 （UTM） 位移控制上进行拉伸测试。试验机配有力和位置传感器，并用制造商专门设计的软件连接到计算机23。
- 每0.4秒记录一次数据并导出到电子表格。
- 用外径为 1 厘米、壁厚为 1.5 毫米的纯单层无毒晶体聚氯乙烯 （PVC） 空心管构建适应兔气管平均口径的拉伸钳口。
- 将传导分成3厘米长的段。
- 为末端末端缝合线钻12个预制孔，距离钳口边缘2毫米，相隔2.5毫米，以防止缝合线造成的偏差。
- 通过末端吻合将PVC玻璃管连接到兔气管上，通过交替的预成型孔（每5毫米）连续缝合，距离气管边缘2毫米，并用6-0尼龙单丝缝合。
- 以 5.0 毫米/分钟的位移速度拉伸所有部件。
- 记录变量最大应力（最大σ，单位为 N/mm 2）和应变（最大ε，无单位），以及每单位气管体积存储的能量（W/Vol，单位为 mJ/mm）和杨氏模量（E，单位为 MPa）。
- 径向压缩试验
- 在配备 15 N 称重传感器（力分辨率 0.001 N、位置 0.001 mm、时间 0.1 s）的压缩台式 UTM 上执行径向压缩测试，以获取力数据 （N）、位置 （mm） 和时间 （s）。记录数据并以0.5秒的间隔导出到电子表格。
- 将气管膜区放在下板上。板以 5 mm/min 的恒定速度逐渐上升到顶板。
- 计算完全阻塞气管所需的每单位样品长度（f 以 N/mm 为单位）、刚度（R 以 Mpa·mm 为单位）和每单位表面积的能量（W / S 以 mJ/mm 2 为单位）所需的每个单位。
5. 手术技术
注：该手术技术已在其他地方广泛报道20.
- 放置一个尺寸为14 Fr的无菌腔内PVC支架（允许其自由滑动而不会压缩壁），两端有3-4毫米的边缘。
- 用单个6-0尼龙单丝缝线通过第一软骨的软骨间空间固定支架。
- 继续麻醉兔子。
- 用肌内镇痛药（35 mg / kg氯胺酮）和镇静剂，肌肉松弛剂和镇痛药（2.5mg / kg甲苯噻嗪）对受试者（3.65-4.05公斤雄性新西兰白兔）进行预用药。
- 将切口区域剃出手术区域并清洁手术区域以去除毛发。
- 给予镇痛药加抗生素预防：0.05 mg/kg 肌内注射丁丙诺啡和 10 mg/kg 恩诺沙星。
- 在每只兔子的边缘耳静脉中放置一根静脉导管。
- 静脉推注 10 mg/kg 丙泊酚诱导麻醉。
- 使用三导联心电图、脉搏血氧饱和度和无创压力测量监测动物的生命体征。每30分钟，将生理精华液涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。
- 使用脚趾捏法验证麻醉平面。
- 用吸入异氟醚将麻醉维持在最低肺泡浓度的1.5%-2%，而不会失去自发通气，并用加热垫为兔子提供热支持。
- 用碘基磨砂膏以圆周运动对切口区域进行几次消毒。在无菌条件下，始终使用无菌材料，做一个纵向3厘米中央胸切口，收获由胸筋膜和肌肉成分组成的双侧椎弓根瓣。
- 用皮瓣包裹气管，用四只兔子包裹，每只半胸一只（因此，总共八个气管）。
- 手术完成后，通过中断异氟醚给药来逆转麻醉。
- 术后时期
- 将动物留在手术室，直到它们从麻醉中完全恢复。当它们完全康复后，将它们与其他兔子一起返回环境。
- 用抗生素（0.5mL / kg的2.5%恩诺沙星）和镇痛药（5mg / mL美洛昔康; 0.05mL / kg美他卡姆）治疗兔子，每24小时一次，持续5天。
- 将植入物留在 原位 所需的时间。
- 在安乐死之前，用肌内镇痛药（35 mg / kg氯胺酮）和镇静剂，肌肉松弛剂和镇痛药（2.5mg / kg甲苯噻嗪）预先用药。然后用133mg / kg戊巴比妥钠对兔子实施安乐死，使用200mg / mL通过边缘耳静脉注射并收获气管。
- 对气管进行生物力学和组织学测试。
6. 统计分析
- 在 R 软件 3.5.3 版 R Core 上通过贝叶斯方法调整所有模型（R Foundation for Statistical Computing，2019 年）。
- 使用多元线性回归模型分析除 f 和 R 之外的研究变量。
- 对于 f 和 R 变量，应用混合线性回归模型。在这些模型中，除了与每个气管的治疗和状况相关的感兴趣变量外，还将闭塞百分比作为单调效应引入，并将每个气管的独立项作为随机因子引入。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
去细胞化
DAPI染色显示不存在DNA，并且通过电泳在任何气管中均未检测到高于50ng的DNA值，所有片段均小于200 bp20。
微生物培养
在承受0.5 kGy的8件作品中，有2件在不到1周的时间内显示出颜色变化。在1 kGy和2 kGy照射的碎片均未显示任何颜色变化（图1）。
组织学分析
在分析的任何标本中均未检测到胶原蛋白或弹性纤维分布模式的变化（图2）。
确定辐射剂量
鉴于上述结果表明，0.5 kGy的照射并不能确保标本的灭菌，而1 kGy和2 kGy的剂量可以，我们确定了实现组织灭菌的最小可能照射剂量为1 kGy。因此，我们测试了该剂量对气管2,17,23的生物力学影响。
生物力学研究
轴向拉伸试验
在辐照气管的拉伸试验中获得的数据如 表 1所示。 图3 显示了相应的应力-应变曲线和断裂点。
因此，尽管略微增加了检测值，但出于灭菌目的对气管碎片进行伽马辐照，但不会对器官的轴向生物力学特性造成显着影响。因此，气管可以承受的最大σ（0.05 MPa;置信区间 [-0.046， 0.144] MPa），以及最大值ε （0.096 CI [-0.096， 0.281]）、（0.022 MPa;CI [-0.23， 0.274] MPa）和W / Vol（从0.044 mJ / mm3;CI [-0.018， 0.106] mJ/mm3），在该样本中略有增加，但在任何情况下都不适用于总体估计。
径向压缩试验
对天然气管（对照组）和去细胞、冷冻保存和辐照气管进行的加压试验如 表 2所示。相应的图表如图 4 所示。
伽马辐照仅导致每单位长度可变力的径向生物力学特性的最小但显着的降低，其变化为-0.017 N/mm;CI [-0.042， -0.004] N/mm，而检测到的最小变化以W/Vol（0.044 mJ/mm3; CI [-0.018， 0.106] mJ/mm3）， R （-0.018 MPa · mm;CI [-0.145， 0.083] MPa · mm）和W/S（-0.081 mJ/mm2;CI [-0.95， 0.74] mJ/mm2），在任何情况下都不适用于人口估计（图5）。
植入
宏观检查
术后均未出现炎症或感染症状;他们的饮食按计划恢复，抗生素和镇痛药在第五天暂停使用。安乐死后，肉眼观察气管和皮瓣的整合，没有明显的炎症迹象。
组织学检查
组织学检查显示皮瓣形成高度组织的结缔组织 - 与气管环紧密相连，显示它们与组织之间的连续性 - 以天然气管的软骨周围形式。软骨完好无损，没有坏死迹象。此外，观察到巨噬细胞和一些形成片状的分离巨细胞的存在。除了嗜酸性粒细胞的稀少存在外，还观察到通常的术后轻度急性炎症细胞（图6）。在气管周围也观察到早期新生血管形成。
生物力学评估
植入lagomorph后，气管的特征保持不变，除了每单位长度的力，在移植后仅2周恢复了天然气管的特征（0.006 N/mm，CI [-0.026,0.04] N/mm）（图7）。
图 1：不使用抗生素或抗真菌药的 DMEM 中辐照气管。 左侧两个标本的颜色（0.5 kGy）发生了变化，表明pH值发生了变化，并且是细菌生长的间接迹象。左侧第一个试样的浊度也有所增加。右侧的两个标本（1 kGy）没有颜色变化。 请点击此处查看此图的大图。
图2：气管脱细胞和不同剂量照射。 每行对应不同的染色，每列对应不同的灭菌剂量。1）苏木精-伊红。软骨、黏膜、黏膜下层和浆膜的全景。2）马森的三色染色。气管粘膜下层。3）苏木精-伊红。气管软骨的详细视图。（A）非辐照气管（对照）。（B） 以0.5 kGy照射的气管。（C） 以1 kGy照射的气管。（D） 气管照射在2 kGy。观察到关于辐射剂量的客观组织学变化不存在。缩写：N = 原生气管。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：脱细胞和辐照气管的应力-应变曲线。 断点以橙色标记。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：对应于脱细胞和辐照气管中牵引力测试的闭塞百分比曲线。 请点击此处查看此图的大图。
图5：对辐照的生物力学反应。 （A）根据辐照相互作用的遮挡百分比，每单位长度对可变力的边际影响图。（B）根据辐照相互作用的遮挡百分比，每单位长度对可变力的边际效应图。（C）辐照变量的单位面积存储能量模型的部分依赖图。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：2 周时植入气管的视图 。 （A）马森的三色染色。观察到气管外表面的新形成结缔组织组织在纤维和细胞的同心层中。（B）苏木精-伊红。保存完好的软骨全景。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：2 周时单位长度的力与闭塞和控制（天然）气管与气管植入物百分比之间相互作用的边际效应图。 请点击此处查看此图的大图。
表1：辐照气管的拉伸试验。 对照是本地兔子气管。 请按此下载此表格。
表2：辐照，去细胞气管的压缩试验。 对照是本地兔子气管。 请按此下载此表格。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
有几种灭菌策略。超临界CO2完全穿透组织，酸化培养基并解构细胞磷脂双层，通过植入物的减压轻松消除8,14,25。紫外线辐射也被使用，其对啮齿动物气管的有效性已经发表，尽管文献中只有少数报道10。使用的其他方法包括应用过氧乙酸，乙醇，过氧化氧或电解水等物质，这些物质已产生不规则的结果，并被证明对组织产生很大影响11,12。与上述策略相比，伽马辐照不仅在灭菌方面被证明是完全有效的，而且在其剂量和灭菌效果方面也得到了彻底和大量的研究。事实上，已经研究了很多，以至于有一个在灭菌中使用伽马辐射的ISO标准，其中将要植入人体的惰性材料的灭菌剂量确定为25 kGy13,14,15。
另一方面，除了灭菌材料外，辐照也被证明会引起附带影响，这是该技术的限制。这些包括通过变性蛋白质分子（包括胶原蛋白）和产生残留分子来破坏和改变基质，这些分子甚至可能变得有毒。因此，器官结构的这种退化会影响其生物和生物力学特性，照射的有害影响与其剂量成正比，并且在相对较低的剂量下观察到13,14,15,16,17。因此，在这里，目标是双重的：一方面，获得无菌结构以确保可行的植入物，另一方面保持基质的生物和生物力学特性，因为除非两者都保持，否则植入物将是徒劳的26。因此，挑战在于选择一种策略，以便在成功灭菌和保存组织结构之间取得平衡。
本文确定1 kGy为灭菌的最小剂量。组织学检查显示，该剂量的照射对组织没有影响。此外，辐照气管的生物力学表征确定，辐照的使用对牵引参数绝对没有影响。在径向压缩测试中，气管能够承受的单位长度的力略有但统计学上的显着下降，但这不会影响其其他径向特性。
虽然有几篇论文讨论了灭菌的不可能性和低至1.5 kGy 19的剂量引起的结构，但绝大多数论文都与所提供的数据一致2,18,19。通过这种方式，作者观察到以10,15,20和25 kGy的剂量对骨进行灭菌可以实现完全灭菌，尽管换来的是细胞孵育能力的降低和胶原降解产物的增加剂量高于15 kGy18。1.5 kGy的剂量在脱细胞心脏瓣膜中没有获得灭菌，但确实对标本在体内和体外的机械质量造成损害;同时，3 kGy的剂量确实实现了灭菌，但导致解构和纤维化19。关于气管，Johnson等人比较了ISO剂量为25 kGy和5 kGy剂量的灭菌效果。两种剂量均得到终末灭菌，5 kGy的剂量略微改变标本的结构，25 kGy的剂量使气管2完全解构。
此外，由于2周后植入物没有感染事件，因此确认了有效的灭菌，并且器官完全耐受灭菌。此外，结构被完全保留，器官没有坏死或变性。此外，作为另一项发现，观察到生物力学特性的微小变化 - 气管每单位长度能够承受的力 - 在植入后仅2周恢复到天然气管的值;因此，根据构造的最终管理，可以忽略此效果。
因此，本文提出了以远低于推荐剂量25 kGy的剂量获得完全无菌器官的可能性;该提案解决了新西兰兔气管灭菌的故障排除，剂量为1 kGy。该剂量可确保维持这些器官的组织学，超微结构和生物力学特征，并对植入物表现出完美的耐受性。该研究的局限性在于它仅在灭菌的兔气管上进行，由于尺寸较小，通常需要较低的剂量;然而，可以得出结论，ISO标准中为惰性植入物建立的过高数字对于脱细胞气管的灭菌是不必要的，因此由于大大减少了对组织的伤害，这是一项巨大的成就。此外，在未来的研究中，根据动物的不同，因此取决于其气管的大小，这些剂量可以调整到更低的剂量，从而更尊重器官的结构和功能。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者都没有任何利益冲突。
Acknowledgments
本文得到了2018年西班牙胸外科学会对国家多中心研究的资助[授予Néstor J.Martínez-Hernández的180101号]和PI16-01315（授予Manuel Mata-Roig）的支持。CIBERER由VI National R&D&I Plan 2018-2011，Iniciativa Ingenio 2010，Consolider Program，CIBER Actions和Instituto de Salud Carlos III资助，并得到欧洲区域发展基金的援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
