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Bioengineering

डीसेल्युलराइज्ड ट्रेचियल ग्राफ्ट के लिए कम खुराक गामा विकिरण नसबंदी

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64432
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 2,7,8
1Thoracic Surgery Department, Hospital Universitari de la Ribera, 2Pathology Department, Universitat de Valencia Facultat de Medicina i Odontologia, 3Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 4Radiation Oncology, Hospital Universitari de la Ribera, 5Thoracic Surgery Department, Hospitales Universitarios Virgen del Rocío, 6Department of Applied Statistics and Operations Research and Quality, Universitat Politècnica de València, 7Networking Research Center on Respiratory Diseases (CIBERER), 8INCLIVA Biomedical Research Institute

Summary

श्वासनली ऊतक प्रत्यारोपण के लिए नसबंदी प्राप्त करना आवश्यक है। यहां, हम कम खुराक वाले गामा विकिरण का उपयोग करके एक नसबंदी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो अंगों द्वारा पूरी तरह से सहन किया जाता है।

Abstract

यह सुनिश्चित करने में मुख्य महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक कि प्रत्यारोपण सही ढंग से विकसित होता है, माध्यम की बाँझपन है। विकोशिकीय श्वासनली प्रत्यारोपण में एक अंग को प्रत्यारोपित करना शामिल है जो मूल रूप से पर्यावरण के संपर्क में था, इस प्रकार शुरुआत से बाँझ नहीं था। जबकि डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल (डिटर्जेंट एक्सपोज़िशन [2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट], निरंतर सरगर्मी और आसमाटिक झटके के माध्यम से) सड़न रोकनेवाला उपायों के अनुरूप आयोजित किया जाता है, यह नसबंदी प्रदान नहीं करता है। इसलिए, मुख्य चुनौतियों में से एक विवो आरोपण से पहले बाँझपन सुनिश्चित करना है। यद्यपि अकार्बनिक पदार्थों के लिए गामा विकिरण नसबंदी प्रोटोकॉल स्थापित हैं, लेकिन कार्बनिक पदार्थों के लिए ऐसे कोई उपाय नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, अकार्बनिक सामग्रियों के लिए प्रोटोकॉल कार्बनिक पदार्थों पर लागू नहीं किया जा सकता है, क्योंकि स्थापित विकिरण खुराक (25 kGy) प्रत्यारोपण को पूरी तरह से नष्ट कर देगा। यह पेपर एक विकोशिकीय खरगोश श्वासनली में एक बढ़ी हुई विकिरण खुराक के प्रभाव का अध्ययन करता है। हमने खुराक सीमा (केजीवाई) को बनाए रखा और न्यूनतम खुराक खोजने तक बढ़ी हुई खुराक का परीक्षण किया, जिस पर नसबंदी हासिल की जाती है। खुराक का निर्धारण करने के बाद, हमने अंग पर इसके प्रभावों का अध्ययन किया, दोनों हिस्टोलॉजिकल और बायोमैकेनिकल रूप से। हमने निर्धारित किया कि जबकि 0.5 kGy ने बाँझपन हासिल नहीं किया, 1 kGy और 2 kGy दोनों की खुराक ने 1 kGy के साथ किया, इसलिए, नसबंदी प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम खुराक है। माइक्रोस्कोपिक अध्ययनों ने गैर-निष्फल अंगों की तुलना में कोई प्रासंगिक परिवर्तन नहीं दिखाया। अक्षीय बायोमैकेनिकल विशेषताओं को बिल्कुल नहीं बदला गया था, और लंबाई की प्रति इकाई बल में केवल थोड़ी कमी देखी गई थी जिसे अंग रेडियल रूप से सहन कर सकता है। इसलिए हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि 1 kGy अंग पर न्यूनतम, यदि कोई हो, प्रभाव के साथ डीसेल्युलराइज्ड खरगोश श्वासनली की पूर्ण नसबंदी प्राप्त करता है।

Introduction

एक इम्प्लांट की नसबंदी इसकी व्यवहार्यता के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है; वास्तव में, कृत्रिम अंग जो सफल साबित हुए हैं, वे बाँझ क्षेत्रों (रक्त वाहिकाओं, हृदय, हड्डी, आदि) में प्रत्यारोपित हैं। 1. श्वासनली में दो सतहें होती हैं: बाहरी वातावरण के संपर्क में एक सतह, जो इसलिए बाँझ नहीं है, और मीडियास्टिनम की ओर एक सतह, जो बाँझ है। इसलिए, जिस क्षण से श्वासनली निकाली जाती है, यह एक बाँझ अंग नहीं है। अधिकतम बाँझ स्थितियों में किए जा रहे बाद के विकोशिकीयकरण प्रक्रिया के बावजूद, यह नसबंदी चरण2 नहीं है। अपने आप में विदेशी सामग्री के आरोपण में प्रोबैक्टीरियल माइक्रोएन्वायरमेंट के कारण संक्रमण काखतरा होता हैजो दाता से प्राप्तकर्ता तक रोग संचरण का 0.014% तक जोखिमपैदा करता है, भले ही सामग्री को निष्फल कर दिया गया हो। श्वासनली के सही वैस्कुलराइजेशन को सुनिश्चित करने के लिए, लगभग सभी प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल में, यह पहले एक बाँझ क्षेत्र (मांसपेशियों, प्रावरणी, ओमेंटम, चमड़े के नीचे, आदि) में हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण 5,6,7 से गुजरता है; ऐसा इसलिए है क्योंकि इस माध्यम में एक गैर-बाँझ तत्व को प्रत्यारोपित करने से क्षेत्र3 का संक्रमण होगा।

बाँझ प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए संभावित रणनीतियों की एक श्रृंखला है। सुपरक्रिटिकल सीओ2का उपयोग करके टर्मिनल नसबंदी 8,9 हासिल की है। अन्य तरीकों, जैसे पराबैंगनी विकिरण या पेरासिटिक एसिड, इथेनॉल, ऑक्सीजन पेरोक्साइड और इलेक्ट्रोलाइज्ड पानी जैसे पदार्थों के साथ उपचार, ने नसबंदी में अलग-अलग सफलता दर प्राप्त की है, लगभग हमेशा उनकी खुराक के आधार पर, लेकिन उन्हें प्रत्यारोपण की बायोमैकेनिकल विशेषताओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। दरअसल, कुछ पदार्थ, जैसे एथिलीन ऑक्साइड, प्रत्यारोपित मैट्रिक्स की संरचना को काफी हद तक बदल सकते हैं और यहां तक कि अवांछनीय इम्युनोजेनिक प्रभाव भी पैदा कर सकते हैं। इस कारण से, इनमें से कई रणनीतियों को जैविक मॉडल 2,10,11,12,13 पर लागू नहीं किया जा सकता है।

सबसे व्यापक रूप से अध्ययन और स्वीकृत नसबंदी रणनीति आईएसओ 11737-1: 2006 मानक द्वारा मनुष्यों में प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों की नसबंदी के लिए स्थापित है, जिसमें 25 केजी की गामा विकिरण खुराक है। हालांकि, यह विनियमन केवल निष्क्रिय, गैर-जैविक तत्वों14,15 की नसबंदी पर केंद्रित है। इसके अतिरिक्त, कार्सिनोमा के कट्टरपंथी उपचार में रेडियोथेरेपी की खुराकचिकित्सा उपकरणों को निष्फल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में परिमाण के तीन आदेश कम हैं। इसे ध्यान में रखते हुए, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि उक्त खुराक न केवल माइक्रोबायोटा को मार देगी, बल्कि प्रत्यारोपण की जैविक संरचना को भी नष्ट कर देगी और मौलिक रूप से बदल देगी। इस बात की भी संभावना है कि यह क्षरण पर अवशिष्ट लिपिड उत्पन्न करेगा, जो संभावित रूप से साइटोटोक्सिक हो सकता है और मचान 13,14,15,16,17 के एंजाइमेटिक क्षरण को तेज कर सकता है, तब भी जब 1.9 kGy जितनी कम खुराक का उपयोग किया जाता है और प्राप्त विकिरण खुराक के सीधे आनुपातिक क्षति होती है।

इस प्रकार, इस पेपर का उद्देश्य विकिरण खुराक की पहचान करने की कोशिश करना है जो विकिरण 2,18,19 के कारण न्यूनतम हानिकारक प्रभावों के साथ बाँझ प्रत्यारोपण प्राप्त करने की अनुमति देता है। हमने जिस रणनीति का पालन किया, उसमें नकारात्मक संस्कृति प्राप्त करने तक किलोग्रे (0.5, 1, 2, 3 केजी, आदि) की एक सीमा के भीतर अलग-अलग बढ़ी हुई खुराक पर विकोशिकीय और विकिरणित श्वासनली का विकिरण शामिल था। नसबंदी की पुष्टि करने के लिए उन खुराकों के लिए अतिरिक्त परीक्षण किए गए थे जिन्होंने नकारात्मक संस्कृतियों को प्राप्त किया था। नसबंदी प्राप्त करने के लिए न्यूनतम खुराक निर्धारित करने के बाद, श्वासनली पर विकिरण के संरचनात्मक और बायोमैकेनिकल प्रभाव की जांच की गई। सभी मैट्रिक्स की तुलना नियंत्रण देशी खरगोश श्वासनली के साथ की गई थी। निर्माण की नसबंदी का परीक्षण तब न्यूजीलैंड के सफेद खरगोशों में श्वासनली को प्रत्यारोपित करके विवो में किया गया था।

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Protocol

प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूरोपीय निर्देश 20170/63 / यूरोपीय संघ का पालन किया गया था और अध्ययन प्रोटोकॉल को वालेंसिया विश्वविद्यालय की आचार समिति (कानून 86/609 / ईईसी और 214/1997 और वेलेंसिया, स्पेन सरकार के कोड 2018 / वीएससी / पीईए / 0122 टाइप 2) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. श्वासनली विकोशिकीयकरण

नोट: विकोशिकीयकरण विधि कहीं और रिपोर्ट की गईहै 20.

  1. सीमांत कान की नस के माध्यम से 200 मिलीग्राम / एमएल इंजेक्शन का उपयोग करके 133 मिलीग्राम / किलोग्राम पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ 3.5-4.1 किलोग्राम वजन वाले दाता नर वयस्क न्यूजीलैंड सफेद खरगोशों (ओरिक्टोलागस क्यूनिकुलस) को इच्छामृत्यु दें।
  2. सड़न रोकनेवाली स्थितियों को सुनिश्चित करते समय, एक केंद्रीय अनुदैर्ध्य सर्विकोटॉमी करें, गर्भाशय ग्रीवा की मांसपेशियों को विच्छेदित करें, और श्वासनली से संपर्क करें। अंग को परिधीय और अनुदैर्ध्य रूप से विच्छेदित करें। अंत में, पहली अंगूठी के नीचे और कैरिना के ठीक ऊपर।
  3. एक स्केलपेल के साथ, श्वासनली को 2 सेमी टुकड़ों में विभाजित करें। कैंची के साथ, आसपास के संयोजी ऊतक और आंतरिक श्लेष्म परत6 को हटा दें।
  4. नमूनों को फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) समाधान के 12 मिलीलीटर में डुबोएं जिसमें 2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5% एम्फोटेरिसिन बी शामिल हैं।
  5. श्वासनली को कमरे के तापमान पर 5 सप्ताह के लिए 400 आरपीएम पर चुंबकीय हलचल के साथ लगातार हिलाने के अधीन करें। आसुत जल में श्वासनली के विसर्जन के माध्यम से, 2 घंटे के आसमाटिक झटके के बाद साप्ताहिक रूप से विकोशिकीय समाधान को प्रतिस्थापित करें।
  6. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजिंग कंटेनर में 80% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 20% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 12 एमएल मिश्रण का उपयोग करके नमूनों को क्रायोजेनाइज करें।
  7. जब श्वासनली का उपयोग किया जा रहा हो (13-15 दिनों के बाद), उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं और पिघलने के बाद उन्हें पीबीएस में डुबोकर धो लें।

2. नसबंदी

  1. किरणन
    1. पीबीएस से भरे टी 25 कल्चर फ्लास्क में 2 सेमी माप वाले चार श्वासनली के टुकड़ों के बैच को पीबीएस से भरे 20 मिलीलीटर मेथैक्रिलेट में रखें जब तक कि कुल मात्रा 30 एमएल तक न पहुंच जाए। बुलबुले को बनने से रोकने के लिए ध्यान रखें, जो वायु-तरल इंटरफ़ेस में ऊर्जा प्रसार का कारण बन सकता है।
    2. एक रैखिक त्वरक का उपयोग करके विकिरण का संचालन करें, जिसमें 10 एमवी चपटे फिल्टर मुक्त बीम की नाममात्र ऊर्जा के फोटॉन हैं। आइसोसेंटर पर प्रति मिनट 2,400 मॉनिटर इकाइयों की खुराक दर लागू करें, श्वासनली को विकिरणित करने के लिए 100 सेमी की स्रोत-सतह की दूरी पर रखें, जिसमें 10 सेमी x 10 सेमी के विकिरण क्षेत्र के लिए 2.5 सेमी क्षेत्र की गहराई हो - ताकि पूरे कंटेनर को कवर किया जा सके- 24 Gy / min की खुराक के अनुरूप।
    3. प्रत्येक चार टुकड़े बैच के साथ खुराक बढ़ाएं; नसबंदी होने तक चार टुकड़ों को 0.5 kGy, चार से 1 kGy, चार से 2 kG, आदि के अधीन किया जाएगा।
  2. संस्कृति
    1. एंटीबायोटिक दवाओं या एंटीफंगल के बिना निष्क्रिय 10% एफबीएस के साथ डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 30 एमएल में टुकड़ों को पेश करें।
    2. उन्हें 2 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक मानक ऊतक इनक्यूबेटर में कल्चर करें और हर 24 घंटे में उनका निरीक्षण करें।
      नोट: संदूषण पैरामीटर संस्कृति माध्यम के पीएच में परिवर्तन हैं और, तदनुसार, माध्यम के रंग और टर्बिडिटी में परिवर्तन हैं। श्वासनली को रोगाणु-मुक्त लागोमोर्फ से काटा गया था, जो बीमार नहीं थे और इस प्रकार, उनके श्वासनली में एनारोबिक बैक्टीरिया से रहित होने की उम्मीद थी।

3. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

नोट: हेमटोक्सीलिन और ईओसिन21, मैसन के ट्राइक्रोम और ऑर्सिन22 का उपयोग करके टुकड़ों को दाग दें।

  1. DAPI धुंधला हो जाता है।
    1. DAPI (4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल) का उपयोग करके ऊतक व्यवहार्यता निर्धारित करें। यह नीला-फ्लोरोसेंट दाग डीएनए अनुक्रमों में एडेनिन- और थाइमिन-समृद्ध क्षेत्रों को दृढ़ता से बांधता है, और इसलिए डीएनए को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखने की अनुमति देता है।
    2. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में ऊतक के नमूने एम्बेड करें।
    3. क्रायोस्टैट का उपयोग करके नमूने काटें।
    4. OCT को हटाने के लिए आसुत जल में तीन बार रंगने के लिए नमूने को धोएं। बढ़ते माध्यम में रखें जिसमें DAPI का 30 nM घोल शामिल हो।
    5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रतिदीप्ति की कल्पना करें।
  2. डीएनए सामग्री विश्लेषण
    1. स्केलपेल का उपयोग करके लगभग 3 मिमी लंबी श्वासनली के खंडों को काट लें।
    2. प्रोटीन के (सामग्री की तालिका) में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, डीएनए निष्कर्षण किट के साथ डीएनए निकालें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 पर अवशोषण को मापकर डीएनए की एकाग्रता निर्धारित करें।
    5. बायोएनालाइजर के साथ केशिका क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके निकाले गए डीएनए नमूनों के आकार को मापें।

4. बायोमैकेनिकल अध्ययन

नोट: अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ बलों के लिए श्वासनली प्रतिरोध अक्षीय तन्यता और रेडियल संपीड़न परीक्षण23 के माध्यम से मापा जाता है।

  1. श्वासनली का माप।
    1. वर्नियर कैलिपर का उपयोग करके श्वासनली की लंबाई, दीवार की मोटाई और बाहरी व्यास को मापें।
    2. प्रत्येक चर के तीन यादृच्छिक मापों से औसत मूल्यों की गणना करें।
    3. रेडियल संपीड़न परीक्षणों में, उस बिंदु का पता लगाकर एंटेरोपोस्टीरियर व्यास की गणना करें जिस पर प्लेट नमूने के संपर्क में आती है।
    4. कमरे के तापमान पर सभी परीक्षण करें।
  2. तन्यता परीक्षण
    1. 100 एन लोड (0.1 एन बल रिज़ॉल्यूशन, 0.001 मिमी स्थिति और 0.1 एस) से लैस कर्षण डेस्कटॉप यूनिवर्सल टेस्टिंग मशीन (यूटीएम) विस्थापन नियंत्रण पर तन्यता परीक्षण करें। परीक्षण मशीन बल और स्थिति सेंसर से लैस है, और विशेष रूप से निर्माता23 द्वारा डिज़ाइन किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है।
    2. हर 0.4 सेकंड में डेटा रिकॉर्ड करें और स्प्रेडशीट पर निर्यात करें।
    3. शुद्ध मोनोलेयर, गैर विषैले क्रिस्टल पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) खोखले ट्यूबों से खरगोश श्वासनली के औसत कैलिबर के अनुकूल तन्यता जबड़े का निर्माण करें, जिसमें 1 सेमी का बाहरी व्यास और 1.5 मिमी की दीवार मोटाई हो।
    4. खंड 3 सेमी लंबे खंडों में संचालित होता है।
    5. टांके के कारण पूर्वाग्रह को रोकने के लिए टर्मिनो-टर्मिनल सीवन के लिए 12 पूर्वनिर्मित छेद, जबड़े के किनारे से 2 मिमी और 2.5 मिमी की दूरी से अलग करें।
    6. पीवीसी ग्लास ट्यूबों को टर्मिनो-टर्मिनल एनास्टोमोसिस द्वारा खरगोश श्वासनली से संलग्न करें, जिसमें वैकल्पिक पूर्वनिर्मित छेद (हर 5 मिमी), श्वासनली के किनारे से 2 मिमी दूर और 6-0 नायलॉन मोनोफिलामेंट सीवन के माध्यम से निरंतर सीवन हो।
    7. सभी टुकड़ों को 5.0 मिमी / मिनट की विस्थापन दर पर फैलाएं।
    8. चर अधिकतम तनाव (σ अधिकतम, एन / मिमी2 में) और तनाव (εअधिकतम, बिना किसी इकाई के) को रिकॉर्ड करें, साथ ही श्वासनली की मात्रा की प्रति इकाई संग्रहीत ऊर्जा (डब्ल्यू / वोल, एमजे / मिमी में), और यंग के मापांक (ई, एमपीए में)।
  3. रेडियल संपीड़न परीक्षण
    1. बल डेटा (एन), स्थिति (मिमी), और समय (एस) प्राप्त करने के लिए 15 एन लोड सेल (बल संकल्प 0.001 एन, स्थिति 0.001 मिमी और समय 0.1 एस) से लैस संपीड़न डेस्कटॉप यूटीएम पर रेडियल संपीड़न परीक्षण करें। डेटा रिकॉर्ड करें और 0.5 सेकंड के अंतराल पर स्प्रेडशीट पर निर्यात करें।
    2. श्वासनली को निचली प्लेट पर आराम करने वाले झिल्लीदार क्षेत्र के साथ रखें। प्लेट धीरे-धीरे 5 मिमी / मिनट की निरंतर गति से शीर्ष प्लेट की ओर बढ़ती है।
    3. श्वासनली को पूरी तरह से अवरुद्ध करने के लिए आवश्यक नमूने की लंबाई की प्रति इकाई प्रत्येक इकाई की गणना करें (एन / मिमी में एफ ), कठोरता (एमपीए मिमी में आर), और सतह क्षेत्र की प्रति इकाई ऊर्जा (एमजे / मिमी 2 में डब्ल्यू / एस)।

5. सर्जिकल तकनीक

नोट: सर्जिकल तकनीक को व्यापक रूप से कहीं और रिपोर्ट किया गयाहै।

  1. एक बाँझ इंट्राल्यूमिनल पीवीसी स्टेंट, आकार 14 एफआर (जो इसे दीवारों को संपीड़ित किए बिना स्वतंत्र रूप से स्लाइड करने की अनुमति देता है), प्रत्येक छोर पर 3-4 मिमी मार्जिन के साथ रखें।
  2. स्टेंट को पहले कार्टिलेज के इंटरकार्टिलाजिनस स्पेस के माध्यम से 6-0 नायलॉन मोनोफिलामेंट सिलाई के साथ ठीक करें।
  3. खरगोशों को एनेस्थेटाइज करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. इंट्रामस्क्युलर एनाल्जेसिक (35 मिलीग्राम / किलोग्राम केटामाइन) के साथ एक शामक, मांसपेशियों को आराम देने वाला, और एनाल्जेसिक (2.5 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन) के साथ विषयों (3.65-4.05 किलोग्राम नर न्यूजीलैंड सफेद खरगोशों) को प्री-मेडिकेटेड करें।
    2. चीरा क्षेत्र को ऑपरेटिंग ज़ोन से बाहर निकाल दें और बालों को हटाने के लिए सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
    3. एनाल्जेसिक प्लस एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस का प्रबंधन करें: 0.05 मिलीग्राम / किग्रा इंट्रामस्क्युलर ब्यूप्रेनोर्फिन और 10 मिलीग्राम / किग्रा एनरोफ्लोक्सासिन।
    4. प्रत्येक खरगोश के सीमांत कान की नस में एक शिरापरक कैथेटर डालें।
    5. एनेस्थीसिया को प्रोपोफोल के अंतःशिरा 10 मिलीग्राम / किग्रा बोलस के साथ शामिल करें।
    6. तीन-लीड इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, पल्स ऑक्सीमेट्री और नॉनइनवेसिव दबाव माप का उपयोग करके जानवर के महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी करें। एनेस्थीसिया के तहत सूखापन को रोकने के लिए हर 30 मिनट में, आंखों पर शारीरिक सीरम लागू करें।
    7. पैर की अंगुली पिंच विधि का उपयोग करके एनेस्थेटिक प्लेन को सत्यापित करें।
    8. सहज वेंटिलेशन खोए बिना न्यूनतम वायुकोशीय एकाग्रता के 1.5% -2% पर इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें और हीटिंग पैड के साथ खरगोश को थर्मल सहायता प्रदान करें।
  4. आयोडीन आधारित स्क्रब के साथ गोलाकार गति में चीरा क्षेत्र को कई बार कीटाणुरहित करें। हर समय और बाँझ सामग्री के साथ सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में, एक अनुदैर्ध्य 3 सेमी केंद्रीय वक्ष चीरा बनाएं, और पेक्टोरल प्रावरणी और एक पेशी घटक से बने द्विपक्षीय पेडिकेटेड फ्लैप की कटाई करें।
  5. चार खरगोशों में फ्लैप के साथ श्वासनली लपेटें, प्रत्येक हेमिथोरैक्स पर एक (इस प्रकार, कुल आठ श्वासनली)।
  6. जब सर्जरी पूरी हो जाती है, तो आइसोफ्लुरेन प्रशासन को बाधित करके संज्ञाहरण को उलट दें।
  7. पोस्टसर्जिकल अवधि
    1. जानवरों को ऑपरेटिंग रूम में रखें जब तक कि वे संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाएं। जब वे पूरी तरह से ठीक हो जाते हैं, तो उन्हें अन्य खरगोशों के साथ अपने वातावरण में वापस कर दें।
    2. खरगोशों को एंटीबायोटिक दवाओं (2.5% एनरोफ्लोक्सासिन का 0.5 एमएल / किलोग्राम) और एनाल्जेसिक (5 मिलीग्राम / एमएल मेलॉक्सिकैम; 0.05 एमएल / किग्रा मेटाकैम) के साथ 5 दिनों के लिए हर 24 घंटे में इलाज करें।
    3. वांछित समय के लिए प्रत्यारोपण को सीटू में छोड़ दें।
    4. इच्छामृत्यु से पहले, खरगोशों को इंट्रामस्क्युलर एनाल्जेसिक (35 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन) और एक शामक, मांसपेशियों को आराम देने वाला, और एनाल्जेसिक (2.5 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन) के साथ प्री-मेडिकेशन करें। फिर सीमांत कान की नस के माध्यम से 200 मिलीग्राम / एमएल इंजेक्शन का उपयोग करके 133 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ खरगोशों को इच्छामृत्यु दें और श्वासनली की कटाई करें।
    5. श्वासनली पर बायोमैकेनिकल और हिस्टोलॉजिकल परीक्षण करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. आर सॉफ्टवेयर, संस्करण 3.5.3 आर कोर (आर फाउंडेशन फॉर स्टैटिस्टिकल कम्प्यूटिंग 2019) पर बायेसियन विधि द्वारा सभी मॉडलों को समायोजित करें।
  2. कई रैखिक प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करके, एफ और आर को छोड़कर अध्ययन चर का विश्लेषण करें।
  3. एफ और आर चर के लिए, मिश्रित रैखिक प्रतिगमन मॉडल लागू करें। इन मॉडलों में, प्रत्येक श्वासनली के उपचार और स्थिति से संबंधित रुचि के चर के अलावा, एक मोनोटोनिक प्रभाव के रूप में रोड़ा का प्रतिशत और एक यादृच्छिक कारक के रूप में प्रति श्वासनली एक स्वतंत्र शब्द पेश करें।

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Representative Results

विकोशिकीयकरण
DAPI धुंधला होना डीएनए की अनुपस्थिति को दर्शाता है, और वैद्युतकणसंचलन द्वारा किसी भी श्वासनली में 50 ng से अधिक डीएनए मान का पता नहीं लगाया गया था, जिसमें सभी टुकड़े 200 बीपी20 से छोटे थे।

माइक्रोबियल संस्कृति।
0.5 kGy के अधीन आठ टुकड़ों में से दो ने 1 सप्ताह से भी कम समय में रंग परिवर्तन दिखाया। 1 kGy और 2 kGy पर विकिरणित टुकड़ों में से किसी ने भी कोई रंग परिवर्तन नहीं दिखाया (चित्र 1)।

हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
विश्लेषण किए गए किसी भी नमूने में कोलेजन या लोचदार फाइबर वितरण पैटर्न में कोई बदलाव नहीं पाया गया (चित्रा 2)।

विकिरण खुराक का निर्धारण
ऊपर वर्णित परिणामों को देखते हुए, जिससे पता चला कि 0.5 kGy पर विकिरण ने नमूने की नसबंदी सुनिश्चित नहीं की, जबकि 1 kGy और 2 kGy की खुराक ने किया, हमने ऊतक की नसबंदी को प्राप्त करने के लिए न्यूनतम संभव विकिरण खुराक स्थापित की। इसलिए, हमने श्वासनली 2,17,23 पर इस खुराक के बायोमेकेनिकल प्रभाव का परीक्षण किया।

बायोमैकेनिकल अध्ययन
अक्षीय तन्यता परीक्षण
विकिरणित श्वासनली पर तन्यता परीक्षण में प्राप्त डेटा तालिका 1 में दिखाया गया है। चित्र 3 संबंधित तनाव-तनाव वक्रों और टूटने के बिंदुओं को दर्शाता है।

इस प्रकार, नसबंदी उद्देश्यों के लिए गामा विकिरण के लिए श्वासनली के टुकड़ों को अधीन करना, पता लगाए गए मूल्यों में थोड़ी वृद्धि के बावजूद, अंगों की अक्षीय बायोमैकेनिकल विशेषताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं डालता है। इसलिए, दोनों अधिकतमσ जो श्वासनली सहन कर सकते हैं (0.05 एमपीए; सीआई [-0.046, 0.144] एमपीए), साथ ही εअधिकतम (0.096 सीआई [-0.096, 0.281]), (0.022 एमपीए; सीआई [-0.23, 0.274] एमपीए), और डब्ल्यू / वॉल्यूम (0.044 एमजे / मिमी3 से; सीआई [-0.018, 0.106] एमजे / मिमी3), इस नमूने में बहुत कम वृद्धि हुई है, लेकिन किसी भी मामले में जनसंख्या अनुमान पर लागू नहीं है।

रेडियल संपीड़न परीक्षण
देशी श्वासनली (नियंत्रण) और विकोशिकीय, क्रायोसंरक्षित और विकिरणित श्वासनली दोनों पर किए गए संपीड़न परीक्षण तालिका 2 में दिखाए गए हैं। संबंधित रेखांकन चित्र 4 में देखा जा सकता है।

गामा विकिरण लंबाई की प्रति इकाई चर बल में रेडियल बायोमैकेनिकल विशेषताओं में केवल न्यूनतम लेकिन महत्वपूर्ण कमी का कारण बनता है, जो -0.017 एन / मिमी से भिन्न होता है; सीआई [-0.042, -0.004] एन / मिमी, जबकि डब्ल्यू / वॉल्यूम (0.044 एमजे / मिमी3) में न्यूनतम भिन्नताएं पाई गईं; सीआई [-0.018, 0.106] एमजे / मिमी3), आर (-0.018 एमपीए · मिमी; सीआई [-0.145, 0.083] एमपीए · मिमी), और डब्ल्यू / एस (-0.081 एमजे / मिमी2; सीआई [-0.95, 0.74] एमजे / मिमी2), जनसंख्या अनुमान (चित्रा 5) पर लागू नहीं होते हैं।

प्रत्यारोपण
मैक्रोस्कोपिक परीक्षा
पोस्टऑपरेटिव अवधि के दौरान किसी भी जानवर ने भड़काऊ या संक्रामक लक्षण नहीं दिखाए; उनके आहार को योजना के अनुसार बहाल किया गया था और एंटीबायोटिक दवाओं और एनाल्जेसिक को पांचवें दिन निलंबित कर दिया गया था। इच्छामृत्यु पर, श्वासनली और फ्लैप का एकीकरण मैक्रोस्कोपिक रूप से देखा गया था, जिसमें सूजन के कोई संकेत दिखाई नहीं दे रहे थे।

हिस्टोलॉजिकल परीक्षा
हिस्टोलॉजिकल परीक्षण से पता चला कि फ्लैप अत्यधिक संगठित संयोजी ऊतक बनाता है - श्वासनली के छल्ले से निकटता से जुड़ा हुआ है, उनके और ऊतक के बीच निरंतरता दिखा रहा है - देशी श्वासनली के पेरिकॉन्ड्रियम के रूप में। उपास्थि बरकरार थी और नेक्रोसिस के कोई संकेत नहीं दिखाए। इसके अलावा, मैक्रोफेज और चादरें बनाने वाली कुछ पृथक विशाल कोशिकाओं की उपस्थिति देखी गई। ईोसिनोफिल की दुर्लभ उपस्थिति के अलावा, सामान्य पोस्टसर्जिकल हल्के तीव्र भड़काऊ सेलुलरिटी देखी गई (चित्रा 6)। श्वासनली के आसपास प्रारंभिक नियोवैस्कुलराइजेशन भी देखा गया था।

बायोमैकेनिकल मूल्यांकन
लागोमोर्फ में प्रत्यारोपित होने के बाद, श्वासनली की विशेषताएं अपरिवर्तित रहीं, प्रति इकाई लंबाई बल को छोड़कर, जिसने प्रत्यारोपण के केवल 2 सप्ताह बाद देशी श्वासनली की विशेषताओं को पुनर्प्राप्त किया (0.006 एन / मिमी, सीआई [-0.026, 0.04] एन / मिमी) (चित्रा 7)।

Figure 1
चित्रा 1: एंटीबायोटिक दवाओं या एंटीफंगल के बिना डीएमईएम में विकिरणित श्वासनली। बाईं ओर दो नमूनों का रंग (0.5 kGy) बदल गया है, जो पीएच में बदलाव का संकेत देता है, और बैक्टीरिया के विकास का एक अप्रत्यक्ष संकेत है। बाईं ओर पहले नमूने में मैलापन भी बढ़ गया है। दाईं ओर के दो नमूने (1 kGy) कोई रंग परिवर्तन नहीं दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: श्वासनली को अलग-अलग खुराक पर विकिरणित और विकिरणित किया जाता है। प्रत्येक पंक्ति एक अलग धुंधलापन से मेल खाती है और प्रत्येक कॉलम अलग-अलग नसबंदी खुराक से मेल खाती है। 1) हेमटोक्सिलिन-ईओसिन। उपास्थि, म्यूकोसा, सबम्यूकोसा और सेरोसा का मनोरम दृश्य। 2) मैसन का ट्राइक्रोम दाग। श्वासनली उपश्लेष्मा। 3) हेमटोक्सिलिन-ईओसिन। श्वासनली उपास्थि का विस्तृत दृश्य। (ए) गैर-विकिरणित श्वासनली (नियंत्रण)। (बी) श्वासनली 0.5 kGy पर विकिरणित होती है। (ग) श्वासनली को 1 kGy पर विकिरणित किया जाता है। (डी) श्वासनली 2 किलो पर विकिरणित होती है। विकिरण खुराक के संबंध में उद्देश्य हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों की अनुपस्थिति देखी जाती है। संक्षिप्त नाम: एन = देशी श्वासनली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विकोशिकीय और विकिरणित श्वासनली के लिए तनाव-तनाव वक्र। ब्रेकिंग पॉइंट को नारंगी रंग में चिह्नित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विकोशिकीय और विकिरणित श्वासनली में कर्षण परीक्षणों के अनुरूप रोड़ा के प्रतिशत के लिए वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विकिरण के लिए बायोमैकेनिकल प्रतिक्रिया। (ए) विकिरण इंटरैक्शन के रोड़ा के प्रतिशत के अनुसार, लंबाई की प्रति इकाई परिवर्तनीय बल पर सीमांत प्रभाव का ग्राफ। (बी) विकिरण इंटरैक्शन के रोड़ा के प्रतिशत के अनुसार, लंबाई की प्रति इकाई परिवर्तनीय बल पर सीमांत प्रभाव का ग्राफ। (सी) विकिरण चर के लिए प्रति यूनिट क्षेत्र मॉडल में संग्रहीत ऊर्जा का आंशिक निर्भरता प्लॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 2 सप्ताह में प्रत्यारोपित श्वासनली का दृश्य । (ए) मैसन का ट्राइक्रोम धुंधला। तंतुओं और कोशिकाओं की संकेंद्रित परतों में व्यवस्थित श्वासनली की बाहरी सतह के नवगठित संयोजी ऊतक को देखा जाता है। (बी) हेमटोक्सिलिन-ईओसिन। पूरी तरह से संरक्षित उपास्थि का मनोरम दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: 2 सप्ताह में प्रति इकाई लंबाई बल और रोड़ा और नियंत्रण (देशी) श्वासनली बनाम श्वासनली प्रत्यारोपण के प्रतिशत के बीच बातचीत के सीमांत प्रभावों का ग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: विकिरणित श्वासनली पर तन्यता परीक्षण। नियंत्रण देशी खरगोश श्वासनली हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: विकिरणित, विकोशिकीय श्वासनली पर संपीड़न परीक्षण। नियंत्रण देशी खरगोश श्वासनली हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

कई नसबंदी रणनीतियां मौजूद हैं। सुपरक्रिटिकल सीओ2पूरी तरह से ऊतकों में प्रवेश करता है, माध्यम को अम्लीय करता है और प्रत्यारोपण 8,14,25 के डिप्रेशराइजेशन के माध्यम से सरल उन्मूलन के साथ सेलुलर फॉस्फोलिपिड बाइलेयर का पुनर्निर्माण करता है। पराबैंगनी विकिरण का भी उपयोग किया गया है, और कृंतक श्वासनली में इसकी प्रभावशीलता प्रकाशित की गई है, हालांकि साहित्य10 में केवल कुछ रिपोर्टें हैं। उपयोग की जाने वाली अन्य विधियों में पेरासिटिक एसिड, इथेनॉल, ऑक्सीजन पेरोक्साइड, या इलेक्ट्रोलाइज्ड पानी जैसे पदार्थों का आवेदन शामिल है, जिन्होंने अनियमित परिणाम दिए हैं और ऊतक11,12 को बहुत प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। उपर्युक्त रणनीतियों के विपरीत, गामा विकिरण को न केवल नसबंदी के मामले में पूरी तरह से प्रभावी दिखाया गया है, बल्कि इसकी खुराक और स्टरलाइज़िंग प्रभाव दोनों के संबंध में पूरी तरह से और प्रचुर मात्रा में अध्ययन किया गया है। वास्तव में, इसका इतना अध्ययन किया गया है कि नसबंदी में गामा विकिरण के उपयोग के लिए एक आईएसओ मानक है, जिसमें मनुष्यों में प्रत्यारोपित की जाने वाली अक्रिय सामग्री की नसबंदी के लिए खुराक 25 kGy13,14,15 पर स्थापित की गई है।

दूसरी ओर, स्टरलाइज़िंग सामग्री के अलावा, विकिरण को तकनीक की सीमा के रूप में संपार्श्विक प्रभाव पैदा करने के लिए भी दिखाया गया है। इनमें कोलेजन सहित प्रोटीन अणुओं को विकृत करके और अवशिष्ट अणुओं को उत्पन्न करके मैट्रिसेस का विनाश और परिवर्तन शामिल है, जो विषाक्त भी हो सकते हैं। अंग संरचना का यह क्षरण परिणामस्वरूप इसकी जैविक और बायोमैकेनिकल विशेषताओं दोनों को प्रभावित करता है, विकिरण के हानिकारक प्रभाव सीधे इसकी खुराक के आनुपातिक होते हैं और अपेक्षाकृत कम खुराक 13,14,15,16,17 पर देखे जाते हैं। यहां, उद्देश्य इसलिए दो गुना था: एक तरफ, एक व्यवहार्य प्रत्यारोपण सुनिश्चित करने के लिए एक बाँझ निर्माण प्राप्त करना, और दूसरी तरफ मैट्रिक्स की जैविक और बायोमैकेनिकल विशेषताओं को संरक्षित करना, क्योंकि प्रत्यारोपण व्यर्थ होगा जब तक किदोनों को बनाए नहीं रखा जाता है। इस प्रकार, चुनौती एक रणनीति का चयन कर रही थी जो सफल नसबंदी और ऊतक संरचना के संरक्षण के बीच संतुलन की अनुमति देती थी।

यहां, नसबंदी के लिए न्यूनतम खुराक के रूप में 1 kGy स्थापित किया गया था। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा से पता चला कि विकिरण की इस खुराक का ऊतक पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। इसके अलावा, विकिरणित श्वासनली के बायोमैकेनिकल लक्षण वर्णन ने निर्धारित किया कि विकिरण के उपयोग से कर्षण मापदंडों पर बिल्कुल कोई फर्क नहीं पड़ता है। प्रति इकाई लंबाई बल में मामूली लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी थी जिसे श्वासनली रेडियल संपीड़न परीक्षणों में सहन करने में सक्षम थी, हालांकि यह इसकी अन्य रेडियल विशेषताओं को प्रभावित नहीं करता है।

जबकि कुछ पेपर हैं जो नसबंदी की असंभवता और 1.5 kGy 19 जितनी कम खुराक के कारण होने वाले विनाश पर चर्चा करते हैं, विशाल बहुमत प्रस्तुत डेटा 2,18,19 के अनुरूप हैं। इस तरह, लेखकों का मानना है कि 10, 15, 20 और 25 केजी की खुराक पर हड्डी को स्टरलाइज़ करने से पूर्ण नसबंदी प्राप्त होती है, हालांकि सेल इनक्यूबेशन क्षमता में कमी और 15 केजी18 से अधिक खुराक पर कोलेजन क्षरण उत्पादों में वृद्धि के बदले में। 1.5 केजी की एक खुराक ने डीसेल्युलराइज्ड हृदय वाल्व में नसबंदी प्राप्त नहीं की, लेकिन विवो और इन विट्रो दोनों में नमूनों के यांत्रिक गुणों को नुकसान पहुंचाया; इस बीच, 3 kGy की एक खुराक ने नसबंदी हासिल की, लेकिन विघटन और फाइब्रोसिस19 का कारण बना। श्वासनली के संबंध में, जॉनसन एट अल ने 5 kGy की खुराक के साथ 25 kGy की आईएसओ खुराक पर नसबंदी के प्रभावों की तुलना की। दोनों खुराक ों ने टर्मिनल नसबंदी प्राप्त की, जिसमें 5 केजी की खुराक ने नमूने की संरचना को थोड़ा बदल दिया और 25 केजी की खुराक ने श्वासनली2 को पूरी तरह से नष्ट कर दिया।

इसके अलावा, 2 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के संबंध में संक्रामक घटनाओं की अनुपस्थिति के कारण प्रभावी नसबंदी की पुष्टि की जाती है, जिसमें अंगों द्वारा नसबंदी पूरी तरह से सहन की जाती है। इसके अलावा, संरचना पूरी तरह से संरक्षित थी, जिसमें कोई परिगलन या अंग का विकृतीकरण नहीं था। इसके अलावा, एक अतिरिक्त खोज के रूप में, यह देखा गया कि बायोमेकेनिकल विशेषताओं में मामूली परिवर्तन - उस बल तक जो श्वासनली प्रति इकाई लंबाई को सहन करने में सक्षम है - आरोपण के केवल 2 सप्ताह बाद देशी श्वासनली के मूल्यों पर लौट आया; इसलिए, निर्माण के अंतिम प्रबंधन के अनुसार इस प्रभाव की अवहेलना की जा सकती है।

इसलिए, यह पेपर 25 kGy की अनुशंसित खुराक की तुलना में बहुत कम खुराक पर पूरी तरह से बाँझ अंगों को प्राप्त करने की संभावना प्रस्तुत करता है; प्रस्ताव 1 kGy की खुराक के साथ न्यूजीलैंड खरगोश श्वासनली की नसबंदी की समस्या का निवारण करता है। यह खुराक सुनिश्चित करती है कि इन अंगों की हिस्टोलॉजिकल, अल्ट्रास्ट्रक्चरल और बायोमेकेनिकल विशेषताओं को बनाए रखा जाता है, और आरोपण के लिए सही सहिष्णुता दिखाता है। अध्ययन की एक सीमा यह है कि यह केवल निष्फल खरगोश श्वासनली पर आयोजित किया जाता है, जिसे आमतौर पर आकार में छोटा होने के कारण कम खुराक की आवश्यकता होती है; हालांकि, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि निष्क्रिय प्रत्यारोपण के लिए आईएसओ मानक में स्थापित अत्यधिक उच्च आंकड़े डीसेल्युलराइज्ड ट्रेकिआ की नसबंदी के लिए आवश्यक नहीं हैं, इस प्रकार ऊतक को बहुत कम नुकसान के कारण एक बड़ी उपलब्धि है। इसके अलावा, भविष्य के अध्ययनों में, जानवर के आधार पर, और इसलिए इसकी श्वासनली के आकार पर, इन खुराकों को बहुत कम खुराक में समायोजित किया जा सकता है जो परिणामस्वरूप अंग की संरचना और कार्य का अधिक सम्मान करते हैं।

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Disclosures

किसी भी लेखक के हितों का टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस पेपर को 2018 स्पैनिश सोसाइटी ऑफ थोरेसिक सर्जरी ग्रांट टू नेशनल मल्टीसेंट्रिक स्टडी [नेस्टर जे मार्टिनेज-हर्नांडेज़ को सम्मानित संख्या 180101] और पीआई 16-01315 [मैनुअल माटा-रोइग को सम्मानित] द्वारा समर्थित किया गया था। CIBERER को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष की सहायता से VI राष्ट्रीय आर एंड डी एंड आई योजना 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, कंसोलिडर प्रोग्राम, CIBER Actions, और इंस्टीट्यूटो डी सलूद कार्लोस III द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 nylon monofilament suture  Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA SN-5698G
Amphotericin B 5% Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA 15290018
Bioanalyzer Agilent, Santa Clara, CA, USA G2939BA
Buprenorphine Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido N02AE01
Compression desktop UTM Microtest, Madrid, Spain EM1/10/FR
Cryostate Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania CM3059
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich; MO, USA D2650
DMEM  Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA 11965084
DNA extraction kit DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany 4368814
Enrofloxacin, 2.5% Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany 0035-0002
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain SH20898.03IR
Fluorescence microscope Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) DM2500??
Freezing Container  Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain  5100-0001
Isofluorane Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain  8.43603E+12
Ketamin Imalgene. Merial; Toulouse, Francia BOE127823
Linear accelerator  "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA H191001
Magnetic stirrer Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany 6283-MV
Penicillin-streptomycin 5% Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA 15140122
Pentobarbital sodium Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España 3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich; MO, USA P2272
Propofol Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania G 151030
Proteinase K Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA S3020
PVC hollow tubes Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy hhdddyyZ
PVC stent  ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey 019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core R Foundation for Statistical Computing R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich; MO, USA 8,17,034
Spectrophotometer Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands ND-ONEC-W
Spreadsheet Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA 2864993241
Traction Universal Testing Machine  Testing Machines, Veenendaal, Netherlands 84-01
UTM Software TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA  100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium  Vector Labs, Burlingame; CA; USA H-1000-10
Xylacine Xilagesic. Calier; Barcelona, España 20102-003

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References

  1. Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
  2. Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
  3. de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
  4. Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
  5. Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
  6. Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
  7. Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
  8. White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
  9. Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
  10. Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
  11. Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
  12. Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
  13. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  14. Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
  15. AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
  16. Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
  17. Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
  18. Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
  19. Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
  20. Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  22. López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
  23. Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
  24. Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
  25. Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
  26. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).

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