Summary
Der fremlægges en protokol til bestemmelse af biomarkører med lav forekomst fra tørrede serumprøver eksemplificeret med biomarkøren progastrinfrigivende peptid (ProGRP). Antistofbelagte magnetiske perler anvendes til selektiv oprydning og berigelse af et proteotypisk ProGRP-peptid. Det fangede peptid analyseres efterfølgende ved væskekromatografi-tandem massespektrometri.
Abstract
Dette papir præsenterer en protokol med detaljerede beskrivelser for effektiv prøveoprydning af proteiner med lav overflod fra tørrede prøver. Dette udføres ved hjælp af perlebaseret proteolyse forud for proteotypisk peptidaffinitetsindfangning og væskekromatografi tandemmassespektrometri (LC-MS / MS) bestemmelse. Proceduren kan anvendes på både konventionelle tørrede prøver ved hjælp af papirkort (f.eks. tørrede blodpletter [DBS'er] og tørrede serumpletter [DSS'er]) samt prøver indsamlet med nyere prøveudtagningsmetoder såsom volumetrisk absorberende mikroprøveudtagning (VAMS). Ud over at beskrive denne procedure præsenteres fremstillingen af både trypsinperler og antistofbelagte perler trin for trin i dette arbejde. Fordelene ved den præsenterede procedure er tidseffektiv proteolyse ved hjælp af perler og selektiv robust oprydning ved hjælp af peptidaffinitetsfangst. Den nuværende procedure beskriver bestemmelsen af biomarkøren for småcellet lungekræft (SCLC) med lav forekomst, progastrinfrigivende peptid (ProGRP), i tørret serum (både DSS'er og VAMS). Detaljerede procedurer for perleforberedelse gør det lettere at implementere arbejdsgangen i nye applikationer eller andre laboratorier. Det påvises, at resultaterne kan være afhængige af prøveudtagningsmaterialet. for dette projekt blev der set højere signalintensiteter for prøver indsamlet ved hjælp af VAMS sammenlignet med DSS'er.
Introduction
Mikroprøveudtagning har eksisteret i mere end 100 år, siden Ivar Bang beskrev glukoseovervågning fra DBS'er i 19131. Efter at Guthrie og Susi introducerede DBS'er i 1963 til bestemmelse af phenylalanin hos nyfødte2, er teknikken blevet mere og mere udbredt. De første rapporter om DBS'er til prøveudtagning og opbevaring af proteiner blev lavet i begyndelsen af 1970'erne3,4, og et årti senere, i 1980'erne, fandt vi den første rapport om massespektrometri (MS) til bestemmelse af proteiner fra DBS'er5. På trods af denne tidlige introduktion var det først efter århundredeskiftet, at MS-bestemmelse af proteiner fra DBS'er og andre mikroprøvetagningsteknikker blev mere udbredt.
I klinisk sammenhæng er det af interesse at bestemme proteiner ved diagnosticering og opfølgning af sygdomme samt til behandlingsovervågning og dopingformål. Denne målrettede bestemmelse af proteinanalysander af MS fra små mængder tørrede prøver er stadig udfordrende og kræver ofte omfattende prøveforberedelse forud for analyse.
Målrettet kvantitativ bestemmelse af proteiner ved MS udføres almindeligvis ved at anvende bottom-up-tilgangen, fordøje proteinerne til peptider før analyse. Denne procedure producerer et utal af peptider, hvilket gør direkte analyse af den fordøjede biologiske prøve udfordrende. En måde at omgå dette på er at anvende et selektivt affinitetsoprydningstrin forud for MS-analyse enten før eller efter fordøjelsen 6,7,8. På denne måde isoleres proteinet af interesse (eller dets proteotypiske peptid, hvis affinitetsindfangningstrinnet udføres efter fordøjelsen) selektivt fra prøvematrixen før analyse, hvilket giver lavere detektionsgrænser9.
Mikroprøveudtagning ved hjælp af DBS-kort har visse fordele sammenlignet med konventionelle blodprøver, herunder lavt prøvevolumen, mindre invasiv prøveudtagning og øget opbevaringsstabilitet. Prøvematrixen er imidlertid forskellig og kan medføre andre udfordringer i analysen (f.eks. tørret vs. flydende prøvematrix og kapillærblod vs. serum eller plasma)10,11. En anden udfordring, der observeres med DBS'er, er den såkaldte hæmatokriteffekt, hvor blodhæmatokriten påvirker prøvevolumenet, der behandles yderligere til analyse, og dermed introducerer interindividuel variabilitet i analysen12. Nyere mikroprøveudtagningsenheder, såsom VAMS introduceret i 201413, løser dette problem ved at indsamle et fast volumen blod i stedet for en bloddråbe.
Denne protokol beskriver en opsætning til analyse af biomarkører med lav forekomst fra tørrede mikroprøver. Efter eluering fordøjes den tørrede prøve, og derefter isoleres det proteotypiske peptid ved peptidaffinitetsindfangning. Modelanalysanden er SCLC-biomarkøren ProGRP. Da ProGRP ikke kan bestemmes pålideligt ud fra fuldblod, blev serum anvendt som prøvematrix. Repræsentative resultater fra både DSS'er og serumprøver indsamlet ved hjælp af VAMS vises.
Protocol
Serum fra raske bloddonorer blev anvendt til fremstilling af standardopløsninger. Brugen af serum fra raske bloddonorer blev udført i nøje overensstemmelse med norsk lov. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle forsøgspersoner. Serumprøver blev analyseret ved hjælp af metoder i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. Den beskrevne protokol er en modificeret version af metoden beskrevet i tidligere arbejde14. En oversigt over sammensætningen af buffere og opløsninger, og hvordan man forbereder dem, findes i supplerende tabel S1, mens materialetabellen indeholder materialer, udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. Fremstilling af antistofbelagte magnetiske perler
- Beregn mængden af antistof, der er nødvendigt for at forberede det ønskede antal perler. Brug 1 mg antistof pr. 50 mg magnetiske perler.
BEMÆRK: Typisk anvendes 20 μL af en 20 mg/ml perlesuspension pr. prøve i efterfølgende forsøg (se trin 5.1). - Beregn det antistofvolumen, der er nødvendigt for at forberede det ønskede antal perler.
BEMÆRK: Antistofvolumenet afhænger af antistofkoncentrationen og skal beregnes for hvert antistof. - Det ønskede volumen antistofopløsning overføres til et 5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugeglas. Hvis antistofopløsningen f.eks. indeholder 1 mg/ml antistof, skal du bruge 0,4 ml til at fremstille 1,0 ml perlesuspension (20 mg perler/ml med 1 mg antistof/50 mg perler).
BEMÆRK: Antistofferne skal være i en aminfri buffer. Brug lavproteinbindende mikrocentrifugeglas til alle opløsninger, der indeholder proteiner, for at undgå tab af analysand som følge af adsorption. - Tilsæt en lille magnetisk omrøringsstang til antistofopløsningen, og juster pH-værdien til 2,5 under kontinuerlig omrøring. Brug en pH-måler med en mikroelektrode til at måle pH-værdien og justere pH-værdien ved trinvis tilsætning af definerede volumener på 1,0 M HCl (start med at tilføje 10 μL portioner på 1,0 M HCl og reducer volumenet, når pH-værdien nærmer sig 2,5). Det totale volumen på 1,0 M HCl, der er nødvendigt for at justere pH-værdien til 2,5, registreres.
- Mikroelektroden fjernes og inkuberes det syrnede antistof på is på en magnetisk omrører i 1 time.
BEMÆRK: Syrebehandling af antistoffet udføres for at fremme den korrekte orientering af antistofferne på perlen. Koncentrationen af HCl kan reduceres til 0,5 M eller 0,2 M HCl afhængigt af bufferkoncentrationen i antistofopløsningen. - Neutraliser antistofopløsningen. Brug en pH-måler med en mikroelektrode til at måle pH-værdien og juster pH til 7 ved trinvis tilføjelse af definerede volumener på 1,0 M NaOH (start med en portion på 10 μL og reducer volumenet, når pH nærmer sig 7). Optag det samlede volumen på 1,0 M NaOH tilføjet.
BEMÆRK: Koncentrationen af NaOH skal være den samme som HCl-koncentrationen anvendt i trin 1.4. NaOH er stærkt ætsende; Brug beskyttelsesudstyr, herunder handsker og passende øjenbeskyttelse. - Beregn det ønskede volumen af tosylaktiverede magnetiske perler, der skal bruges.
BEMÆRK: Det anbefales typisk at bruge 20 mg perler/ml ved frakobling i lille skala. Der skal anvendes mindst 5 mg perler. - Bland magnetperleophænget grundigt på en hvirvelblander og træk et volumen ud, der indeholder den ønskede mængde perleophæng. For eksempel skal du for at forberede 1 ml perlesuspension trække et volumen indeholdende 20 mg perler (667 μL, hvis koncentrationen af perler er 30 mg / ml).
- Anbring perleophænget på en magnetrist i 1 min, og fjern supernatanten. Perlerne vaskes 2x med samme volumen type 1 H2O (667 μL, hvis der anvendes en 30 mg/ml perleopløsning til fremstilling af 1 ml 20 mg/ml antistofbelagte perler). Bland med en hvirvelblander efter hver tilsætning af vaskeopløsning og anbring den på magnethylsteret i 1 minut, før supernatanten fjernes.
- Tilsæt følgende til de magnetiske perler: syrebehandlet antistof, 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) (1/5 af det samlede volumen, da den endelige koncentration skal være 0,1 M; dette svarer til 0,2 ml for at forberede 1 ml perlesuspension) og koblingsbuffer til antistofkobling (for at forberede 1 ml antistofbelagte magnetiske perler skal volumenet af koblingsbuffer være lig med 1 ml - volumen syrebehandlet antistof - 0,2 ml boratbuffer). Bland ved hjælp af en hvirvelblander.
BEMÆRK: Volumenet af syrebehandlet antistof svarer til volumenet af antistofopløsning (0,4 ml ved fremstilling af 1 ml perlesuspension ved anvendelse af en 1 mg/ml antistofopløsning) + volumenet af 1,0 M HCl, der bruges til at justere pH til 2,5 + volumenet på 1,0 M NaOH, der bruges til at justere pH til 7).
BEMÆRK: Sammensætningen af 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) og koblingsbuffer til antistofkobling findes i supplerende tabel S1. - Drej ved omgivelsestemperatur natten over ved hjælp af en ende-over-ende prøveblander, helst med gensidig rotation og vibration.
- Centrifuger i 10 min ved 239 × g. Anbring røret på magneten i 2 min, og fjern supernatanten.
- Puds perlerne 2 x 2 timer og en gang natten over ved at rotere opbevaringsbufferen for antistofperler ved omgivelsestemperatur ved hjælp af en ende-over-ende prøveblander. Brug den samme diskenhed som den samlede diskenhed i trin 1.10. Anbring tuben på magneten i 1 min, og fjern supernatanten mellem hver vask.
BEMÆRK: Sammensætningen af opbevaringsbuffer for antistofperler findes i supplerende tabel S1. - Opbevares i den ønskede buffer (f.eks. den samme buffer som i trin 1.13) ved hjælp af den ønskede stamkoncentration af perler (typisk 20 mg/ml). Opbevares i køleskabet.
2. Fremstilling af 2 ml trypsin immobiliserede perler (20 mg / ml perler)
- Tilsæt 20 ml 1 mM HCI til 2 ml NHS-aktiverede agaroseperler for at vaske perlerne.
- Bland og centrifuger ved 2.655 × g i 5 min. Supernatanten fjernes.
- Tilsæt 20 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,8). Bland med en hvirvelblander og centrifuger ved 2.655 × g i 5 min. Supernatanten fjernes.
BEMÆRK: Sammensætningen af 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,8) findes i supplerende tabel S1. - Tilsæt 2 ml 20 mg/ml trypsin (opløst i koldkoblingsbuffer til trypsinkobling).
BEMÆRK: Sammensætningen af koblingsbuffer til trypsinkobling findes i supplerende tabel S1. Opbevar bufferen i køleskabet. - Der inkuberes i 25 minutter ved 22 °C og 1.100 o/min ved hjælp af en temperaturstyret mixer. Der centrifugeres ved 2.655 × g i 5 min. Supernatanten fjernes.
- Der tilsættes 2 ml modifikationsbuffer til fremstilling af trypsinperler og inkuberes i 20 minutter ved 22 °C og 1.100 o/min ved hjælp af en temperaturstyret mixer. Der centrifugeres ved 2.655 × g i 5 min. Supernatanten fjernes.
BEMÆRK: Sammensætningen af modifikationsbufferen til fremstilling af trypsinperler findes i supplerende tabel S1. Opbevar bufferen i køleskabet. - Der tilsættes 10 ml blokerende buffer til fremstilling af trypsinperler og inkuberes i 10 minutter ved 22 °C og 1.100 o/min ved hjælp af en temperaturstyret mixer. Der centrifugeres ved 2.655 × g i 5 min. Supernatanten fjernes.
BEMÆRK: Sammensætningen af blokerende buffer til fremstilling af trypsinperler findes i supplerende tabel S1. Opbevar bufferen i køleskabet. - Tilsæt 2 ml opbevaringsbuffer, bland ved hjælp af en hvirvelblander og opbevar i køleskabet indtil brug.
BEMÆRK: Sammensætningen af opbevaringsbuffer til trypsinperler findes i supplerende tabel S1. Opbevar bufferen i køleskabet.
3. DSS/VAMS-prøveudtagning og efterfølgende ekstraktion af tørret serum
- Forbered standarder ved at spike serumet med ProGRP (eller proteinet af interesse) på det passende niveau. Hold spidsvolumen ≤ 1% af den samlede lydstyrke.
BEMÆRK: Her blev der anvendt en stamopløsning på 295 μg/ml ProGRP i vand til fremstilling af spikede serumstandarder. - Bland standarderne på en hvirvelblander.
- Påfør 10 μL serum (spiked standards) på DBS-kort, eller lad 10 μL serum indsamles af VAMS (10 μL) ved hjælp af producentens retningslinjer. For DSS skal du sørge for, at stedet er inden for den stiplede cirkel.
- Lad det lufttørre ved omgivelsestemperatur i mindst 2 timer.
- Skær hele pletten ud og overfør den til et 2 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør, eller fjern VAMS fra holderen, og anbring det i et 2 ml lavproteinbindende mikrocentrifugeglas.
- Der tilsættes 1.000 μL 100 mM ammoniumbicarbonatopløsning (ABC). Det tørrede serum ekstraheres fra spot/VAMS i 1 time ved 22 °C ved hjælp af en temperaturstyret mixer ved 1.000 o/min.
- Overfør ekstraktet til et nyt 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør til tryptisk proteolyse.
4. Fordøjelse af DSS / VAMS ekstrakter
- Der anvendes 30 μL trypsinperler (som beskrevet i punkt 2) pr. prøve. Et volumen med trypsinperler overføres til alle prøver til et nyt 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugeglas, centrifugeres ved 2,655 × g i 5 minutter, og supernatanten fjernes.
- Vask trypsinperlerne 2x med 1 ml kold 50 mM ABC, før du resuspenderer i samme volumen, som blev pipetteret ud. Der centrifugeres ved 2,655 × g i 5 minutter, og supernatanten fjernes mellem trinnene.
- Tilsæt 30 μL vaskede trypsinperler til hvert DSS / VAMS-ekstrakt for at starte fordøjelsen.
- Der inkuberes i 2 timer ved 37 °C og 1.000 o/min ved hjælp af en temperaturstyret mixer eller lignende. Der centrifugeres ved 2.655 × g i 5 min. og overfør supernatanten (ikke perlerne) til et nyt 2,0 ml lavproteinbindende mikrocentrifugeglas.
- Der tilsættes 25 μL 14 ng/ml intern standardopløsning (IS) indeholdende det stabile isotopmærkede (SIL) peptid ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2] i 100 mM ABC-opløsning.
5. Indfangning af proteotypisk ProGRP-peptid ved anvendelse af antistofbelagte magnetiske perler
- Der anvendes 20 μL antistofbelagte perler (20 mg/ml som fremstillet i afsnit 1) pr. ekstraktion. Overfør alle antistofbelagte perler til et nyt 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør, læg det på magneten i 1 min, og fjern opbevaringsbufferen.
- De magnetiske antistofbelagte perler vaskes med 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, der indeholder 0,05% polysorbat 20, og 2 x 1 ml PBS, før de resuspenderes i samme volumen, som blev pipetteret ud. Bland på en hvirvelblander og læg den på magneten i 1 min mellem bufferudvekslinger.
BEMÆRK: PBS indeholder 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mM KH2PO4. Det anbefales at forberede opløsningen i en 10x koncentration for øget stabilitet. For sammensætningen af 100 ml 10x PBS, se supplerende tabel S1. Fortynding af 10x PBS 10x vil opnå en pH på ~7,4. - Der tilsættes 20 μL vasket magnetisk perlesuspension til hvert lavproteinbindende mikrocentrifugerør, der indeholder et fordøjet DSS/VAMS-ekstrakt og IS. Udfør immunekstraktion i 1 time ved hjælp af en ende-over-ende prøveblander ved omgivelsestemperatur.
- De magnetiske perler vaskes med følgende opløsninger: 500 μL PBS med 0,05% (v/v) polysorbat 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) og 300 μL 100 mM ABC.
- Efter tilsætning af hver vaskeopløsning fjernes det lavproteinbindende mikrocentrifugerør med perler og vaskeopløsning fra magnetstativet og vendes forsigtigt, indtil det er homogent. Derefter placeres det lavproteinbindende mikrocentrifugerør på magneten i 30 sekunder, inverteres i 30 sekunder og placeres på magneten i 1 min. Fjern vaskeopløsningen.
- Drej den resterende suspension ned ved hjælp af en mikrocentrifuge. Placer magneten i 1 min, og fjern den resterende vaskeopløsning.
- Der tilsættes 15 μL 2% (v/v) myresyre i type 1 H2O til hver prøve og inkuberes i 5 minutter ved 22 °C og 1 000 o/min ved hjælp af en temperaturstyret mixer eller lignende for at eluere de opfangede peptider. Sæt magneten på i 1 minut og overfør eluatet til et nyt 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør. Gentag én gang, og overfør det andet eluat til det samme lavproteinbindende mikrocentrifugerør som det første eluat.
- Der tilsættes 20 μL 100 mM ABC til hvert eluat (samlet volumen på 50 μL).
- Der centrifugeres (mikrocentrifuge), og 40 μL eluatet overføres til mikroindsatser til hætteglas med højtydende væskekromatografi (HPLC).
6. Analyse foretaget af LC-MS/MS
- Brug en micro LC triple quadrupole MS med elektrospray ionisering for høj robusthed.
- Forbered LC-MS/MS-systemet til analysen ved at rense pumperne med mobil fase A (20 mM FA i H 2 O og MeCN, 95: 5 v / v) og B (20 mM FA i H2O og MeCN, 5: 95 v / v).
- Indsæt analysekolonnen (C18, 50 mm x 1 mm indvendig diameter [ID], 3 μm partikler).
- Fortsætte med at forberede instrumentet til analyse ved at følge opstartsprocedurerne for det specifikke instrument.
- I instrumentsoftwaren indstilles søjleovnens temperatur til 25 °C og flowhastigheden til 50 μL/min (100 % mobil fase A).
- Søjlen afbalanceres med mobil fase A i mindst 15 min.
- Anbring prøverne i autosampleren.
- Forbered instrumentmetoden til analyse af det ProGRP-specifikke, tryptiske peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK og dets IS.
BEMÆRK: Flere metodeparametre er instrumentspecifikke og skal optimeres på det specifikke instrument, der anvendes. Nærmere oplysninger om de metodeparametre, der anvendes her, er beskrevet i trin 6.9 til 6.11. - For gradientprogrammet i LC skal du bruge følgende indstillinger: strømningshastighed: 50 μL / min; fra tid 0,0 til 3,0 min: 100% mobil fase A; fra tid 3,0 til 18,0 min: kør en lineær gradient fra 0% til 50% mobil fase B; fra tid 18,0 til 18,1 min: øge mobil fase B fra 50% til 100%; fra tid 18,1 til 20,0 min: 100% mobil fase B; fra tid 20,0 til 20,1 min: reducer mobil fase B fra 100% til 0%; fra tid 20,1 til 30 min: 100% mobil fase A for at genbalancere søjlen (brug mindst 10 kolonnevolumener).
- For MS/MS-indstillinger skal du køre MS/MS i positiv tilstand ved hjælp af instrumentindstillinger, der sikrer effektiv ionisering. For at følge denne protokol skal du bruge en sprøjtespænding på +4.000 V, en opvarmet kapillærtemperatur på 270 °C, nitrogen som pladegas (5 vilkårlige enheder) og argon (2 mTorr) til kollisionsinduceret dissociation (CID) fragmentering. Hvis instrumentet tillader det, skal LC-flowet spildes de første 2 min (0-2 min) og de sidste 1 min (29-30 min) af kørslen i stedet for ind i MS.
- Brug udvalgte reaktionsovervågningsovergange (SRM) til (A) signaturpeptidet (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1,005,45→913,3, 1,005,45→1,028,3 og 1,005,45→1,398,5 og (B) IS SIL-peptidet (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1,009,45→921,3, 1,009,45→1,036,3 og 1,009,45→1,406,5. Brug optimeret kollisionsenergi (35 V i denne protokol) til alle overvågede overgange.
- Forbered en sekvens, der indeholder de prøver, der skal køres, ved hjælp af den software, der er tilgængelig til dit LC-MS/MS-system. Indstil injektionsvolumen til 10 μL.
BEMÆRK: Sørg for at tilføje tomme prøver og kvalitetskontrolprøver efter behov. - Tryk på "Kør sekvens" i instrumentsoftwaren for at starte sekvensen.
- Overvåg toparealet af det affinitetsfangede, ProGRP-specifikke, tryptiske peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK og dets IS SIL-peptid.
BEMÆRK: Valg og bekræftelse af signaturpeptidet, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, er beskrevet andetsteds14.
Representative Results
Figur 1 indeholder en oversigt over analysearbejdsgangen ved hjælp af både DSS-prøveudtagning og VAMS. Bortset fra forskellene i prøveudtagningsmetode er procedurerne identiske. Billeder af serumprøven ved hjælp af de to prøveudtagningsmetoder kan ses i figur 2.
Begge prøveudtagningsformer (VAMS og DSS) er egnede til prøveudtagning af ProGRP-holdigt serum. Dette fremgår af figur 3 , hvor MS-kromatogrammer af det proteotypiske peptid og IS SIL-peptidet fra DSS- og VAMS-prøvetagning er vist. Desuden medtages MS-kromatogrammet efter analyse af en kontrolprøve bestående af 10 μL spiked flydende serumprøve, der er behandlet på samme måde som de tørrede prøver. Sidstnævnte blev fortyndet i samme volumen som volumenet af DSS / VAMS-ekstraktionsopløsningen, udsat for fordøjelse ved hjælp af trypsinperler og renset op ved hjælp af peptidaffinitetsfangst.
Sammenligning af VAMS og DSS prøveudtagning (figur 4) giver VAMS et højere proteotypisk peptid / IS-arealforhold end DSS. Dette indikerer, at der kan være et tab af målproteinet ProGRP til papiret, der anvendes til DSS (ren cellulose). Ved sammenligning med en kontrolprøve, hvor serumet ikke tørres før yderligere behandling og analyse (figur 4), vises det, at VAMS giver lignende arealforhold som kontrolprøven (tosidet t-test, s≤ 0,65), hvilket indikerer intet tab for prøvetagningsmaterialet, mens DSS giver et signifikant lavere arealforhold (tosidet t-test, s≤ 0,005), der angiver tab af prøvetagningsmaterialet.
Der blev foretaget en kort evaluering ved hjælp af VAMS. Linearitet blev vist fra 10 til 1.000 ng/ml (R2 = 0,9996) med en detektionsgrænse (LOD, S/N = 3) på 6,7 ng/ml. LOD betragtes som tilfredsstillende, da analysen blev udført på en ret gammel tredobbelt quadrupol (2008) med en 1 mm ID-kolonne. Repeterbarheden af alle niveauer med en S/N-> 10 blev også anset for tilfredsstillende med en RSD mellem 7 % og 17 % (n = 3) ved hjælp af IS-korrektion.
Affinitetsindfangning kan udføres både før og efter fordøjelsestrinnet ved enten at fange proteinet af interesse eller dets proteotypiske peptid. Den nuværende procedure beskriver peptidaffinitetsfangst. En fordel ved denne tilgang sammenlignet med proteinfangst er, at kun peptidet af interesse fanges, og en endnu mere effektiv prøveoprydning opnås. Dette er illustreret i figur 5, der viser et mere komplekst fuldscanningskromatomatgram med mere støj efter proteinindfangning sammenlignet med peptidindfangning. De prøver, der analyseres i figur 5 , udtages ikke ved hjælp af DSS-prøveudtagning eller VAMS; Imidlertid er serum også prøvematrixen, og affinitetsindfangning udføres under anvendelse af det samme antistof, der anvendes til peptidindfangning i den beskrevne procedure.
Figur 1: Oversigt over den analytiske arbejdsgang ved hjælp af både DSS- og VAMS-prøveudtagning. Forkortelser: DSS = tørret serumplet; VAMS = volumetrisk absorptionsmikroprøveudtagning LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af serumprøver ved hjælp af forskellige metoder . (A) DBS cellulosekort og (B) VAMS. Forkortelser: DBS = tørret blodplet; VAMS = volumetrisk absorptionsmikrosampling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative MS-kromatogrammer af det proteotypiske peptid og IS SIL-peptidet efter DSS- og VAMS-prøveudtagning samt for en spiked serumprøve tilsat direkte i ekstraktionsopløsningen. MS-kromatogrammerne viser 10 μL serumprøver tilsat 1,5 μg/ml ProGRP og påført (A) VAMS, (B) celluloseprøvetagningskortet (til DSS) eller (C) direkte på ekstraktionsbufferen (kontrolprøve). Femogtyve mikroliter 14 ng / mlL ER SIL-peptid tilsat til alle prøver før peptidaffinitetsoptagelse. Forkortelser: DSS = tørret serumplet; VAMS = volumetrisk absorptionsmikroprøveudtagning MS = massespektrometri; ProGRP = progastrinfrigivende peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotop-mærket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS-arealforholdet for serumprøver tilsat ProGRP og anvendt (10 μL) på VAMS, DSS eller direkte på ekstraktionsopløsning (kontrolprøve). Koncentrationen af ProGRP er 1,5 μg/ml, n = 4 for hver tilstand; 25 μL 14 ng/mL IS SIL-peptid tilsættes til alle prøver før indfangning af peptidaffinitet. *angiver, at arealforholdet er signifikant forskelligt fra prøver, der anvendes til VAMS (tosidet t-test, p≤ 0,005). Fejlbjælker er ± standardafvigelse. Forkortelser: DSS = tørret serumplet; VAMS = volumetrisk absorptionsmikroprøveudtagning ProGRP = progastrinfrigivende peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotop-mærket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af base peak kromatogrammer (full scan Orbitrap analyse) efter intakt proteinekstraktion (blå) og proteotypisk epitoppeptidekstraktion (rød). Ekstraherede ionkromatogrammer af det proteotypiske epitoppeptid (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) er vist til højre. Serum tilsat 150 ng ml-1 ProGRP blev anvendt som prøve. Denne figur er genoptrykt fra Levernæs et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel S1: En oversigt over sammensætningen af buffere og opløsninger, og hvordan de tilberedes. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den beskrevne protokol indeholder oplysninger om, hvordan man udfører flere vigtige trin i analysen af biomarkører med lav overflod fra tørrede mikroprøver (DSS og VAMS), herunder fremstilling af trypsinperler og antistofbelagte magnetiske perler. Baseret på tidligere erfaringer behandler vi altid antistoffet med syre før perleimmobilisering for at forbedre antistoffernes orientering15.
Et af de kritiske trin i denne procedure er valget af det mest egnede mikroprøveudtagningsformat. Først skal man overveje, om den pågældende analysand kan bestemmes ud fra fuldblod, eller om koncentrationen påvirkes af blodcellerne og skal bestemmes i serum eller plasma (som for modelanalysanden, ProGRP).
Både papir- og polymerbaserede tilgange har fordele og begrænsninger; for ProGRP giver VAMS en klar fordel med hensyn til genvinding af analysand efter ekstraktion fra prøveudtageren. Dette kan dog sandsynligvis optimeres ved hjælp af en anden ekstraktionsløsning til DSS-prøverne. Ikke desto mindre er denne potentielle interaktion mellem analysanden og prøvetagningsmaterialet vigtig at tage i betragtning, da den kan resultere i øget analytisk variation og højere detektionsgrænser. Da den anvendte IS er et SIL-peptid og først tilsættes efter fordøjelsen, korrigerer IS for trinnene efter fordøjelsen (f.eks. Affinitetsekstraktion og LC-MS/MS-analyse). IS-korrektion er ikke mulig for ekstraktion fra DSS / VAMS og fordøjelsestrinnet.
To typer perler anvendes i proceduren: trypsinperler til fordøjelse efter ekstraktion af serumprøven fra prøveudtageren og antistofbelagte magnetiske perler til indfangning af det proteotypiske peptid efter fordøjelse. En væsentlig årsag til at bruge trypsinperler, ud over at fremskynde fordøjelsen, er at minimere resterende trypsinaktivitet i prøven under affinitetsoptagelse. Dette er vigtigt for at undgå tryptisk proteolyse af mAb under affinitetsoptagelse.
Agaroseperler blev brugt til fremstilling af trypsinperlerne, mens magnetiske perler blev brugt til fremstilling af de antistofbelagte perler. Agaroseperler er billigere end magnetiske perler, men har den begrænsning, at adskillelse af perlerne fra opløsningen kræver centrifugering. Dette gør adskillelsen af perler og supernatant mindre effektiv end ved brug af magnetiske perler. Derudover er automatisering af arbejdsgangen vanskelig ved hjælp af agaroseperler. Imidlertid er magnetiske NHS-aktiverede perler tilgængelige og kan bruges til en mere strømlinet og automatiseret prøveforberedelsesarbejdsgang.
Mikroprøveudtagning er en vigtig tendens i bioanalysen af både lægemidler og biomarkører. En udfordring med den nuværende tilgang er den begrænsede mængde prøvevolumen (10 μL), som kan være af særlig betydning ved bestemmelse af analysander med meget lav forekomst såsom ProGRP (pg/ml-lavt ng/ml-niveau). Denne udfordring kan dog omgås ved hjælp af det nyeste analyseudstyr. For disse analysander med lav forekomst er valget af prøveforberedelse afgørende, og selektiv prøveoprydning gennem antistofbaseret affinitetsindfangning er oftest nødvendig. Da peptidindfangning har vist sig at give renere ekstrakter og lavere detektionsgrænser end proteinindfangning (ved anvendelse af det samme antistof)14, fokuserer denne metode på denne tilgang i kombination med mikroprøveudtagning. En anden fordel ved peptidindfangningsmetoden er, at IS SIL-peptidet også korrigerer for affinitetsoptagelsestrinnet.
I dette arbejde blev et antistof rettet mod et protein brugt til peptidindfangning. Dette er en fordel, da tilgængeligheden af off-the-shelf antistoffer rettet mod proteiner er højere end off-the-shelf antistoffer rettet mod proteotypiske peptider. For at et antiproteinantistof effektivt kan fange et proteotypisk peptid, skal epitopen imidlertid være intakt efter proteinfordøjelse. Derudover er den nøjagtige epitop for mange antistoffer ikke kendt, hvilket gør søgningen efter et antiproteinantistof kedeligt. Dette begrænser antallet af tilgængelige antiproteinantistoffer, der kan anvendes til peptidindfangning. Den beskrevne fremgangsmåde demonstreres ved anvendelse af serum som matrix og ProGRP som målanalysand. Det er hensigten, at proceduren skal anvendes på andre matricer og andre målanalysander. I stedet for at bruge et kommercielt tilgængeligt antiproteinantistof til affinitetsindfangning af det proteotypiske peptid, er det muligt også at anvende specialfremstillede antipeptidantistoffer. Oprydningseffektiviteten af peptidindfangning sammenlignet med proteinindfangning er illustreret i figur 5. Ved at udskifte agaroseperler, der anvendes til fremstilling af trypsinperler, med magnetiske perler bør proceduren også være forenelig med robotprøveforberedelsesarbejdsstationer på markedet.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender professor Elisabeth Paus ved det norske radiumsygehus (Oslo Universitetshospital, Oslo, Norge) for at levere ProGRP-standarden og det monoklonale antistof mod ProGRP, M18. Udgivelsesgebyret blev dækket af et tilskud fra Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen og Léon Reubsaet er partnere i konsortiet National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), som er finansieret af Norges Forskningsråds INFRASTRUKTUR-program (projektnummer: 295910).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B.
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
