Summary
Biyobelirteç progastrin salgılayan peptid (ProGRP) ile örneklenen kurutulmuş serum örneklerinden düşük bollukta biyobelirteçlerin belirlenmesi için bir protokol sunulmuştur. Antikor kaplı manyetik boncuklar, proteotipik bir ProGRP peptidinin seçici temizliği ve zenginleştirilmesi için kullanılır. Yakalanan peptit daha sonra sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi ile analiz edilir.
Abstract
Bu makale, kurutulmuş numunelerden düşük bolluktaki proteinlerin verimli bir şekilde numune temizliği için ayrıntılı açıklamalar içeren bir protokol sunmaktadır. Bu, proteotipik peptid afinite yakalama ve sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) tayininden önce boncuk bazlı proteoliz kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedür, hem kağıt kartlar kullanılarak geleneksel kurutulmuş numunelere (örneğin, kurutulmuş kan lekeleri [DBS'ler] ve kurutulmuş serum lekeleri [DSS'ler]) hem de volümetrik absorptif mikrosampling (VAMS) gibi daha yeni örnekleme yöntemleriyle toplanan numunelere uygulanabilir. Bu prosedürün tanımlanmasına ek olarak, hem tripsin boncuklarının hem de antikor kaplı boncukların hazırlanması bu çalışmada adım adım sunulmaktadır. Sunulan prosedürün avantajları, boncuklar kullanılarak zaman verimli proteoliz ve peptid afinite yakalama kullanılarak seçici sağlam temizliktir. Mevcut prosedür, kurutulmuş serumda (hem DSSs hem de VAMS) düşük bollukta küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) biyobelirteci olan progastrin salgılayan peptidin (ProGRP) belirlenmesini açıklamaktadır. Boncuk hazırlamaya yönelik ayrıntılı prosedürler, iş akışının yeni uygulamalarda veya diğer laboratuvarlarda uygulanmasını kolaylaştırır. Sonuçların örnekleme malzemesine bağlı olabileceği gösterilmiştir; Mevcut proje için, VAMS kullanılarak toplanan örnekler için DSS'lere kıyasla daha yüksek sinyal yoğunlukları görülmüştür.
Introduction
Mikro örnekleme, Ivar Bang'in 1913'te DBS'lerden glikoz izlemeyi tanımlamasından bu yana 100 yıldan fazla bir süredir var1. Guthrie ve Susi, 1963 yılında yenidoğanlarda fenilalanin tayini için DBS'leri tanıttıktan sonra2, teknik giderek yaygınlaştı. Proteinlerin örneklenmesi ve depolanması için DBS'lerin ilk raporları 1970'lerin başında yapıldı3,4 ve on yıl sonra, 1980'lerde, DBSs5'ten proteinlerin belirlenmesi için ilk kütle spektrometrisi (MS) raporunu bulduk. Bu erken girişe rağmen, yüzyılın başından sonra, DBS'lerden ve diğer mikro örnekleme tekniklerinden proteinlerin MS tayini daha yaygın hale geldi.
Klinik bağlamda, hastalıkların tanı ve takibinde proteinlerin belirlenmesi, ayrıca tedavi izleme ve doping amaçları için ilgi çekicidir. Protein analitlerinin MS tarafından az miktarda kurutulmuş numuneden hedeflenen bu şekilde belirlenmesi hala zordur ve genellikle analizden önce kapsamlı numune hazırlama gerektirir.
MS ile proteinlerin hedeflenen kantitatif tayini genellikle aşağıdan yukarıya yaklaşım uygulanarak, analizden önce proteinlerin peptitlere sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Bu prosedür, sindirilmiş biyolojik numunenin doğrudan analizini zorlaştıran sayısız peptit üretir. Bunu aşmanın bir yolu, sindirim 6,7,8'den önce veya sonra MS analizinden önce seçici bir afinite temizleme adımı uygulamaktır. Bu şekilde, ilgilenilen protein (veya afinite yakalama adımı sindirimden sonra gerçekleştirilirse proteotipik peptidi), analizden önce numune matrisinden seçici olarak izole edilir ve daha düşük tespit limitleri9 sağlar.
DBS kartlarını kullanarak mikro örnekleme, düşük numune hacmi, daha az invaziv örnekleme ve artan depolama stabilitesi dahil olmak üzere geleneksel kan örneklerine kıyasla belirli avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, numune matrisi farklıdır ve analizde başka zorluklar da ortaya çıkarabilir (örneğin, kurutulmuş ve sıvı numune matrisi ve kılcal kan ile serum veya plazma)10,11. DBS'lerde gözlenen bir diğer zorluk, kan hematokritinin analiz için daha fazla işlenen numune hacmini etkilediği ve dolayısıyla analizde bireyler arası değişkenlik getirdiği hematokrit etkisi olarak adlandırılan etkidir12. 201413'te tanıtılan VAMS gibi daha yeni mikro örnekleme birimleri, kan damlası yerine sabit bir kan hacmi toplayarak bu sorunu çözmektedir.
Bu protokol, kurutulmuş mikro örneklerden düşük bolluktaki biyobelirteçlerin analizi için bir kurulum açıklamaktadır. Elüsyondan sonra, kurutulmuş numune sindirilir ve daha sonra proteotipik peptid, peptid afinite yakalama ile izole edilir. Model analiti SCLC biyobelirteci ProGRP'dir. ProCTP tam kandan güvenilir bir şekilde belirlenemediğinden, örnek matriks olarak serum kullanıldı. Hem DSS'lerden hem de VAMS kullanılarak toplanan serum örneklerinden temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Protocol
Standart çözeltilerin hazırlanmasında sağlıklı kan donörlerinden serum kullanılmıştır. Sağlıklı kan bağışçılarından serum kullanımı, Norveç yasalarına sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi. Tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Serum örnekleri, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun yöntemler kullanılarak analiz edildi. Açıklanan protokol, önceki çalışma14'te açıklanan yöntemin değiştirilmiş bir sürümüdür. Tamponların ve çözeltilerin bileşimine ve bunların nasıl hazırlanacağına genel bir bakış Ek Tablo S1'de bulunabilirken, Malzeme Tablosu bu protokolde kullanılan malzemeleri, ekipmanları ve reaktifleri içerir.
1. Antikor kaplı manyetik boncukların hazırlanması
- İstenilen sayıda boncuk hazırlamak için gerekli antikor miktarını hesaplayın. 50 mg manyetik boncuk başına 1 mg antikor kullanın.
NOT: Tipik olarak, sonraki deneylerde numune başına 20 mg / mL boncuk süspansiyonunun 20 μL'si kullanılır (bkz. adım 5.1). - İstenilen sayıda boncuk hazırlamak için gerekli antikor hacmini hesaplayın.
NOT: Antikor hacmi antikor konsantrasyonuna bağlıdır ve her antikor için hesaplanması gerekir. - İstenilen miktarda antikor çözeltisini 5 mL'lik düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Örnek olarak, antikor çözeltisi 1 mg / mL antikor içeriyorsa, 1.0 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için 0.4 mL kullanın (1 mg antikor / 50 mg boncuk ile 20 mg boncuk / mL).
NOT: Antikorlar amin içermeyen bir tamponda olmalıdır. Adsorpsiyon nedeniyle analit kaybını önlemek için protein içeren tüm çözeltiler için düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri kullanın. - Antikor çözeltisine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve sürekli karıştırma altında pH'ı 2,5'e ayarlayın. PH'ı ölçmek için mikro elektrotlu bir pH metre kullanın ve tanımlanmış 1,0 M HCl hacimlerinin kademeli olarak eklenmesiyle pH'ı ayarlayın (1,0 M HCl'lik 10 μL kısım ekleyerek başlayın ve pH 2,5'e yaklaştıkça hacmi azaltın). PH'ı 2,5'e ayarlamak için gereken toplam 1,0 M HCl hacmini kaydedin.
- Mikro elektrodu çıkarın ve asitlenmiş antikoru buz üzerinde manyetik bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Antikorun asit muamelesi, antikorların boncuk üzerindeki doğru oryantasyonunu teşvik etmek için yapılır. HCl konsantrasyonu, antikor çözeltisindeki tampon konsantrasyonuna bağlı olarak 0,5 M veya 0,2 M HCl'ye düşürülebilir. - Antikor çözeltisini nötralize edin. PH'ı ölçmek için mikro elektrotlu bir pH metre kullanın ve tanımlanmış 1,0 M NaOH hacimlerinin kademeli olarak eklenmesiyle pH'ı 7'ye ayarlayın (10 μL'lik bir kısımla başlayın ve pH 7'ye yaklaştıkça hacmi azaltın). Eklenen toplam 1,0 M NaOH hacmini kaydedin.
NOT: NaOH konsantrasyonu, adım 1.4'te kullanılan HCl konsantrasyonu ile aynı olmalıdır. NaOH oldukça aşındırıcıdır; Eldiven ve uygun göz koruması dahil olmak üzere koruyucu ekipman kullanın. - Kullanılacak tosil aktif manyetik boncukların istenen hacmini hesaplayın.
NOT: Tipik olarak, küçük ölçekli bağlantı yaparken 20 mg boncuk/mL kullanılması önerilir. En az 5 mg boncuk kullanılmalıdır. - Manyetik boncuk süspansiyonunu bir vorteks karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın ve istenen miktarda boncuk süspansiyonu içeren bir hacmi geri çekin. Örnek olarak, 1 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için, 20 mg boncuk içeren bir hacmi geri çekin (boncukların konsantrasyonu 30 mg / mL ise 667 μL).
- Boncuk süspansiyonunu 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları eşit hacimde Tip 1 H2O ile 2x yıkayın (1 mL 20 mg/mL antikor kaplı boncuk hazırlamak için 30 mg/mL boncuk çözeltisi kullanılırsa 667 μL). Her yıkama çözeltisi ilavesinden sonra bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve süpernatanı çıkarmadan önce manyetik rafa 1 dakika bekletin.
- Manyetik boncuklara aşağıdakileri ekleyin: asitle muamele edilmiş antikor, 0.5 M borat tamponu (pH 9.5) (nihai konsantrasyon 0.1 M olmalıdır; bu, 1 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için 0.2 mL'ye eşittir) ve antikor kuplajı için kuplajlama tamponu (1 mL antikor kaplı manyetik boncuk hazırlamak için, bağlantı tamponunun hacmi 1 mL'ye eşit olmalıdır - asitle muamele edilmiş antikor hacmi - 0.2 mL borat tamponu). Bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın.
NOT: Asitle muamele edilmiş antikorun hacmi, antikor çözeltisinin hacmine eşittir (1 mg/mL antikor çözeltisi kullanılarak 1 mL boncuk süspansiyonunun hazırlanmasında 0,4 mL) + pH'ı 2,5'e ayarlamak için kullanılan 1,0 M HCl hacmi + pH'ı 7'ye ayarlamak için kullanılan 1,0 M NaOH hacmi).
NOT: Antikor kuplajları için 0,5 M borat tamponu (pH 9,5) ve kuplaj tamponunun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. - Uçtan uca bir numune mikseri kullanarak, tercihen karşılıklı dönüş ve titreşimle gece boyunca ortam sıcaklığında döndürün.
- 239 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj. Tüpü mıknatısın üzerine 2 dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.
- Boncukları 2 x 2 saat ve bir kez gece boyunca, uçtan uca bir numune mikseri kullanarak ortam sıcaklığında antikor boncukları için depolama tamponunda döndürerek yıkayın. Adım 1.10'da toplam disk bölümüyle aynı disk bölümünü kullanın. Tüpü mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve her yıkama arasında süpernatantı çıkarın.
NOT: Antikor boncukları için depolama tamponunun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. - İstenilen boncuk stok konsantrasyonunu (tipik olarak 20 mg/mL) kullanarak istenen tamponda (örneğin, adım 1.13'teki ile aynı tamponda) saklayın. Buzdolabında saklayın.
2. 2 mL tripsin immobilize boncuk hazırlanması (20 mg/mL boncuklar)
- Boncukları yıkamak için 2 mL NHS ile aktive edilmiş agaroz boncuklarına 20 mL 1 mM HCl ekleyin.
- 5 dakika boyunca 2.655 × g'da karıştırın ve santrifüj edin. Supernatan'ı çıkarın.
- 20 mL 0,1 M fosfat tamponu (pH 7,8) ekleyin. Bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj yapın. Supernatan'ı çıkarın.
NOT: 0,1 M fosfat tamponunun (pH 7,8) bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. - 2 mL 20 mg/mL tripsin ekleyin (tripsin kuplajları için soğuk bağlantı tamponunda çözülür).
NOT: Tripsin kuplajı için kuplaj tamponunun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. - Sıcaklık kontrollü bir mikser kullanarak 22 ° C'de ve 1.100 rpm'de 25 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj. Supernatan'ı çıkarın.
- Tripsin boncuklarının hazırlanması için 2 mL modifikasyon tamponu ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C'de ve 1.100 rpm'de 20 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj. Supernatan'ı çıkarın.
NOT: Tripsin boncuklarının hazırlanması için modifikasyon tamponunun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. - Tripsin boncuklarının hazırlanması için 10 mL bloke edici tampon ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C'de ve 1.100 rpm'de 10 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj. Supernatan'ı çıkarın.
NOT: Tripsin boncuklarının hazırlanması için bloke edici tamponun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. - 2 mL depolama tamponu ekleyin, bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve kullanana kadar buzdolabında saklayın.
NOT: Tripsin boncukları için depolama tamponunun bileşimi Ek Tablo S1'de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın.
3. DSS / VAMS örneklemesi ve daha sonra kurutulmuş serumun ekstraksiyonu
- Serumu ProCTP (veya ilgilenilen protein) ile uygun seviyede yükselterek standartları hazırlayın. Ani artış hacmini toplam hacmin %1'i ≤ tutun.
NOT: Burada, çivili serum standartlarının hazırlanması için suda 295 μg / mL ProCTP stok çözeltisi kullanılmıştır. - Bir vorteks karıştırıcıda standartları karıştırın.
- DBS kartlarına 10 μL serum (çivili standartlar) uygulayın veya üreticinin yönergelerini kullanarak VAMS (10 μL) tarafından 10 μL serum toplanmasına izin verin. DSS için, noktanın noktalı daire içinde olduğundan emin olun.
- Ortam sıcaklığında en az 2 saat hava kurumasını bekleyin.
- Tüm noktayı kesin ve 2 mL düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın veya VAMS'yi tutucudan çıkarın ve 2 mL düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- 100 mM amonyum bikarbonat (ABC) çözeltisinden 1.000 μL ekleyin. Kurutulmuş serumu, 1.000 rpm'de sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C'de 1 saat boyunca spot / VAMS'den çıkarın.
- Ekstraktı triptik proteoliz için yeni bir 1.5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4. DSS/VAMS ekstraktlarının sindirimi
- Numune başına 30 μL tripsin boncuk (bölüm 2'de hazırlandığı gibi) kullanın. Tüm numuneler için tripsin boncukları içeren bir hacmi yeni bir 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Tripsin boncuklarını, pipetlenen aynı hacimde tekrar askıya almadan önce 1 mL soğuk 50 mM ABC ile 2x yıkayın. 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı adımlar arasında çıkarın.
- Sindirimi başlatmak için her DSS / VAMS ekstraktına 30 μL yıkanmış tripsin boncukları ekleyin.
- Sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir şey kullanarak 37 ° C'de ve 1.000 rpm'de 2 saat inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı (boncuk değil) yeni bir 2.0 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 100 mM ABC çözeltisine kararlı izotop etiketli (SIL) peptid ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15 N2] içeren 25 μL 14ng/mL dahili standart (IS) çözeltisi ekleyin.
5. Antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak proteotipik ProGRP peptidinin yakalanması
- Ekstraksiyon başına 20 μL antikor kaplı boncuk (bölüm 1'de hazırlandığı gibi 20 mg / mL) kullanın. Tüm antikor kaplı boncukları yeni bir 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın, mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve depolama tamponunu çıkarın.
- Manyetik antikor kaplı boncukları, pipetlenen aynı hacimde tekrar askıya almadan önce 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4, %0.05 polisorbat 20 ve 2 x 1 mL PBS içeren pH'lerle yıkayın. Bir vorteks karıştırıcı üzerinde karıştırın ve tampon değişimleri arasında 1 dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.
NOT: PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO4 ve 1,8 mM KH2PO4 içerir. Daha fazla stabilite için çözeltinin 10x konsantrasyonda hazırlanması önerilir. 100 mL'lik 10x PBS'nin bileşimi için bkz: Ek Tablo S1. 10x PBS 10x'in seyreltilmesi, ~ 7.4'lük bir pH elde edecektir. - Sindirilmiş DSS/VAMS ekstraktı ve IS içeren her düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne 20 μL yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin. Ortam sıcaklığında uçtan uca bir numune mikseri kullanarak 1 saat boyunca immünoekstraksiyon gerçekleştirin.
- Manyetik boncukları aşağıdaki çözeltileri kullanarak yıkayın: %0,05 (v/v) polisorbat 20 ile 500 μL PBS, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) ve 300 μL 100 mM ABC.
- Her yıkama çözeltisinin eklenmesinden sonra, düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü boncuklarla çıkarın ve çözeltiyi mıknatıs rafından yıkayın ve homojen olana kadar dikkatlice ters çevirin. Ardından, düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü mıknatısın üzerine 30 s boyunca yerleştirin, 30 s ters çevirin ve mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin. Yıkama solüsyonunu çıkarın.
- Bir mikrosantrifüj kullanarak kalan süspansiyonu aşağı doğru döndürün. Mıknatısın üzerine 1 dakika bekletin ve kalan yıkama solüsyonunu çıkarın.
- Her numuneye Tip 1 H 2 O'da 15 μL%2(v / v) formik asit ekleyin ve yakalanan peptitleri ortaya çıkarmak için sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir şey kullanarak 22 ° C'de ve 1.000 rpm'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve elüatı yeni bir 1.5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir kez tekrarlayın ve ikinci elüatı ilk elüat ile aynı düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Her bir elüata 20 μL 100 mM ABC ekleyin (toplam hacim 50 μL).
- Santrifüj (mikrosantrifüj) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şişeleri için 40 μL elüatı mikro uçlara aktarın.
6. LC-MS / MS ile analiz
- Yüksek sağlamlık için elektrosprey iyonizasyonlu bir mikro LC üçlü kuadrupol MS kullanın.
- Mobil faz A (H 2 O ve MeCN'de 20 mM FA, 95:5 v/v) ve B (H2O ve MeCN'de 20 mM FA, 5:95 v/v) pompaları temizleyerek LC-MS/MS sistemini analiz içinhazırlayın.
- Analitik sütunu yerleştirin (C18, 50 mm x 1 mm iç çap [ID], 3 μm parçacıklar).
- Belirli bir cihaz için başlatma prosedürlerini izleyerek cihazı analiz için hazırlamaya devam edin.
- Cihaz yazılımında, kolonlu fırın sıcaklığını 25 °C'ye ve akış hızını 50 μL/dak'ya (%100 mobil faz A) ayarlayın.
- Sütunu mobil faz A ile en az 15 dakika boyunca dengeleyin.
- Örnekleri otomatik numune alma cihazına yerleştirin.
- ProGRP'ye özgü, triptik peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK ve IS'sinin analizi için cihaz yöntemini hazırlayın.
NOT: Çeşitli yöntem parametreleri cihaza özgüdür ve kullanılan belirli cihaz üzerinde optimize edilmelidir. Burada kullanılan yöntem parametrelerinin ayrıntıları 6.9 ile 6.11 arasındaki adımlarda açıklanmıştır. - LC'deki gradyan programı için aşağıdaki ayarları kullanın: akış hızı: 50 μL/dak; zaman 0,0 ila 3,0 dakika arası:% 100 mobil faz A; 3,0 ila 18,0 dakika arası: %0 ila %50 arasında doğrusal bir gradyan çalıştırın mobil faz B; zaman 18.0 ila 18.1 dakika: mobil faz B'yi% 50'den% 100'e yükseltin; zaman 18,1 ila 20,0 dakika:% 100 mobil faz B; zaman 20.0 ila 20.1 dakika: mobil faz B'yi% 100'den% 0'a düşürün; 20,1 - 30 dakika arası: Sütunu yeniden dengelemek için %100 mobil A aşaması (en az 10 sütun hacmi kullanın).
- MS/MS ayarları için, verimli iyonizasyon sağlayan cihaz ayarlarını kullanarak MS/MS'yi pozitif modda çalıştırın. Bu protokolü takip etmek için, +4.000 V'luk bir püskürtme voltajı, 270 °C'lik ısıtılmış bir kılcal sıcaklık, sac gaz olarak azot (5 keyfi birim) ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) parçalanması için argon (2 mTorr) kullanın. Cihaz izin veriyorsa, LC akışını MS yerine koşunun ilk 2 dakikasını (0-2 dakika) ve son 1 dakikasını (29-30 dakika) boşa harcamak için yönlendirin.
- (A) imza peptidi (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1.005.45→913.3, 1.005.45→1.028.3 ve 1.005.45→1.398.5 ve (B) IS SIL peptidi (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1.009.45→921.3, 1.009.45→1.036.3 ve 1.009.45→1.406.5 için seçilen reaksiyon izleme (SRM) geçişlerini kullanın. İzlenen tüm geçişler için optimize edilmiş çarpışma enerjisi (bu protokolde 35 V) kullanın.
- LC-MS/MS sisteminiz için mevcut yazılımı kullanarak çalıştırılacak örnekleri içeren bir dizi hazırlayın. Enjeksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın.
NOT: Gerektiğinde boş numuneler ve kalite kontrol numuneleri eklediğinizden emin olun. - Diziyi başlatmak için enstrüman yazılımında "Run sequence" (Sırayı çalıştır) düğmesine basın.
- Afinite yakalanan, ProGRP'ye özgü, triptik peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK ve IS SIL peptidinin tepe alanını izleyin.
NOT: İmza peptidi ALGNQQPSWDSEDSSNFK'nın seçimi ve onaylanması14'ün başka bir yerinde açıklanmıştır.
Representative Results
Hem DSS örneklemesi hem de VAMS kullanan analitik iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Örnekleme yöntemindeki farklılıklar dışında, prosedürler aynıdır. İki örnekleme yöntemi kullanılarak örneklenen serumun görüntüleri Şekil 2'de görülebilir.
Her iki örnekleme formu (VAMS ve DSS), ProGRP içeren serumun örneklenmesi için uygundur. Bu, proteotipik peptidin MS kromatogramlarının ve DSS ve VAMS örneklemesinden IS SIL peptidinin gösterildiği Şekil 3'ten görülebilir. Ayrıca MS kromatogramında 10 μL'lik çivili sıvı serum numunesinden oluşan bir kontrol numunesinin analizinden sonra kurutulmuş numunelerle aynı şekilde işlenen numuneler de yer almaktadır. İkincisi, DSS / VAMS ekstraksiyon çözeltisinin hacmi ile aynı hacimde seyreltildi, tripsin boncukları kullanılarak sindirime tabi tutuldu ve peptid afinite yakalama kullanılarak temizlendi.
VAMS ve DSS örneklemesi karşılaştırıldığında (Şekil 4), VAMS, DSS'den daha yüksek bir proteotipik peptid / IS alan oranı sağlar. Bu, DSS (saf selüloz) için kullanılan kağıda hedef protein ProCTP kaybı olabileceğini gösterir. Serumun daha ileri işlem ve analizlerden önce kurutulmadığı bir kontrol numunesiyle karşılaştırıldığında (Şekil 4), VAMS'nin kontrol numunesi ile benzer alan oranları sağladığı gösterilmiştir (iki kuyruklu t-testi, p≤ 0.65), örnekleme malzemesinde herhangi bir kayıp olmadığını gösterirken, DSS önemli ölçüde daha düşük bir alan oranı sağlar (iki kuyruklu t-testi, p≤ 0.005), örnekleme malzemesindeki kaybı gösterir.
VAMS kullanılarak kısa bir değerlendirme yapıldı. Doğrusallık 10 ila 1.000 ng/mL (R2 = 0.9996) arasında, algılama sınırı (LOD, S/N = 3) 6.7 ng/mL olarak gösterilmiştir. LOD, analizin 1 mm'lik bir ID sütununa sahip oldukça eski bir üçlü kuadrupol (2008) üzerinde gerçekleştirildiği için tatmin edici olarak kabul edilir. S / N > 10 ile tüm seviyelerin tekrarlanabilirliği, IS düzeltmesi kullanılarak% 7 ila% 17 (n = 3) arasında bir RSD ile tatmin edici olarak kabul edildi.
Afinite yakalama, sindirim adımından önce ve sonra, ilgilenilen proteini veya proteotipik peptitini yakalayarak gerçekleştirilebilir. Geçerli prosedür peptid afinite yakalamayı açıklamaktadır. Bu yaklaşımın protein yakalamaya kıyasla bir avantajı, yalnızca ilgilenilen peptidin yakalanması ve daha verimli bir numune temizliğinin sağlanmasıdır. Bu, Şekil 5'te gösterilmiştir ve peptid yakalamadan sonra karşılaştırıldığında protein yakalamadan sonra daha fazla gürültü ile daha karmaşık bir tam tarama kromatogramı göstermektedir. Şekil 5'te analiz edilen örnekler DSS örneklemesi veya VAMS kullanılarak örneklenmemiştir; Bununla birlikte, serum aynı zamanda örnek matristir ve afinite yakalama, tarif edilen prosedürde peptid yakalama için kullanılan aynı antikor kullanılarak gerçekleştirilir.
Şekil 1: Hem DSS hem de VAMS örneklemesini kullanan analitik iş akışına genel bakış. Kısaltmalar: DSS = kurutulmuş serum lekesi; VAMS = hacimsel absorptif mikro örnekleme; LC-MS/MS = sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı yöntemler kullanılarak örneklenen serum görüntüleri . (A) DBS selüloz kartı ve (B) VAMS. Kısaltmalar: DBS = kurutulmuş kan lekesi; VAMS = hacimsel absorptif mikro örnekleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DSS ve VAMS örneklemesinden sonra proteotipik peptit ve IS SIL peptidinin temsili MS kromatogramları ve ayrıca doğrudan ekstraksiyon çözeltisine eklenen çivili bir serum numunesi için. MS kromatogramları, 1.5 μg / mL ProGRP ile çivilenmiş ve (A) VAMS'a, (B) selüloz örnekleme kartına (DSS için) veya (C) doğrudan ekstraksiyon tamponuna (kontrol numunesi) uygulanan 10 μL serum örneklerini gösterir. Peptid afinite yakalamadan önce tüm numunelere eklenen yirmi beş mikrolitre 14 ng / mL, SIL peptididir. Kısaltmalar: DSS = kurutulmuş serum lekesi; VAMS = hacimsel absorptif mikro örnekleme; MS = kütle spektrometrisi; ProGRP = progastrin salgılayan peptit; IS = iç standart; SIL = kararlı izotop etiketli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ProGRP ile çivilenmiş ve VAMS, DSS'ye veya doğrudan ekstraksiyon çözeltisine (kontrol numunesi) uygulanan (10 μL) serum örnekleri için ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS alan oranının temsili sonuçları. ProCTP konsantrasyonu her koşul için 1.5 μg / mL, n = 4'tür; 25 μL 14 ng/mL IS SIL peptid, peptid afinite yakalamadan önce tüm numunelere eklenir. *alan oranının VAMS'ye uygulanan numunelerden önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir (iki kuyruklu t-testi, s≤ 0,005). Hata çubukları standart sapma ±. Kısaltmalar: DSS = kurutulmuş serum lekesi; VAMS = hacimsel absorptif mikro örnekleme; ProGRP = progastrin salgılayan peptit; IS = iç standart; SIL = kararlı izotop etiketli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bozulmamış protein ekstraksiyonu (mavi) ve proteotipik epitop peptid ekstraksiyonundan (kırmızı) sonra baz tepe kromatogramlarının (tam tarama Orbitrap analizi) karşılaştırılması. Proteotipik epitop peptidinin ekstrakte edilmiş iyon kromatogramları (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m / z 1005.45) sağda gösterilmiştir. Örnek olarak 150 ng mL−1 ProGRP ile çivilenmiş serum kullanıldı. Bu şekil Levernæs et al.14'ten yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: Tamponların ve çözeltilerin bileşimine ve bunların nasıl hazırlanacağına genel bakış. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Açıklanan protokol, tripsin boncuklarının ve antikor kaplı manyetik boncukların hazırlanması da dahil olmak üzere, kurutulmuş mikro örneklerden (DSS ve VAMS) düşük bollukta biyobelirteçlerin analizinde birkaç önemli adımın nasıl gerçekleştirileceği hakkında bilgi içermektedir. Önceki deneyimlere dayanarak, antikorların oryantasyonunu iyileştirmek için boncuk immobilizasyonundan önce antikoru her zaman asitle tedavi ediyoruz15.
Bu prosedürdeki kritik adımlardan biri, en uygun mikro örnekleme formatının seçilmesidir. İlk olarak, söz konusu analitin tam kandan belirlenip belirlenemeyeceği veya konsantrasyonun kan hücrelerinden etkilenip etkilenmediği ve serum veya plazmada (model analit, ProGRP'de olduğu gibi) belirlenmesi gerekip gerekmediği düşünülmelidir.
Hem kağıt hem de polimer bazlı yaklaşımların avantajları ve sınırlamaları vardır; ProGRP için VAMS, numune alma cihazından ekstraksiyondan sonra analit geri kazanımı açısından açık bir avantaj sağlar. Bununla birlikte, bu muhtemelen DSS numuneleri için farklı bir ekstraksiyon çözeltisi kullanılarak optimize edilebilir. Bununla birlikte, analit ve örnekleme materyali arasındaki bu potansiyel etkileşim, analitik varyasyonun artmasına ve daha yüksek tespit limitlerine neden olabileceğinden dikkate alınması önemlidir. Kullanılan IS bir SIL peptidi olduğundan ve ilk olarak sindirimden sonra eklendiğinden, IS sindirimi takip eden adımları düzeltir (örneğin, afinite ekstraksiyonu ve LC-MS / MS analizi). DSS/VAMS'den ekstraksiyon ve sindirim adımı için IS düzeltmesi mümkün değildir.
Prosedürde iki tip boncuk kullanılır: serum numunesinin örnekleyiciden çıkarılmasından sonra sindirim için tripsin boncukları ve sindirim sonrası proteotipik peptidin yakalanması için antikor kaplı manyetik boncuklar. Tripsin boncuklarının kullanılmasının önemli bir nedeni, sindirimi hızlandırmanın yanı sıra, afinite yakalama sırasında numunedeki artık tripsin aktivitesini en aza indirmektir. Bu, afinite yakalama sırasında mAb'nin triptik proteolizini önlemek için önemlidir.
Tripsin boncuklarının hazırlanmasında agaroz boncukları, antikor kaplı boncukların hazırlanmasında manyetik boncuklar kullanıldı. Agarose boncukları manyetik boncuklardan daha ucuzdur, ancak boncukların çözeltiden ayrılmasının santrifüjleme gerektirdiği bir sınırlamaya sahiptir. Bu, boncukların ve süpernatantın ayrılmasını manyetik boncuk kullanmaktan daha az verimli hale getirir. Ek olarak, agaroz boncukları kullanılarak iş akışının otomasyonu zordur. Bununla birlikte, manyetik NHS ile aktive edilmiş boncuklar mevcuttur ve daha akıcı ve otomatikleştirilebilir bir numune hazırlama iş akışı için kullanılabilir.
Mikroörnekleme, hem ilaçların hem de biyobelirteçlerin biyoanalizinde önemli bir eğilimdir. Mevcut yaklaşımla ilgili bir zorluk, ProGRP (pg / mL-düşük ng / mL seviyesi) gibi çok düşük bolluktaki analitlerin belirlenmesinde özellikle önemli olabilecek sınırlı miktarda numune hacmidir (10 μL). Bununla birlikte, bu zorluk son teknoloji analitik ekipmanlar kullanılarak aşılabilir. Bu düşük bolluktaki analitler için, numune hazırlama seçimi çok önemlidir ve antikor bazlı afinite yakalama yoluyla seçici numune temizliği en sık ihtiyaç duyulan şeydir. Peptit yakalamanın, protein yakalamadan (aynı antikoru kullanarak)14 daha temiz ekstraktlar ve daha düşük tespit sınırları sağladığı gösterildiğinden, mevcut yöntem mikro örnekleme ile birlikte bu yaklaşıma odaklanmaktadır. Peptid yakalama yaklaşımının bir diğer avantajı, IS SIL peptidinin afinite yakalama adımı için de düzeltme yapmasıdır.
Bu çalışmada, peptit yakalama için bir proteini hedef alan bir antikor kullanılmıştır. Proteinleri hedef alan hazır antikorların mevcudiyeti, proteotipik peptitleri hedef alan hazır antikorlardan daha yüksek olduğu için bu bir avantajdır. Bununla birlikte, bir anti-protein antikorunun proteotipik bir peptidi etkili bir şekilde yakalaması için, protein sindiriminden sonra epitopun bozulmamış olması gerekir. Ek olarak, birçok antikor için, kesin epitop bilinmemektedir, bu da bir anti-protein antikoru arayışını sıkıcı hale getirmektedir. Bu, peptid yakalama için uygulanabilir mevcut anti-protein antikorlarının sayısını sınırlar. Tarif edilen prosedür, matris olarak serum ve hedef analit olarak ProGRP kullanılarak gösterilmiştir. Prosedürün diğer matrislere ve diğer hedef analitlere uygulanabilir olması amaçlanmıştır. Proteotipik peptidin afinite yakalaması için ticari olarak temin edilebilen bir anti-protein antikoru kullanmak yerine, ısmarlama anti-peptid antikorları da kullanmak mümkündür. Peptit yakalamanın protein yakalamaya kıyasla temizleme etkinliği Şekil 5'te gösterilmiştir. Tripsin boncuklarının hazırlanmasında kullanılan agaroz boncuklarının manyetik boncuklarla değiştirilmesiyle, prosedür piyasadaki robotik numune hazırlama çalışma istasyonlarıyla da uyumlu olmalıdır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Norveç Radyum Hastanesi'nden (Oslo Üniversitesi Hastanesi, Oslo, Norveç) Prof. Elisabeth Paus'a ProGRP standardını ve anti-ProGRP monoklonal antikoru M18'i sağladığı için çok teşekkür ederiz. Yayın ücreti Apoteker Harald Conrad Thaulows legat'tan bir hibe ile karşılandı. Trine Grønhaug Halvorsen ve Léon Reubsaet, Norveç Araştırma Konseyi INFRASTRUKTUR programı (proje numarası: 295910) tarafından finanse edilen Ulusal Gelişmiş Proteomik Altyapı Ağı (NAPI) konsorsiyumunun ortaklarıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B.
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
