Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.
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Artículo de método
Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La hepatectomía parcial se ha utilizado ampliamente para investigar la regeneración hepática en ratones, pero el aislamiento de altos rendimientos de hepatocitos viables para aplicaciones de células individuales aguas abajo es un desafío. Se observa una marcada acumulación de lípidos dentro de los hepatocitos regeneradores durante los primeros 2 días de regeneración hepática normal en ratones. Esta llamada esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal. La purificación por gradiente de densidad es la columna vertebral de la mayoría de los protocolos existentes para el aislamiento de hepatocitos primarios. Como la purificación de gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, separa las poblaciones de hepatocitos no esteatósicos de las esteatósicas. Por lo tanto, los hepatocitos grasos a menudo se pierden, produciendo fracciones de hepatocitos no representativas.
El protocolo presentado describe un método fácil y fiable para el aislamiento in vivo de hepatocitos regeneradores independientemente de su contenido lipídico. Los hepatocitos de ratones machos C57BL/6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente, utilizando una técnica de perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta. Los hepatocitos son disociados por la colagenasa para su liberación de la cápsula de Glisson. Después del lavado y la centrifugación cuidadosa, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior. En conclusión, este artículo describe una técnica sencilla y reproducible para el aislamiento de una población representativa de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones. El método también puede ayudar al estudio de la enfermedad del hígado graso.
Introducción
El hígado puede regenerarse incluso después de una pérdida importante de tejido. Esta capacidad regenerativa única se ilustra explícitamente en el modelo experimental de hepatectomía parcial (70%), descrito por primera vez en ratas por Higgins y Anderson en 19311. En este modelo, el 70% del hígado se extirpa quirúrgicamente de los animales cortando lóbulos hepáticos más grandes. Los lóbulos restantes crecen a través de la hipertrofia compensatoria para restaurar la masa hepática original dentro de aproximadamente 1 semana después de la cirugía, aunque sin restauración de la arquitectura hepática original 2,3
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron de acuerdo con las Regulaciones Federales Alimentarias Suizas y aprobados por la Oficina Veterinaria de Zurich (n° 007/2017, 156/2019) asegurando el cuidado humano. Los ratones machos C57BL / 6 de 10 a 12 semanas se mantuvieron en un ciclo de día / noche de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua. Cada grupo experimental consistió de seis a ocho animales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Hepatectomía parcial en ratones
- Para la hepatectomía ....
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Resultados
El TRAS alcanza su punto máximo a las 16 h después de la hepatectomía y desaparece gradualmente 32-48 h después de la hepatectomía estándar, pero persiste más allá de 48 h después de la hepatectomía prolongada. Macroscópicamente, TRAS es fácilmente visible como una tez pálida del remanente hepático (Figura 1F) y se puede observar en ratones hepatectomizados entre 16 h y 48 h después de la cirugía.
El rendimiento final estimado es de 10-15 × 10 6 hepatocitos despué.......
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Discusión
El protocolo publicado proporciona un método fiable y sencillo para aislar un alto rendimiento de hepatocitos murinos normales y esteatósicos para análisis descendentes unicelulares o análisis masivos de células después de la clasificación FACS. La clara ventaja sobre la purificación del gradiente de densidad es que el contenido de lípidos celulares no tiene esencialmente ningún impacto en el rendimiento efectivo de los hepatocitos. Por lo tanto, la fracción de hepatocitos esteatósicos se retendrá e incluirá en los análi.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (subvención del proyecto 310030_189262).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Tinte de viabilidad reactivo a aminas |
| Attane Isoflurano ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | ATENCIÓN: necesita ventilación |
| solución EDTA | Sigma-Aldrich | E8008-100ML-Ethanol | |
| Sigma-Aldrich | V001229 | Diluir con agua hasta el 70% | |
| Suero fetal bovino (FCS) | Gibco | A5256701-Hanks | |
| , Ca2+, Mg2+, rojo fenol | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | Para digestión/conservación |
| Solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS), sin Ca2+, sin Mg2+, sin rojo fenol | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | tampón de perfusión |
| HEPES, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Adhesivo | |
| tisular Histoacryl (butil-2-cianoacrilato) | B. Braun | 1050052 | Para la estabilización del sitio de canulación |
| Hoechst 33258 Solución de tinción | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Grado de investigación | Roche | 5401119001 | Colagenasas liofilizadas I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Ungüento Veterinario | Dechra | 17033-211-38-Solución | |
| salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | A1286301-Sudán | |
| IV – Tinción lipídica | Sigma-Aldrich | V001423-Temgesic | |
| (clorhidrato de buprenorfina), solución inyectable 0,3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Estupefacientes. Almacene de forma segura. |
| Azul de tripán, 0,4%, filtrado estéril | Sigma-Aldrich | T8154 | Para el recuento de células |
| Williams' Pipeta | serológica mediana E Sigma-Aldrich | W4128-500ML- | |
| Materials | |||
| 25 mL, Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| mL Tubos Falcon | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Catéter Pro IV 26 G | BD Falcon | 391349-Cell | |
| , ancho de la cuchilla giratoria 25 mm | TPP | 99004-Falcon | |
| Cell Strainer 100 µ m Nylon | BD Falcon | 352360-Paño | |
| quirúrgico estéril fenestrado | - | - | Material de tela reutilizable |
| Boquilla de llenado para tubo de tamaño 16# (ID 3.1 mm) | Drifton | BOQUILLA DE LLENADO#16 | Para entrar en los tubos |
| Tubos de citometría de flujo, 5 mL | BD Falcon | 352008-Male | |
| Luer a Barb, ID del tubo 3.2 mm | Drifton | LM41 | Tubo de conexión a la jeringa |
| Placas de Petri, 96 x 21 mm | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | Para retraer el esternón |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | Para sutura cutánea |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligadura Tubo de vesícula biliar |
| 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm | Drifton | SC0374T | Tubo de perfusión |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Citómetro de flujo | BD- | - | |
| Isis afeitadora de roedores | Aesculap | GT421-Isofluran | |
| station Provet | - | - | |
| Centrífuga de baja velocidad – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-cámara de conteo mejorada | Marienfeld | - | - |
| Concentrador de oxígeno – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipeta Turbo-Fix | TPP | 94700-Shenchen | de |
| perfusión – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-Microscopio | |
| quirúrgico – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux colchoneta de calentamiento | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092-Baño de | |
| agua – Precision GP 02 | Thermo | scientific-Ajuste | a 42 ° C |
Referencias
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver....
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Reimpresiones y permisos
