Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

La retina es un tejido sensible a la luz presente en la parte posterior del ojo de los vertebrados que convierte las señales de luz en impulsos nerviosos por un fenómeno bioquímico conocido como la vía de fototransducción. Los impulsos nerviosos iniciales generados en las células fotorreceptoras de la retina se transducen a otras interneuronas retinianas y células ganglionares de la retina (CGR) y llegan a la corteza visual del cerebro, lo que ayuda en la percepción de la imagen y la respuesta visual.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que 1,5 millones de niños son ciegos, de los cuales 1 millón están en Asia. La distrofia retiniana hereditaria (IRD) es una enfermedad cegadora importante que afecta a 1 de cada 4.000 individuos en todo el mundo ^1,2,3, mientras que la prevalencia de ceguera asociada con la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) oscila entre el 0,6% y el ^1,1% en los países en desarrollo ⁴. Los IRD son causados por defectos genéticos heredados en más de 300 genes diferentes involucrados en el desarrollo y la función de la retina⁵. Tales cambios genéticos resultan en la interrupción de las funciones normales de la retina y la degeneración gradual de las células de la retina, a saber, las células fotorreceptoras y el epitelio pigmentado de la retina (EPR), lo que conduce a una pérdida severa de la visión y ceguera. Se ha logrado un enorme progreso en otras condiciones de cegamiento que involucran la córnea, el cristalino, etc. Sin embargo, las distrofias de retina y las atrofias del nervio óptico no tienen ninguna terapia probada hasta la fecha. Dado que una retina humana adulta no tiene células madre⁶, fuentes alternativas como las células madre embrionarias (CES) y las células madre pluripotentes inducidas derivadas del paciente (iPSC) pueden proporcionar un suministro ilimitado de los tipos de células deseados y son muy prometedoras para el desarrollo de organoides tisulares complejos necesarios para estudios de modelado de enfermedades in vitro y para el desarrollo de terapias regenerativas^{7, 8,9,10}.

Varios años de investigación en retina han llevado a una mejor comprensión de los eventos moleculares que orquestan el desarrollo temprano de la retina. La mayoría de los protocolos para generar células retinianas y organoides 3D a partir de PSC tienen como objetivo recapitular estos eventos de desarrollo in vitro, cultivando las células en un complejo cóctel de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para modular los procesos biológicos conocidos de manera gradual. Los organoides retinianos así generados están compuestos por las principales células de la retina: células ganglionares de la retina (CGR), interneuronas, fotorreceptores y epitelio pigmentado de la retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . A pesar de los intentos exitosos de modelar IRD utilizando organoides retinianos, el requisito del complejo cóctel de factores de crecimiento y moléculas pequeñas durante la diferenciación y la eficiencia relativamente baja de la generación de organoides retinianos plantea un gran desafío con la mayoría de los protocolos. Incluyen principalmente la formación de cuerpos embrioides, seguida de su diferenciación gradual en linajes retinianos utilizando condiciones de cultivo complejas en diferentes etapas de desarrollo in vitro ^20,21,22.

Aquí, se informa un método simplificado y robusto para desarrollar organoides neurorretinianos 3D complejos a partir de control sano y hiPSC específicas de la enfermedad retiniana. El protocolo descrito aquí utiliza la diferenciación directa de cultivos hiPSC casi confluentes sin necesidad de formación de cuerpo embrioide. Además, la complejidad del medio de cultivo se simplifica, lo que lo convierte en una técnica rentable y reproducible que puede ser fácilmente adoptada por los nuevos investigadores. Implica un sistema de cultivo híbrido que consiste en cultivos monocapa adherentes durante las primeras 4 semanas de diferenciación retiniana hasta la aparición de grupos primordiales de campo ocular (EFP) distintos y autoorganizados. Además, las islas neurorretinianas circulares dentro de cada EFP se recogen manualmente y se cultivan en cultivos en suspensión durante 1-2 semanas para preparar copas retinianas 3D de múltiples capas u organoides que consisten en precursores neurorretinianos proliferantes PAX6 ⁺ y CHX10 ⁺. El cultivo prolongado de organoides retinianos en medio que contiene taurina de 100 μM durante otras 4 semanas dio lugar a la aparición de precursores fotorreceptores RCVRN+ y CRX⁺ y células maduras con extensiones rudimentarias similares a segmentos internos.

Todos los experimentos con hiPSC se llevaron a cabo de forma aséptica, en cumplimiento de las prácticas estándar de laboratorio, las pautas éticas y de bioseguridad, y con las aprobaciones de organismos reguladores como el Comité de Ética Institucional (IEC), el Comité Institucional para la Investigación de Células Madre (IC-SCR) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC).

1. Preparación de cultivo de iPSC y medio de diferenciación retiniana y reactivos

1. Medio de cultivo y mantenimiento iPSC
   1. Cultivar y mantener la línea normal^{hiPSC 23} (hiPSC-F2-3F1) y una línea RB1-/- hiPSC editada por CRISPR (LVIP15-RB1-CS3, con deleción bialélica por desplazamiento del marco de 10 pb dentro del exón 18 del gen RB1 humano) en medio Essential 8 en placas de cultivo recubiertas de matrigel (matriz de membrana basal; ver Tabla de materiales) en condiciones de cultivo sin alimentador.
      NOTA: Este protocolo se puede hacer totalmente libre de xeno-reemplazando la matriz de la membrana basal con el recubrimiento de vitronectina recombinante (VTN-N). Prepare el medio Essential 8 completo agregando un suplemento 50x Essential 8 (suministrado con el kit mediano Essential 8; consulte la Tabla de materiales) y 100 U/ml de soluciones de penicilina-estreptomicina. Alternativamente, las hiPSCs también se pueden cultivar utilizando el medio mTeSR1 completo.
2. Solución de disociación celular (1x CDS)
   1. Para una disociación libre de enzimas y el paso de iPSCs humanas, prepare el CDS que contiene 0.5 mM EDTA, pH 8.0 y 30 mM NaCl en 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (ver Tabla de materiales).
   2. Para preparar 100 ml de 1x CDS, agregue 100 μL de 0,5 M de EDTA y 1 ml de 3 M de soluciones madre de NaCl a 99 ml de 1x DPBS, mezcle bien y esterilice el filtro con un filtro de 0,22 μm.
3. Medio de inducción de diferenciación (DIM)
   1. Prepare DIM usando DMEM-F12 Medio Basal suplementado con 10% de reemplazo sérico knockout (KOSR), 1x aminoácido no esencial (NEAA), 2 mM de GlutaMax, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 200 μM de ácido L-ascórbico y 1% de suplemento N2 (ver Tabla de materiales).
4. Medio de diferenciación retiniana (RDM)
   1. Prepare RDM usando DMEM-F12 Medio basal suplementado con 10% de suero knockout (KOSR), 1x aminoácido no esencial (NEAA), 2 mM de GlutaMax, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 200 μM de ácido L-ascórbico y suplemento de B27 al 2% (con vitamina A) (consulte la Tabla de materiales).
5. Superficies de cultivo celular recubiertas de matriz extracelular
   1. Descongele la matriz de membrana basal calificada por hESC durante la noche en un cubo de hielo, preferiblemente dentro de una nevera a 4-8 °C. Diluir el material de matriz 100x descongelado (5 ml) en una proporción de 1:5 agregando 20 ml de medio basal DMEM-F12 helado y mezclar con un suave remolino para preparar una solución madre 20x.
      1. Preparar alícuotas de 0,5 ml en hielo utilizando puntas de pipeta preenfriadas y tubos de microcentrífuga estériles. Etiquete los viales como 20 veces las existencias y guárdelos congelados en un congelador de -80 °C durante un máximo de 6 meses.
   2. Para recubrir las superficies de cultivo celular (placas de cultivo o placas de 6 pocillos), descongele una alícuota de matriz 20x en hielo y dilúyala en una proporción de 1:20 utilizando un medio basal DMEM-F12 helado para preparar 10 ml de solución de recubrimiento de matriz 1x, que es suficiente para recubrir un plato de 100 mm o una placa de 6 pocillos (1,5 ml / pocillo).
      NOTA: Preenfríe las pipetas/micropuntas aspirando DPBS heladas y estériles antes de manipular la solución matricial. La descongelación y toda la manipulación de la matriz deben realizarse en hielo, utilizando pipetas/micropuntas preenfriadas para evitar la polimerización y la gelificación a temperatura ambiente.
   3. Agregue 1,5 ml de solución de recubrimiento de matriz 1x a cada pocillo de una placa de 6 pocillos, agite suavemente la placa para garantizar un recubrimiento uniforme e incube las placas a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%. Dejar las placas intactas durante un mínimo de 1 h para asegurar un recubrimiento uniforme de la matriz en las superficies de cultivo.
   4. Antes de sembrar las células, aspire la solución de recubrimiento con una pipeta estéril de 5 ml y deseche los desechos líquidos. Agregue inmediatamente el medio de cultivo fresco (2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos) y siembre las células a una densidad de 150,000-200,000 células / pocillo. No deje que las placas se sequen durante la manipulación.
      NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un recubrimiento de vitronectina recombinante (VTN-N) a una concentración final de 0,5 μg/ml para un protocolo de cultivo libre de xeno.

2. Establecimiento de culturas humanas iPSC

1. Descongelación y reactivación de las hiPSCs
   1. Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1x solución de matriz de membrana. Incubar a 37 °C durante 1 h para permitir la polimerización y el recubrimiento uniforme de la superficie de cultivo.
   2. Después de 1 h de incubación, retirar la solución de recubrimiento y añadir 1 ml de medio Essential 8 completo precalentado que contenga 10 μM de inhibidor de la Rho-quinasa, Y-27632 (1 μL/ml de 10 mM; ver Tabla de materiales), antes de revivir las células.
   3. Retire una cepa criovial hiPSC (1 x 10⁶ células/vial) del recipiente de nitrógeno líquido. Descongelar rápidamente el criovial en un baño de agua a 37 °C con un suave remolino.
      NOTA: No descongele el vial completamente; Anote el número de pasaje, esterilice la superficie del vial y séquelo con un hisopo sin pelusa que contenga 70% de alcohol isopropílico.
   4. Con una punta de pipeta estéril de 1 ml, aspirar el contenido criovial en un tubo fresco de 15 ml que consiste en 2 ml de medio Essential 8 completo precalentado sin Y-27632. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 4 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
   5. Resuspender el pellet celular en 1,0 ml de medio Essential 8 completo que contenga 10 μM Y-27632.
   6. Agregue esta suspensión celular sobre las superficies recubiertas de matriz sin perturbar la matriz dispensándola a lo largo de las paredes. Balancee la placa suavemente transversalmente para asegurar la distribución uniforme de las células.
   7. Incubar las placas a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5% para permitir que las células se adhieran y comiencen a proliferar.
   8. Después de 12-24 h, reemplazar el medio gastado y mantener los cultivos en medio Essential 8 completo precalentado sin Y-27632.
   9. Cambiar el medio de cultivo cada 24 h y pasar los cultivos una vez que alcancen el 70%-80% de confluencia.
      NOTA: Se sigue rutinariamente una proporción dividida de 1:6 para los cultivos hiPSC y se pasa a intervalos regulares de 3-4 días.
2. Paso y recubrimiento de hiPSCs para iniciar la diferenciación del linaje retiniano
   1. Aspirar el medio gastado a partir de 70% -80% de cultivos humanos confluentes de iPSC en placas de 6 pocillos.
   2. Añadir 1 ml de CDS (paso 1.2) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 5-7 min hasta que las células se redondeen. Retire con cuidado el CDS, teniendo cuidado de no desprender las células, y agregue 2 ml de medio fresco Essential 8 y triture suavemente con una pipeta.
   3. Recoja la suspensión celular de un pocillo de una placa de 6 celdas en un tubo de centrífuga de 15 ml y gire el tubo a 1,000 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
   4. Resuspender el pellet celular en 1,2 ml de medio Essential 8 y dispensar 200 μL de la celda 200μL de la suspensión celular (relación de división 1:6) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz que contenga 1,5 ml de medio de cultivo iPSC que contenga 10 μM Y-27632, como se describe en el paso 1.5.
   5. Después de 12-24 h, reemplazar el medio gastado y mantener los cultivos en medio Essential 8 completo precalentado sin Y-27632.
   6. Cambiar el medio de cultivo cada 24 h hasta que los cultivos alcancen la confluencia del 70%-80%.

3. Diferenciación de hiPSCs en campos oculares y linaje retiniano

NOTA: En la figura 1 se muestra un esquema esquemático del proceso de diferenciación.

1. Iniciar el procedimiento de diferenciación una vez que los cultivos hiPSC alcancen la confluencia del 70%-80%.
2. El día 0, cambie el medio de mantenimiento hiPSC a DIM (paso 1.3) que contenga 1 ng/ml de bFGF y 1 ng/ml de Noggin. Añadir 2,0 ml de medio por pocillo de una placa de 6 pocillos y mantener las células a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%.
   NOTA: La retirada gradual de bFGF induce la diferenciación de las PSCs, y la adición de concentraciones crecientes de Noggin (inhibidor de varias BMPs) durante las etapas iniciales induce la diferenciación y neuralización del linaje ectodérmico^11,12 y bloquea el compromiso mesodermo y endodermo. Alternativamente, Noggin puede ser reemplazado por LDN193189. A diferencia de la estrategia de inhibición dual de SMAD reportada anteriormente^20,21, este protocolo no requiere la adición de Activin o SB-431542.
3. El día 1, cambie el medio gastado y agregue DIM que contenga 1 ng / ml de bFGF y 10 ng / ml de Noggin. Agregue 2.0 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar y mantener las células a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%.
4. En el día 2-3, retire el medio gastado y agregue DIM que contenga solo 10 ng / ml de Noggin. Agregue 2.0 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos y cambie el medio cada 24 h. Incubar y mantener las células a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%.
   NOTA: Siempre precaliente el medio de cultivo a 30-37 °C antes de usar. Se puede observar un exceso de moscas volantes y células muertas en cultivos de diferenciación temprana. En tales condiciones, lave los cultivos una vez con 1x DPBS y agregue el medio de diferenciación retiniana. Las pruebas de esterilidad en el medio gastado se pueden hacer semanalmente o según sea necesario.
5. El día 4, elimine el medio gastado y agregue el RDM (paso 1.4). Agregue 2.0 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos y continúe manteniendo los cultivos en RDM a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%, con un cambio de medio fresco todos los días.
   NOTA: Alternativamente, las PSC se pueden cultivar como cultivos en suspensión desde el día 1-3, en placas de 96 pocillos no adherentes y de fondo redondo, a una densidad celular de 5 x 10³ células/100 μL/pocillo para formar cuerpos embrioides (EB) en idénticas condiciones de cultivo en DIM. Los EB bien formados en el día 4 se pueden colocar en placas recubiertas de matriz que contienen RDM y se les permite adherirse, proliferan y se diferencian como se describe a continuación.
6. Alrededor del día 14-18, observe los cultivos bajo un microscopio con un aumento de 10x para la aparición de dominios similares a rosetas neurales que consisten en progenitores tempranos del campo ocular (Figura 2B).
7. Alrededor del día 21-28 (3-4 semanas), observe cultivos bajo un microscopio con un aumento de 4x y 10x para observar la aparición de EFP autoorganizadas y distintas, con una isla central de estructuras neurorretinianas circulares 3D rodeadas de excrecencias contiguas de neuroepitelio y epitelio de la superficie ocular (Figura 2C, D).
   NOTA: Se pueden observar alrededor de 20-30 EFP por pocillo de una placa de 6 pocillos de un cultivo de diferenciación retiniana hiPSC normal. Este número puede variar con otras líneas hiPSC específicas de la enfermedad, según sus antecedentes genéticos y el potencial de diferenciación del linaje retiniano.

4. Recolección de organoides retinianos

1. Tracción a la llama de pipetas de vidrio Pasteur para la recolección manual de copas retinianas.
   NOTA: Utilice pipetas Pasteur de vidrio estéril y esterilizadas en autoclave para la selección del campo ocular.
   1. Encienda un mechero Bunsen. Tome una pipeta Pasteur estéril y sostenga la base en una mano y la punta capilar en la otra. Esterilice y caliente la región cerca de la mitad de la punta capilar, con movimientos de rotación hasta que el vidrio se vuelva flexible. Luego aléjese de la llama y tire hacia afuera rápidamente para crear una punta capilar fina con una luz cerrada.
   2. Sostenga la punta fina horizontalmente frente a la llama y pásela rápidamente a través de la llama en un movimiento hacia afuera para crear un gancho suave o una punta capilar en forma de L.
   3. Use la zona de curvatura externa lisa del gancho capilar como una cuchara fina para levantar y separar suavemente las copas neurorretinianas intactas de los grupos de EFP.
      NOTA: El ángulo liso del gancho capilar de vidrio no causa daño a las células ni crea arañazos en las superficies de cultivo. Esta sencilla herramienta también se puede utilizar eficazmente para la división de colonias hiPSC individuales en patrones de cuadrícula y para pasarlas como grupos de células pequeñas durante la expansión clonal.
2. Cultivo y mantenimiento de copas retinianas para generar organoides retinianos 3D.
   1. En el día 25-30, agregue 4.0 ml de medio de diferenciación retiniana precalentado en un plato de 60 mm de baja fijación antes de prepararse para la cosecha de copas neuro-retinianas.
   2. Trabaje bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 0.63x-4.5x para observar y seleccionar manualmente copas neurorretinianas bien formadas de EFP individuales.
      NOTA: La aparición de excrecencias de células RPE pigmentadas ayuda en la fácil identificación de EFP y las copas neuro-retinianas colocadas centralmente. Las copas retinianas aparecen como estructuras 3D en forma de rosquilla, circulares y translúcidas, con estrías radiales claras, formadas por las células madre retinianas dispuestas linealmente y autoensambladas, a diferencia de los grupos apretados y esféricos o irregulares formados por las neuronas del SNC o las células de la cresta neural²³.
   3. Use los ganchos de pipeta Pasture tirados por la llama para empujar suavemente y sacar la isla neuro-retiniana central dentro de los EFP individuales.
   4. Ajustar una micropipeta de 1 ml para aspirar 100 μL y utilizar micropuntas de 1 ml con aberturas de diámetro ancho para aspirar y transferir las copas retinianas flotantes a las placas de cultivo frescas y poco adherentes preparadas en el paso 4.2.1.
      NOTA: El uso de puntas con un tamaño de orificio más pequeño y una presión de succión más alta puede causar cizallamiento y afectar la integridad de las copas retinianas. Las dimensiones aproximadas de las copas retinianas son de aproximadamente 1-2 mm de diámetro.
   5. Mantener las copas retinianas en RDM como cultivos en suspensión no adherentes e incubarlas a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%.
   6. Día 30-45: Cambie el medio diariamente inclinando suavemente el plato y permitiendo que las copas retinianas se asienten durante unos 30 s. Siga un método de alimentación parcial, eliminando la mitad de los volúmenes de medio gastado y reemplazándolos con volúmenes iguales de medio fresco.
      NOTA: Evite las aspiraciones y transferencias repetidas para evitar cualquier daño a las copas retinianas. Después de 1-2 semanas de cultivo en suspensión, las copas retinianas crecen ligeramente en tamaño (1-3 mm) y se convierten en organoides retinianos 3D autoorganizados (OC-1M) que comprenden progenitores neurorretinianos tempranos dispuestos linealmente que expresan PAX6 y CHX10 (Figura 3Bi).
   7. Día 45-60: Cultivo de los organoides retinianos durante otras 4 semanas en RDM que contiene 100 μM de taurina (ver Tabla de materiales) para apoyar una mejor supervivencia y diferenciación del linaje de los progenitores neuro-retinianos y el desarrollo del tipo de células retinianas maduras (OC-2M).
      NOTA: Alrededor del 70% -80% de las copas retinianas u ópticas recogidas de los EFP permanecen intactas, conservan su laminación y se convierten en organoides retinianos maduros después de 4 semanas de cultivo en suspensión (OC-2M).
   8. Comprobar que los organoides retinianos maduros a las 4 semanas de cultivo en suspensión muestran la aparición de precursores fotorreceptores RCVRN+ y CRX+ y células maduras con una extensión rudimentaria en forma de segmento interno en las capas celulares más externas, recapitulando así el desarrollo normal de la retina y el proceso de maduración in vitro (Figura 3Bii).
      NOTA: Después de retirar las copas neuro-retinianas, los cultivos de diferenciación se pueden mantener continuamente en RDM. Las excrecencias epiteliales proximales que rodean la neuro-retina contienen precursores de células epiteliales pigmentadas de la retina (EPR), que se expanden y maduran aún más para formar monocapas pigmentadas de EPR con morfología típica de adoquines (Figura 4). Las excrecencias distales consisten predominantemente en epitelio de la superficie ocular que contribuye al cristalino y alepitelio corneal. Los tipos de células deseados pueden cosecharse de diferentes zonas de excrecencias de EFP y enriquecerse aún más para establecer cultivos puros.

5. Caracterización de organoides retinianos

1. Caracterización morfológica y molecular
   1. Observe los EFP adherentes y los organoides retinianos flotantes bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 4x y 10x y documente su morfología y dimensiones.
   2. Recolectar alrededor de 20 organoides retinianos en diferentes etapas de maduración (pasos 4.2.3-4.2.6) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando puntas de 1.000 μL de diámetro ancho. Deje que los organoides se asienten en la parte inferior y aspire el medio. Lave las tazas con 1x PBS.
   3. Retire el exceso de PBS y agregue 1.0 ml de reactivo TRIzol (consulte la Tabla de materiales). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Homogeneizar el tejido con un mortero de tubo y triturar con una pipeta de 1,0 ml.
   4. Prepare el ARN total siguiendo el método de reactivo estándar de aislamiento y purificación de ARN, según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   5. Verifique la calidad del ARN en el gel de agarosa y cuantifíquela usando el espectrofotómetro NanoDrop (consulte la Tabla de materiales).
   6. Convierta 1-2 μg de ARN total en ADNc utilizando la enzima transcriptasa inversa según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de cebadores específicos de genes.
   7. Brevemente, preparar la mezcla maestra de ARN-cebador en 10 μL de volumen total como se menciona en la Tabla 2 e incubar el tubo a 65 °C durante 5 min en un termociclador. Transfiera el tubo del termociclador al hielo durante 2 minutos.
   8. Mientras tanto, prepare la mezcla maestra 2 con los reactivos mencionados en la Tabla 3. Añadir esta mezcla maestra al tubo de mezcla de cebador de ARN preparado en el paso 5.1.7. Mezclar suavemente.
   9. Incubar la muestra a 50 °C durante 50 min, luego a 85 °C durante 5 min, y luego mantener a 4 °C para detener la reacción.
   10. Utilice el ADNc sintetizado como plantilla en las reacciones de PCR para verificar la expresión de los marcadores de progenitores neurorretinianos y células retinianas maduras.
   11. Normalizar las plantillas totales de ADNc de cada muestra, a saber, F2-UD (hiPSC-F2-3F1; células indiferenciadas), OC-1M (copa óptica de 1 semana en cultivo en suspensión) y OC-2M (copa óptica de 4 semanas en cultivo en suspensión) mediante PCR semicuantitativa utilizando genes de mantenimiento como hE1fα o GAPDH.
   12. Prepare la mezcla maestra para PCR semicuantitativa, como se menciona en la Tabla 4, y coloque los tubos de muestra de prueba para la amplificación en un termociclador. Las condiciones de amplificación por PCR se mencionan en la Tabla 5.
2. Histología e inmunohistoquímica
   1. Recoger las copas ópticas en un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml y aspirar el exceso de medio (pasos 4.2.3-4.2.6). Enjuague los organoides con 1x PBS y luego lávelos y suspenda en 500 μL de paraformaldehído al 4% para fijarlos durante la noche a temperatura ambiente.
   2. Al día siguiente, lave las tazas en agua desionizada. Deje que las tazas reposen con 95% de alcohol (tres cambios, 15-20 minutos cada una), seguido de 100% de alcohol (tres cambios, 15-20 minutos cada uno), una mezcla 1: 1 de alcohol absoluto y xileno durante 15 minutos, xileno (dos cambios, 15 minutos cada uno) y parafina (tres cambios, 15 minutos cada uno). Incruste este tejido para preparar un bloque de parafina siguiendo los procedimientos estándar. Deja que se enfríe y se solidifique.
   3. Prepare secciones delgadas (~ 4-5 μm de espesor) usando un micrótomo y colóquelas en portaobjetos microscópicos recubiertos de silano (consulte la Tabla de materiales) siguiendo los procedimientos histológicos estándar.
   4. Para la desparafinización, caliente los portaobjetos a 70 °C en un bloque calefactor durante 15-20 min. Una vez que la cera se derrita, lave los portaobjetos con xileno (tres cambios, 3-4 min cada uno), lo que eliminará la parafina por completo.
      NOTA: La eliminación incompleta de la parafina da como resultado una tinción deficiente / irregular de las secciones con una gran cantidad de ruido de fondo.
   5. Rehidrate los portaobjetos utilizando diferentes porcentajes de etanol (100%, 90% y 80%) durante 3 minutos cada uno. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y proceda con la recuperación de antígenos.
   6. Antes de comenzar la recuperación del antígeno, precaliente el tampón de citrato (pH 6.0) en un frasco de Coplin (consulte la Tabla de materiales) utilizando un horno de microondas hasta que alcance los 95-100 ° C.
   7. Sumerja los portaobjetos en un tampón de citrato precalentado y caliente el frasco durante 15 minutos en un horno de microondas. Retire el frasco Coplin del horno y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
   8. Bloquee las secciones para la peroxidasa endógena agregando una mezcla 1: 1 de metanol y peróxido de hidrógeno durante 5 minutos, seguido de lavar las secciones tres veces con 1x PBS.
   9. Permeabilizar las secciones utilizando Triton-X 100 al 0,5% durante 15 min. Lave las diapositivas tres veces con 1x PBS.
   10. Bloquear la unión inespecífica del anticuerpo primario incubando las secciones con suero bovino fetal al 10% (FBS) en 1x PBS durante 1 h.
   11. Incubar las secciones con anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Lave los portaobjetos tres veces con 1x PBS durante 3-5 minutos cada uno para eliminar el anticuerpo no unido.
   12. Agregue el anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente adecuado e incube durante 45 min. Lave las diapositivas tres veces con 1x PBS durante 3-5 minutos cada una.
       NOTA: Los anticuerpos y sus respectivas diluciones se mencionan en la Tabla de materiales. Las secciones de organoides retinianos se inmunomarcaron utilizando PAX6 y CHX10 para detectar células precursoras neurorretinianas tempranas, y utilizando Recoverin y CRX para detectar células precursoras retinianas y fotorreceptoras comprometidas. Del mismo modo, se utilizaron anti-PAX6 y anti-MITF para detectar precursores de EPR, y anti-CRALBP y anti-RPE65 para detectar células maduras pigmentadas de EPR mediante inmunocitoquímica de cultivos monocapa 2D.
   13. Contramanche las secciones con DAPI o PI y móntelas en un portaobjetos de vidrio utilizando el medio de montaje antidecoloración (consulte la Tabla de materiales).
   14. Obtener imágenes y documentar las secciones inmunomarcadas de organoides retinianos y cultivos de EPR utilizando un microscopio de escaneo láser fluorescente o confocal para examinar diferentes capas celulares que expresan diferentes marcadores retinianos.

La diferenciación de hiPSCs en linajes oculares se logra cultivando las células en diferentes cócteles de medio de cultivo que contienen suplementos y factores de crecimiento en pasos secuenciales en diferentes puntos de tiempo, como se describe en la Figura 1. Los cultivos de hiPSC se mantienen en medio Essential 8, el medio pluripotente de mantenimiento de células madre. Una vez que alcanzan una confluencia del 70%-80% (Figura 2A), el medio se reemplaza con el medio de inducción de diferenciación (DIM) en el día 0 (consulte el paso 3.2) que contiene 1 ng / ml de bFGF, 1 ng / ml de Noggin y 1% de suplemento de N2. Junto con el suplemento de N2 inductor neural, Noggin, el inhibidor de señalización BMP, juega un papel crucial en la dirección de las células hacia el linaje neuroectodérmico mediante el bloqueo del compromiso mesodérmico y endodérmico. En el 1º, 2º y3º día, la concentración de Noggin aumenta a 10 ng/ml (consultar los pasos 3.3 y 3.4). A partir del4º día, el DIM se sustituye por Medio de Diferenciación Retiniana (RDM) (paso 3.5), y los cultivos se mantienen continuamente hasta 30 días. El B27 en el cóctel RDM contiene suplementos adicionales como múltiples antioxidantes y D-galactosa, que promueve el metabolismo aeróbico y ayuda a reducir el estrés oxidativo, mejorando la viabilidad de diferenciar las células progenitoras. Además, la presencia de acetato de retinol (vitamina A) y hormonas de crecimiento como el triyodo-I-tironina (T3) promueve la diferenciación del linaje neural y retiniano.

Del14º al18º día, se observa la formación de rosetas neurales, lo que marca el inicio del compromiso del campo ocular (Figura 2B). Los precursores del campo ocular dentro de las rosetas neurales proliferan aún más y se autoorganizan en distintos grupos primordiales del campo ocular (EFP) con estructuras neurorretinianas circulares en el centro. Otros tipos de células como el epitelio pigmentado de la retina (EPR), el epitelio de la cresta neural y las que contribuyen a la superficie ocular emergen y migran como epitelio contiguo con márgenes bien definidos. Los campos oculares bien formados, como se describió anteriormente, se pueden observar entreel día 21y el 28 de diferenciación (Figura 2C, D). La isla central de copas neuro-retinianas se cosechan entre el día 25-30 utilizando una pipeta Pasteur de vidrio tirado a la llama (Figura 2E) y se mantienen como cultivos de suspensión no adherentes en RDM durante otras 1-2 semanas, hasta el día 45. Los progenitores retinianos proliferantes se autoorganizan aún más para formar organoides retinianos 3D de múltiples capas de aproximadamente 2-3 mm de diámetro (Figura 2F, G). A partir del día 46, la RDM se complementa con 100 μM de taurina para promover la neurogénesis y mejorar la supervivencia celular en cultivos organoides in vitro a largo plazo (Figura 2H).

Los organoides retinianos se caracterizan en diferentes etapas de maduración para la expresión de varios marcadores progenitores retinianos mediante PCR con transcripción inversa (RT-PCR) e inmunohistoquímica (IHC). Para ello, los organoides se cosechan para el aislamiento total de ARN en eldía 30 y 60 de diferenciación. Los resultados de la RT-PCR confirmaron la inducción y expresión de marcadores neurorretinianos como NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 y PDE6C en organoides retinianos de 1 semana de edad (4-5 semanas después de la diferenciación, OC-1M ) y organoides retinianos de 4 semanas 8,12 (7-8 semanas después de la diferenciación, OC-2M) (Figura 3A). La inmunohistoquímica y la imagen de fluorescencia han confirmado la expresión de marcadores progenitores retinianos tempranos PAX6, CHX10 y OTX2 en OC-1M y marcadores retinianos maduros RCVRN y CRX en OC-2M 8,12 (Figura 3Bi,ii).

Además de las copas neurorretinianas centrales, los otros tipos de células oculares, como el epitelio pigmentado de la retina (EPR), el epitelio de la cresta neural y las células epiteliales de la superficie ocular, emergen y migran fuera de los EFP. Los progenitores del EPR derivados del neuroectodermo aparecen como células epiteliales dispuestas de forma compacta que rodean las EFP, que maduran gradualmente y se pigmentan a lo largo de los márgenes migratorios desde el día 30-45 (Figura 4A-C). Por lo tanto, estos cultivos de diferenciación adherente, después de la eliminación de las copas retinianas, pueden extenderse hasta el día 45, para cosechar precursores proliferantes del EPR (Figura 4D), que pueden enriquecerse aún más para preparar cultivos monocapa de células del EPR pigmentadas completamente maduras. El EPR pigmentado maduro se puede ver como monocapas con morfología típica de adoquines (Figura 4E). La identidad de las células del EPR se confirma aún más mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra marcadores específicos del EPR como MITF (marcador progenitor del EPR), PAX6 (marcador del EPR progenitor y maduro) y RPE65 (marcador del EPR maduro)10,12 (Figura 4F-H).

Los organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes pueden servir como modelos in vitro para el estudio de diversas enfermedades retinianas hereditarias 7,8,9. Los modelos de células madre específicas de la enfermedad se desarrollan mediante la generación de líneas iPSC específicas del paciente o mediante la introducción de mutaciones específicas de la enfermedad en líneas iPSC de control sanas utilizando el enfoque de edición de genes basado en CRISPR 7,8. Las iPSC mutantes pueden o no diferenciarse eficientemente en tipos de células de la retina dependiendo de las mutaciones genéticas involucradas. Si bien la mayoría de las líneas celulares de control sanas siguieron la línea de tiempo descrita anteriormente, puede haber desviaciones en el caso de las iPSC específicas de la enfermedad en términos de las líneas de tiempo de diferenciación, la morfología de EFP, el tamaño de la copa retiniana, la laminación y la maduración. Se examinó el potencial de diferenciación retiniana de una línea RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) que lleva una deleción bialélica de 10 pb dentro del exón 18 del gen RB1 humano, lo que resulta en un cambio de marco y pérdida completa de la expresión de la proteína RB1. Se observó que la pérdida de expresión de RB1 no afectó el ojo y la diferenciación temprana del linaje retiniano de la línea hiPSC mutante. Sin embargo, se observó un marcado retraso en los plazos y una reducción en la eficiencia de formación de EFP. Las EFP atípicas que surgieron tenían agregados anormales de progenitores retinianos que no lograron laminarse y autoorganizarse en copas retinianas adecuadas (Figura 5A, B) o carecían de la zona circundante del EPR y el epitelio de la superficie ocular (OSE) (Figura 5C). Cuando se recogieron y mantuvieron como cultivos de suspensión, estos grupos progenitores de retina formaron agregados neurorretinianos irregulares (Figura 5D).

Figura 1: Línea de tiempo que representa la diferenciación de las iPSCs en organoides retinianos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Generación de organoides retinianos 3D autoorganizados. (A) Cultivo de hiPSCs en condiciones libres de alimentador. (B) Desarrollo de rosetas neuronales en el día 14 de diferenciación (asterisco). (C,D) Grupos primordiales del campo ocular (EFP) que contienen una estructura central en forma de copa neuro-retiniana (flechas negras) rodeada por la zona migratoria del epitelio (flechas blancas) en el día 21-28 de diferenciación. (E) Pipeta Pasteur de vidrio tirado a la llama con punta ganchuda. La curva suave en la región de la bisagra se utiliza para empujar y levantar las copas de la retina (flecha). (F,G) Copas retinianas recolectadas en el día 25 y cultivadas bajo suspensión para generar organoides retinianos 3D autoorganizados. (H) Organoides retinianos maduros en cultivo en suspensión al día 45. Barras de escala: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización de organoides retinianos. (A) Perfil de expresión génica retiniana mediante RT-PCR de la hiPSC normal indiferenciadalínea 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) y las copas ópticas normales diferenciadas seleccionadas a las 3-4 semanas de diferenciación y maduradas aún más en cultivo en suspensión durante 1 semana (OC-1M) y 4 semanas (OC-2M) respectivamente. Los ADNc de todas las muestras de prueba se normalizaron utilizando eEF1a como control de carga. (B) Imágenes confocales de secciones inmunomarcadas de (i) organoides retinianos inmaduros (OC-1M) utilizando anticuerpos contra los marcadores progenitores neurorretinianos CHX10, PAX6 y OTX2 (en rojo) y (ii) organoides retinianos maduros (OC-2M) utilizando anticuerpos contra los marcadores precursores fotorreceptores Recoverin y CRX (en rojo). La capa más externa marcada de los organoides retinianos con células fotorreceptoras diferenciadoras (recuadro) en los paneles izquierdos se amplía y se muestra en los paneles derechos. DAPI se utilizó como una contramancha (en azul). Las rudimentarias extensiones internas en forma de segmento están marcadas por flechas blancas. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aparición de diferentes tipos de células oculares. (A) Agrupaciones de EFP con la copa neuro-retiniana en el centro y excrecencias migratorias de EPR que muestran pigmentación a lo largo de los bordes de ataque (flecha blanca). (B) Excrecencias epiteliales pigmentadas bien diferenciadas de múltiples EFP alrededor de la isla neuro-retiniana. (C) Un mayor aumento de un EFP muestra la zona migratoria de los progenitores del EPR (flecha blanca) y el epitelio de la superficie ocular (asterisco) que rodea una copa neurorretiniana. (D) Cultivos adherentes extendidos que desarrollaron monocapas de células RPE inmaduras que contienen células pigmentadas y no pigmentadas. (E) Cultivos monocapa de células EPR completamente maduras y pigmentadas que muestran morfología de adoquines al día 60. (F-H) Células RPE que expresan PAX6, MITF y RPE65 en verde. Barra de escala: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Formación anormal de copas retinianas en iPSCs RB1-/- mutantes. (A,B) EFPs con agregados anormales de progenitores retinianos con laminación distorsionada y ausencia de estrías. (C) EFP con la copa neuro-retiniana en miniatura pero que carece de la zona circundante del EPR y el epitelio de la superficie ocular (flecha). (D) Agregados neurorretinianos irregulares formados en cultivo en suspensión. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de cebadores específicos de genes para RT-PCR.

Tabla 2: Mezcla maestra de ARN-cebador para la conversión de ADNc.

Tabla 3: Mezcla maestra 2 para la conversión de ADNc.

Tabla 4: Mezcla maestra para PCR semicuantitativa.

Tabla 5: Condiciones de amplificación por PCR.

Todos los autores no tienen conflicto de intereses o divulgaciones financieras.