Summary
ここでのプロトコルは、マイクロ透析システムを使用して、覚醒しているラットの海馬からの細胞外液の詳細なリアルタイム動的サンプリングを提供します。
Abstract
さまざまな中枢神経系(CNS)疾患が海馬細胞外液(HECF)の組成の変化に関連しています。しかし、意識のあるラットからリアルタイムでHECFを取得することが困難であるため、CNS疾患の進行の評価と民族医学療法の有効性は長い間制限されてきました。心強いことに、脳のマイクロダイアリシス技術は、動的観察、定量分析、および小さなサンプリングサイズの利点を備えた連続サンプリングに使用できます。これにより、生きている動物の脳内の伝統的なハーブとその代謝物からの化合物の細胞外液含有量の変化をモニタリングすることができます。したがって、この研究の目的は、脳脊髄液マイクロ透析プローブを3次元脳定位固定装置を使用してSprague Dawley(SD)ラットの海馬領域に正確に移植し、20 kDaを超える分子量を遮断することでした。次に、高品質のHECFを意識のあるラットから、2.87 nL /分〜2.98 mL /分の範囲で調整可能なサンプリングレートのマイクロ透析サンプリング制御システムを使用して取得しました。結論として、私たちのプロトコルは、マイクロダイアリシス技術の助けを借りて、覚醒ラットでHECFを取得するための効率的、迅速、かつ動的な方法を提供し、CNS関連疾患の病因をさらに調査し、薬効を評価する無限の可能性を提供します。
Introduction
神経変性疾患、外傷性脳損傷、高地低酸素誘発性脳損傷、虚血性脳卒中などの罹患率の高い中枢神経系(CNS)疾患は、世界中で死亡率が上昇する重要な原因です1,2,3。特定の脳領域におけるサイトカインおよびタンパク質変化のリアルタイムモニタリングは、CNS疾患の診断精度および投薬後の脳薬物動態学的研究に寄与する。従来の科学的研究では、特定の物質の検出および薬物動態研究のために、脳組織ホモジネートまたは動物間質性脳液の手動収集を使用します。ただし、これには、サンプルサイズが限られている、インジケーターの変化を動的に観察できない、サンプリング品質が不均一であるなど、いくつかの欠点があります4,5,6。間質液である脳脊髄液は、脳と脊髄を機械的損傷から保護します。血液脳関門(BBB)7が存在するため、その組成は血清の組成とは異なります。脳脊髄液サンプルの直接分析は、CNS病変のメカニズムと創薬の開示をより助長します。必然的に、注射器を介して大槽および脳室から直接手動で取得される脳脊髄液サンプルには、血液汚染、サンプル収集のランダムな可能性、量の不確実性、および複数の検索の可能性がほとんどないという欠点があります8,9。さらに注目すべきことに、従来の間質性脳液サンプリング法は、損傷した脳領域からサンプルを得ることができず、特定の脳領域におけるCNS疾患の病因の探索および標的民族医学療法の有効性評価を妨げる9,10。
脳微小透析は、覚醒動物11において間質性脳液をサンプリングする技術である。微小透析システムは、脳に埋め込まれたプローブの助けを借りて血管透過性を模倣します。微小透析プローブは半透膜で武装しており、特定の脳領域に移植されます。等張性人工脳脊髄液(ACSF)による灌流後、透析された間質性脳液は、小さなサンプルサイズ、連続サンプリング、および動的観察の利点により良好に収集できます12,13。位置に関しては、脳微小透析プローブは、関心のある脳構造または頭蓋貯水槽に選択的に埋め込むことができる14。海馬細胞外液(HECF)中の内因性物質の異常なレベルの観察は、CNS疾患の発生または疾患の病因を示唆しています。いくつかの研究は、統合失調症のD-アミノ酸、アルツハイマー病のβ-アミロイドおよびタウタンパク質、外傷性脳損傷のニューロフィラメント軽鎖、低酸素虚血性脳症のユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素L1などのCNS疾患のバイオマーカーを脳脊髄液で分析できることを示しました15,16,17。.脳微小透析サンプリング技術に基づく化学分析法は、特定の脳領域に拡散および分布する民族医学の有効成分などの外因性化合物の動的変化を監視するために使用することができる14。
この記事では、覚醒ラットにおける動的HECF取得の特定のプロセスを紹介し、その浸透圧を測定してサンプルの品質を確保します。
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Protocol
実験プロトコルは、成都中医薬大学の実験動物の使用および施設動物管理および使用委員会の要件に従って実施されました(記録番号:2021-11)。雄のSprague Dawley(SD)ラット(280 ± 20 g、6〜8週齢)を本研究に使用した。
1. 脳微小透析プローブ埋入手術
- ラット麻酔の導入と維持には、それぞれ3%と1.5%のイソフルランを使用し、0.6 L / minの空気酸素混合物中の動物麻酔システムを使用します。.ラットが痛み反射と角膜反射の両方なしで深く麻酔されていることを確認してください。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医用軟膏を使用してください。
- 麻酔をかけたラットの頭蓋骨の毛皮を、準備エリアの電気かみそりで取り除きます。次に、麻酔をかけたラットを定位固定脳ロケーターに固定します。滅菌綿球で手術領域にポビドンヨードとエタノールを3回塗布することにより、手術前に手術部位を消毒します。 局所鎮痛のためにブピバカインを局所的に 塗布する。注:マイクロダイアリシスベースのHECFサンプル取得の全プロセスを 図1に示します。
- 外科用ハサミで中央から1.5cmの頭蓋顔面切開を行い、外科用ハサミと眼科用鉗子を使用して骨膜を取り除きます。
- ブレグマを基底位置と考え、頭蓋骨に穴を開け、頭蓋ドリルを使用して前後(AP)位置(-2 mm)、中外側(ML)位置(-3.5 mm)、背腹側(DV)位置(-3.5 mm)(海馬CA1領域)に2 mmの開口部をドリルします。
- 定位固定装置脳ロケーターのグリッパーにカテーテルスタイレットを固定し、AP(-2 mm)、ML(-3.5 mm)、およびDV(0 mm)の位置でマイクロ透析ケーシングの位置を調整します。脳ステレオロケーターのDV値を調整し、マイクロダイアリシスケーシングを3.5mmの深さのCA1領域に移植します。
注意: 動物の温度維持装置を使用して、操作中は動物の温度を37°Cに維持してください。 - 直径2 mmの開口部をさらに3つ開けて、3つの開口部がプローブ開口部が中央に位置する三角形を形成するようにします。1 mmの深さで開口部にネジを埋め込みます。
- プローブカテーテルを歯科用セメントで固定し、4-0外科用縫合糸を使用して皮膚を閉じます。プローブの配置については、 図2 を参照してください。
- 回復するためにラットをケージに7日間入れます。術後1日1回、ブピバカイン(1.5 mg / kg)を局所浸潤させます。. 食料と水を 自由に提供します。手術後の乾燥を防ぐために、ヒアルロン酸ナトリウム点眼薬を1日3回使用してください。
注:無菌手術室ですべての手順を実行してください。37°Cの条件下で胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。.完全に回復するまで、手術を受けた動物を他の動物と一緒に戻さないでください。
2.微小透析システムの接続とプローブチェック
- 製造元の指示に従って、マイクロ透析ポンプ、マイクロシリンジ、覚醒活動装置、および極低温サンプルコレクターを接続します。ACSF付きのマイクロシリンジをマイクロ透析ポンプに取り付け、マイクロ透析ポンプを1μL/minの速度に設定して、パイプライン内の空気を排出します。
- パイプラインと脳微小透析プローブ(メンブレン:PAES、メンブレン長:4 mm、メンブレンOD:0.5 mm、カットオフ:20 kDa、シャフト長:14 mm)を接続します。微小透析ポンプを1 μL/minの速度で操作し、プローブの表面がわずかに湿るまでACSFをプローブに注入します。その後の使用のために、プローブをヘパリンナトリウム注射液に浸します。
注意: 重力下で肉眼で見られるように、ACSFの大きな流れがプローブの半透膜から落ちる場合は、プローブを新しいものと交換してください。
3.覚醒ラットからのHECFの収集
- 脳微小透析プローブをプローブカテーテルに挿入し、ラットをパッド付きのチャンバー(高さ:360 mm、直径:400 mm)に入れて、ラットが自由に動き回れることを確認します。
- パイプライン、マイクロシリンジポンプ、脳マイクロ透析プローブを接続します。ラット拘束装置の上部にある穴とステンレス鋼のスイベル を介して ラットを利用します。
- マルチチャンネルスイベルコントローラーをオンにして、ラットの自由な動きの間にマイクロ透析パイプラインが絡み合わないようにします。マイクロシリンジポンプの電源を入れ、ACSFを1 μL/minの速度でポンピングします。微小透析HECF収集システムの60分間の平衡化後、定期的にHECFを収集します。
- 冷蔵フラクションコレクター内のHECFサンプルの流量がACSF注入と一致していることを確認してください。20 μLのHECFを収集し、自動的に次のサンプリングチューブに交換します。プローブを挿入するときは、プローブメンブレンが損傷していないか確認してください。
4. HECFの浸透圧の測定
- 浸透圧計の電源を入れ、検出システムにログインします。タッチスクリーンの Cal ボタンをクリックし、ページの Res ボタンをクリックして、以前のキャリブレーションメモリをクリアします。
- 気泡のない純水100 μLを含む1.5 mLチューブを測定ヘッドに取り付けます。測定ヘッドを冷たいヒドラジン容器の底に引きます。
- タッチスクリーンにサンプル番号0を入力し、テストを確認します。ダイオード針をサンプルチューブにすばやく浸し、すばやく引き出して、-6.2°Cの温度でサンプルの結晶化を誘発します。
- 画面が表示されるのを待ちます:測定ヘッドを上に押し、 Cal と Cal0 を順番にクリックしてキャリブレーションします。300 mOsmの校正液で測定を行い、上記のようにHECFサンプルの浸透圧を測定します。
注意: キャリブレーションまたは測定後は、柔らかいペーパータオルで測定ヘッドを拭いてください。気泡のないHECFサンプルはよく混合する必要があります。
5. サンプリング後の微小透析装置・装置のメンテナンス
- サンプリング終了後、脳微小透析プローブをプローブカテーテルから取り出します。プローブを脱イオン水に浸し、脱イオン水で12時間洗浄して、パイプラインとプローブから座礁した塩の堆積物を取り除きます。
- プローブを取り外し、4°Cの0.05%トリプシン溶液に入れます。 パイプラインを25°Cの風乾オーブンで乾燥させ、室温で保管します。
注意: マイクロダイアリシスプローブは高価であり、このステップによりプローブの再利用性を高めることができます。プローブ表面に付着したタンパク質は、トリプシン溶液で消化してプローブ膜がタンパク質によってブロックされるのを防ぐことができ、トリプシンはプローブ材料に影響を与えませんでした。
6.サンプリング後の動物の治療
- サンプリング後、ラットに1.5%イソフルランを吸入させ、続いて動物倫理に従って5%イソフルランを過剰摂取させることで、ラットを痛みを伴わずに安楽死させる。
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Representative Results
上記の実験プロトコルおよび表1に設定されたサンプリングパラメータに従って、設定されたサンプリングレートで水様、無色、および透明なラットHECFが得られた(図1K)。得られたラットHECFの浸透圧は290-310mOsm/Lであり、これは間接的にサンプルの品質を保証することができる18,19。
図1:微小透析サンプリング装置を用いて採取したラットHECF 。 (A,B)動物麻酔システムとデジタルディスプレイ定位固定装置を使用して、ラットを麻酔および固定しました。(C)マイクロダイアリシスシステム用サンプリング採取チューブ。(D)ラットの頭蓋解剖学的構造は、ブレグマとラムドイド縫合糸をはっきりと示しました。(e)カテーテルスタイレットおよび脳微小透析プローブに、プローブの透析膜およびスチールシャフトを呈する。(F)微小透析プローブの in vitro 固定架台を、プローブの保存および洗浄に適用した。(g)シリンジポンプの4つのシリンジ液送達。(H, I)自由に動く動物のためのシステム上のステンレス鋼のスイベルとマルチチャンネルスイベルコントローラー。(J)2チャンネル冷蔵フラクションコレクター。(k)ラットHECFをマイクロダイアリシスにより得た。(L)ラット用の自由移動タンク。(m)微小透析サンプリングシステムの関連コンポーネント-。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラット脳の海馬領域に埋め込まれた脳微小透析プローブの模式図。 3つの開口部が三角形を形成し、プローブオリフィスは中央に配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメータ項目 | 価値 |
| 灌流率 | 1 μL/分 |
| サンプリングレート | 1 μL/分 |
| サンプリング温度 | 4 °C |
表1:微小透析脳脊髄液サンプリングシステムのパラメータを設定します。
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Discussion
中枢神経系疾患の病因はまだ完全には理解されておらず、新しい治療法や薬の開発を妨げています。研究によると、ほとんどのCNS疾患は海馬病変と密接に関連しています20、21、22。提案された脳微小透析技術は、脳の特定の領域、特に海馬を標的とすることができるため、HECFを収集する従来のアプローチとは一線を画しています。プローブは、移植手術によってラット脳のCA1領域に配置され、人工膜の受動拡散によって特定のサイズの分子を分離します。プローブの移植は、プローブの移植によって引き起こされた可能性のあるプローブへの損傷およびタンパク質、凝集体23などの脳組織の局所的な損傷が、実験の失敗または測定の不正確さの増加につながる重要なステップである。したがって、プローブの完全性をチェックし、微小透析プローブ移植手術後に動物に適切な回復期間を与えることが不可欠です。
近年、脳疾患を治療するための民族医学の使用は増加しています24,25。脳内の脳脊髄液および間質液を得る伝統的な方法は、ほとんどの場合、血液汚染の可能性が高い1回限りのイベントです8,9。最も重要なことは、体内の薬物とその代謝産物の動的な変化を観察することは不可能です。覚醒生物のオンラインサンプリング技術として、脳マイクロダイアリシスは、in vivo、低侵襲、小さなサンプルサイズ、リアルタイム、および動的であるという特徴を有し、これは従来のサンプリング方法の欠陥を補う26。最新の分析および検出技術と組み合わせることで、疾患因子および薬物成分の定性的および定量的分析をより正確に行うことができます27。一般に、脳疾患の研究に脳微小透析を導入し、民族医学の作用機序を明らかにすることは非常に重要です。
HECFのin vitroマイクロダイアリシスサンプリング技術は、薬物によるCNS疾患の予防と治療に適用できます。HECF組成の変化を伴う二次性脳損傷は、虚血性低酸素性脳損傷および外傷性脳損傷の死亡率増加の主な原因である。それに応じて、脳マイクロダイアリシス技術に基づくHECFの分析は、これらのCNS疾患の早期バイオマーカーを動的に診断して、罹患率と死亡率を低下させ、予後を改善することができます28,29。治療後、前臨床試験では均質化した全脳組織を測定することで脳組織中の薬物濃度を日常的に測定しますが、特定の脳領域の濃度を直接観察することはできません。これを克服するために、特定の脳領域における薬物濃度および病理学的マーカーを、脳微小透析サンプリング技術30と組み合わせて定量的に分析することができる。特に多成分のエスニックハーブの場合、脳の微小透析サンプリングに基づく化学分析は、CNS疾患の治療における組成-脳領域-メカニズムの謎に焦点を当て、明らかにする可能性があります31,32。さらに、ラットHECFの色、透明度、浸透圧の変化は、脳出血、脳腫瘍、髄膜炎などのさまざまな病状で発生する可能性があります。HPLCまたは質量分析を使用して、研究者はさまざまな脳症におけるHECF組成の変化を決定できます。
一般に、脳マイクロダイアリシスサンプリング技術は、CNS疾患の病理学的メカニズムの調査と新薬の開発を容易にすることができます。しかしながら、システムの効果的な適用のために克服する必要があるさらなる制約には、脳の標的領域への微小透析プローブの挿入後の周辺組織への損傷、BBB破壊の可能性、および膜を横切る限られた物質移動が含まれる14、33、34。結論として、脳マイクロ透析技術は、CNS病因の探索と新薬の開発において幅広い応用の見通しがあります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(82104533)、四川省科学技術局(2021YJ0175)、および中国ポスドク科学基金会(2020M683273)の支援を受けました。著者らは、Tri-Angels D&H Trading Pteのシニア機器エンジニアであるYuncheng Hong氏に感謝の意を表します。Ltd.(シンガポール)は、マイクロダイアリシス技術の技術サービスを提供しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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