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Biology

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Abstract

Die Skelettmuskulatur beherbergt verschiedene Populationen adulter Stammzellen, die zur Homöostase und Reparatur des Gewebes beitragen. Skelettmuskelstammzellen (MuSCs) haben die Fähigkeit, neue Muskeln zu bilden, während fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) zum stromalen Stützgewebe beitragen und die Fähigkeit haben, Fibroblasten und Adipozyten zu bilden. Sowohl MuSCs als auch FAPs befinden sich in einem Zustand des verlängerten reversiblen Zellzyklusaustritts, der als Ruhezustand bezeichnet wird. Der Ruhezustand ist der Schlüssel zu ihrer Funktion. Ruhende Stammzellen werden üblicherweise aus mehreren Muskelgeweben gereinigt, die in einer einzigen Probe zusammengefasst sind. Neuere Studien haben jedoch deutliche Unterschiede in den molekularen Profilen und der Ruhetiefe von MuSCs gezeigt, die aus verschiedenen Muskeln isoliert wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Untersuchung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Skelettmuskeln und stellt Strategien zur molekularen Analyse der Stammzellaktivierung vor. Es wird detailliert beschrieben, wie Muskeln unterschiedlichen Entwicklungsursprungs, Dicke und Funktionen isoliert und verdaut werden, wie z. B. Zwerchfell, Trizeps, Gracilis, Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GA), Soleus, Extensor digitorum longus (EDL) und die Massetermuskeln. MuSCs und FAPs werden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) aufgereinigt und mittels Immunfluoreszenzfärbung und 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Inkorporationsassay analysiert.

Introduction

Die Skelettmuskulatur hat aufgrund des Vorhandenseins von Muskelstammzellen (MuSCs) eine hohe Regenerationsfähigkeit. MuSCs befinden sich auf den Myofasern unterhalb der Basallamina und befinden sich in einem Ruhezustand mit verlängertem, reversiblem Zellzyklusausgang 1,2,3,4. Bei einer Verletzung werden MuSCs aktiviert und treten in den Zellzyklus ein, um amplifizierende Vorläuferzellen entstehen zu lassen, die sich differenzieren und zu neuen Myofasern verschmelzen können 2,5. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass MuSCs für die Muskelregeneration absolut essentiell sind 6,7,8. Darüber hinaus kann ein einzelner MuSC sowohl neue Stammzellen als auch neue Myofasern transplantieren und erzeugen9. Die Skelettmuskulatur beherbergt auch eine Population von mesenchymalen Stromazellen, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet werden und eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung der MuSC-Funktion während der Muskelregeneration spielen 6,10,11,12.

Aufgrund ihres Potenzials, die Muskelregeneration zu koordinieren, besteht ein enormes Interesse daran, zu verstehen, wie MuSCs und FAPs funktionieren. Ruhende MuSCs werden durch die Expression der Transkriptionsfaktoren Pax7 und Sprouty1 sowie des Calcitoninrezeptors des Zelloberflächenproteins markiert, während ruhende FAPs durch den Zelloberflächenprotein-Platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRa) gekennzeichnet sind10,12,13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass MuSCs und FAPs mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) aus der Skelettmuskulatur gereinigt werden können9,15,16,17,18,19,20,21. Während diese Protokolle die Fähigkeit, MuSCs und FAPs zu untersuchen, erheblich verbessert haben, besteht ein Nachteil darin, dass die meisten dieser Protokolle die Isolierung von MuSCs aus einem Pool verschiedener Muskelgewebe erfordern. Neuere Arbeiten von uns und anderen haben Unterschiede im Zellphänotyp und in der Genexpression zwischen MuSCs aufgezeigt, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden22,23. MuSCs aus dem Zwerchfell, dem Trizeps und den Gracilien zeigen eine schnellere Aktivierung als MuSCs aus den Muskeln der unteren Hintergliedmaßen22, während MuSCs aus dem extraokularen Muskel eine schnellere Differenzierung zeigen als MuSCs aus dem Zwerchfell und den Muskeln der unteren Hintergliedmaßen23.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Skelettmuskeln (Abbildung 1). Dazu gehören die Dissektion des Zwerchfells, des Trizeps, des Gracilis, des Tibialis anterior (TA), des Soleus, des Extensor digitorum longus (EDL), des Gastrocnemius (GA) und des Massetermuskels. Präparierte Muskeln werden anschließend durch enzymatische Verdauung mit Kollagenase II (eine Protease, die spezifisch auf die Pro-X-Gly-Pro-Aminosequenz im Kollagen abzielt und den Abbau von Bindegewebe und Gewebedissoziation ermöglicht24) und Dispase (eine Protease, die Fibronektin und Kollagen IV spaltet und so eine weitere Zelldissoziation ermöglicht25) dissoziiert). MuSCs und FAPs werden mittels FACS aus Einzelzellsuspensionen isoliert. Als Beispiele für nachgeschaltete Assays für die Zellanalyse wird die Stammzellaktivierung durch den Einbau von 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU) bestimmt, während die Zellreinheit durch Immunfluoreszenzfärbung für die zelltypspezifischen Marker Pax7 und PDGFRa bestimmt wird.

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Protocol

Das vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflegerichtlinien der Universität Aarhus und den örtlichen Ethikvorschriften durchgeführt.

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Vorschriften der örtlichen Ethikkommission für Tierversuche und den Umgang mit postmortalen Nagetierproben einhalten. Mäuse sind eine potenzielle Quelle für Allergene; Falls vorhanden, schalten Sie die Abluft ein und platzieren Sie sie über dem Arbeitsbereich, um eine übermäßige Exposition gegenüber Allergenen zu vermeiden. Tragen Sie alternativ einen Mund-Nasen-Schutz, wenn das Experiment regelmäßig durchgeführt wird. Dieses Protokoll beinhaltet die Arbeit mit scharfen Gegenständen, und es wird empfohlen, sich mit den Verfahren und der Logistik für die Anwendung von Erster Hilfe im Falle einer Schnittwunde vertraut zu machen.

1. Vorbereitung (1-2 h; am Tag vor der Präparation)

Anmerkungen: Die Lösungen, Platten und Medien werden unter sterilen Bedingungen hergestellt und vor der Verwendung filtriert (0,45 μm), sofern nicht anders angegeben. Es werden Stammlösungen aus Dispase (11 U/ml in PBS) und Kollagenase II (1.000 U/ml in PBS) hergestellt und bei -20 °C gelagert (Tabelle 1). Die Stämme werden aufgetaut und in Schritt 4.2.6 für die Nachvergärung verwendet.

  1. Kollagenbeschichtung einer 96-Well-Halbflächenplatte
    1. Bereiten Sie saures Wasser vor. 5,15 ml Eisessig in 895 ml autoklaviertes Wasser in einem 2-Liter-Becherglas hinzufügen.
    2. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,45 μm, 500 ml Filtereinheit. Geben Sie 800 ml des gefilterten sauren Wassers in eine 1-Liter-Flasche.
    3. Geben Sie 40 ml sterile Kollagenstammlösung in die Flasche. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Schwenken und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C lichtgeschützt.
    4. Eine oder mehrere 96-Well-Platten mit halber Fläche mit Kollagen bestreichen. Geben Sie 50 μl Kollagen-Überzugslösung in jede Vertiefung und beschichten Sie die Platte über Nacht (ON) bei 4 °C.
    5. Saugen Sie die Kollagenlösung am nächsten Tag mit einem Vakuumsauger ab und waschen Sie die Platte 2x durch Zugabe von 100 μl autoklaviertem Wasser und Absaugen.
    6. Kippen Sie den Deckel des Tellers und lassen Sie den Teller 20-30 Minuten in der Haube trocknen.
    7. Wenn die Platte vollständig getrocknet ist, wickeln Sie sie in Alufolie ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C. Beschichtete Platten können bis zu 4 Wochen gelagert werden.
      HINWEIS: Die Kollagenbeschichtung ermöglicht die Zelladhäsion. Es ist wichtig, freies Kollagen wegzuspülen, da es die Zellfunktion und die Signalübertragung beeinträchtigen könnte (z. B. die Bindung von Kollagen V an die Calcitoninrezeptoren auf den MuSCs)26.

2. Vorbereitung (0,5 h; Tag der Präparation):

  1. Vorbereitung von zusätzlichen Lösungen und Arbeitsplätzen
    1. Bereiten Sie steriles Waschmedium vor, indem Sie 50 ml Pferdeserum und 5 ml Pen/Streptokokken zu 445 ml des F10-Mediums von HAM hinzufügen. Arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden.
    2. Berechnen und wiegen Sie die geeignete Menge an Kollagenase II, die zur Herstellung des Dissoziationspuffers benötigt wird. (Für jede Maus werden 26.000 Einheiten Kollagenase II verwendet, um 40 ml Dissoziationspuffer bei 650 U/ml Kollagenase II herzustellen). Geben Sie das abgewogene Pulver in ein konisches 50-ml-Röhrchen und lagern Sie es auf Eis.
    3. Bereiten Sie zwei 10-cm-Schalen zur Muskelisolierung vor. Gießen Sie 3 ml Waschmedium (Tabelle 1) in jede Petrischale. Bringen Sie die 10-cm-Schalen zur späteren Verwendung außerhalb der Laminar-Flow-Haube.
    4. Bereiten Sie die Materialien für die Muskelverdauung vor. Beschriften Sie basierend auf der Anzahl der Proben die entsprechende Anzahl von konischen 50-ml-Röhrchen (acht pro Maus, eines für jeden Muskel) und lassen Sie sie auf dem Tisch liegen. Besprühen Sie die Nadeln, 10-ml-Spritzen und 40-μm-Zellsiebe mit 70%igem Ethanol (jeweils acht Stück pro Maus, eines für jeden Muskel) und bringen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube. Befestigen Sie die Nadeln an den Spritzen.
    5. Bereiten Sie die Materialien für die Sortierung vor. Beschriften Sie 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden und Siebkappen basierend auf der Anzahl der Proben. Decken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie ab und lassen Sie sie in der Laminar-Flow-Haube.
    6. Entsprechend der Anzahl der zu sortierenden Proben und Populationen werden 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl Waschmedium für die Zellentnahme vorbereitet (16 pro Maus, ein Röhrchen für jede Zellpopulation pro Muskelgewebe). Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis auf.

3. Muskeldissektion (20-30 min)

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt. Der Eingriff kann mit einer oder mehreren Mäusen durchgeführt werden. Eine Maus reicht jedoch aus, um sowohl die Proben für die Sortierung als auch die Kontrollen für die Einrichtung von Kompensations- und FACS-Gattern vorzubereiten.

  1. Muskelisolation einleiten
    1. Bereiten Sie den unsterilen Arbeitsbereich für die Präparation und Muskelisolierung vor. Desinfizieren Sie den Arbeitsplatz mit 70% Ethanol. Legen Sie eine sterile schützende Einwegunterlage auf den Arbeitsplatz.
    2. Zeichne mit einem Permanentmarker für jeden Muskel ein Kästchen auf den Deckel einer Petrischale, um den isolierten Muskel später zu platzieren.
    3. Sprühen Sie die chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol ein.
    4. Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Inhalation und/oder zervikale Luxation.
    5. Isolieren Sie die einzelnen Muskeln (jeweils von einer Maus, wenn Sie mehrere Mäuse verwenden). Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das Fell zu benetzen und die Haut zu desinfizieren. Legen Sie die Maus mit dem Bauch nach oben auf die Unterlage. Eine Übersicht über alle acht Muskeln und ihre jeweilige anatomische Lage ist in Abbildung 2A dargestellt.
  2. Isolation der Gracilis-Muskulatur
    1. Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 cm langen horizontalen Schnitt in die Bauchhaut.
    2. Entfernen Sie die Haut: Greifen Sie mit Daumen und Zeigefinger mit beiden Händen nach dem oberen und unteren Teil des Schnitts. Ziehe an jeder Seite des Einschnitts, um die Haut des Rumpfes und der unteren Extremitäten zu zerreißen und zu teilen. Ziehen Sie die Haut der unteren Extremität nach unten, um beide Hintergliedmaßen freizulegen (von der Hüfte bis zu den Zehen nach unten). Ziehen Sie ebenfalls nach oben, um den Oberkörper freizulegen.
    3. Lokalisieren Sie den Musculus gracilis (Innenseite des Oberschenkels). Greifen Sie mit einer gekrümmten Pinzette nach den Gracilien und heben Sie den Muskel leicht an (Abbildung 2B). Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 cm langen Schnitt (Abbildung 2C), aus dem die Gracilis herausgeschnitten und vollständig isoliert wird (Abbildung 2D). Wiederholen Sie dies für das andere Bein, um den zweiten Gracilis-Muskel zu isolieren.
  3. Isolierung der TA- und EDL-Muskeln (untere Hintergliedmaße, ventrale Seite)
    1. Schneiden Sie die Faszie mit einem Skalpell durch, indem Sie einen 0,5 cm langen Schnitt entlang der lateralen Seite der Tibia (dem dicksten Knochen der unteren Hintergliedmaßen) machen. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Faszien zu greifen, und ziehen Sie, um sie zu entfernen.
      HINWEIS: Wenn die Faszie vollständig entfernt ist, sind die Sehnen am distalen Ende des Hinterbeins sichtbar und können getrennt werden.
    2. Verwenden Sie gerade Pinzetten mit superfeinen Spitzen, um zwischen die distale Sehne der TA (laterale Seite der Tibia) und die EDL (unterhalb der TA) zu legen (Abbildung 2E-G).
      HINWEIS: Mit zunehmender Erfahrung kann anstelle der geraden Pinzette das stumpfe Ende einer Skalpellklinge verwendet werden.
    3. Schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um die Muskeln zu trennen.
    4. Führe die gerade Pinzette zurück zum distalen Ende. Durchtrennen Sie die distale Sehne.
    5. Greifen Sie sanft die distale Sehne des Muskels mit einer gekrümmten Pinzette. Heben Sie den Muskel nach oben und über seinen proximalen Ansatz und durchtrennen Sie die proximale Sehne vorsichtig so nah wie möglich an ihrem Ansatzpunkt. Schneiden Sie das andere Ende ab und geben Sie den TA in eine Petrischale.
    6. Verwenden Sie gerade Pinzetten mit superfeinen Spitzen, um unter die distale Sehne der EDL zu gelangen.
    7. Schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um die Muskeln zu trennen.
    8. Führe die gerade Pinzette zurück zum distalen Ende. Durchtrennen Sie die distale Sehne, ohne den Muskel zu beschädigen.
    9. Fassen Sie die distale Sehne des EDL sanft mit einer gekrümmten Pinzette. Heben Sie den Muskel nach oben und über seinen proximalen Ansatz und durchtrennen Sie die proximale Sehne vorsichtig so nah wie möglich an ihrem Ansatzpunkt. Schneiden Sie das andere Ende ab und geben Sie die EDL in eine Petrischale. Wiederholen Sie dies für die andere Hintergliedmaße, um den zweiten TA- und EDL-Muskel zu isolieren.
  4. Isolierung der GA- und Soleus-Muskulatur (untere Hintergliedmaße, dorsale Seite)
    1. Verwenden Sie eine gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen, um zwischen die Achillessehne und die unteren Hintergliedmaßenknochen zu gelangen.
    2. Schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um den Muskel zu trennen.
    3. Führe die gerade Pinzette zurück zum distalen Ende. Durchtrennen Sie die distale Sehne.
      HINWEIS: Um eine Schädigung des Musculus soleus, der unter dem GA liegt, zu vermeiden, schneiden Sie so nah wie möglich an seinem distalen Achillessehnenansatz ab, so dass ein Teil der Sehne am GA befestigt bleibt (Abbildung 2H).
    4. Um den Musculus soleus freizulegen und zu isolieren, ziehen Sie den GA nach oben und über das Wadenbein (der dünnste der beiden Knochen in der unteren Hintergliedmaße).
      HINWEIS: Der Musculus soleus zeichnet sich durch seine charakteristische dunkelrote Farbe im Vergleich zum GA aus (Abbildung 2I).
    5. Lokalisieren Sie die proximale Soleussehne. Gehen Sie mit einer geraden Pinzette zwischen Soleus und GA.
    6. Bewegen Sie die Pinzette in Richtung des distalen Endes des Muskels, um den Soleus vom GA zu trennen.
    7. Isolieren Sie zuerst den Soleus. Durchtrennen Sie die proximale Sehne, greifen Sie die Sehne mit einer gekrümmten Pinzette und heben Sie den Soleus vorsichtig an, um Zugang zu seiner distalen Sehne zu erhalten. Durchtrennen Sie die distale Sehne, um den Soleus vom GA zu isolieren. Legen Sie den Soleus in die Petrischale mit Spülmedium (Abbildung 2J)
    8. Schneiden Sie die GA und legen Sie sie in die Petrischale. Wiederholen Sie dies für das andere Bein, um den zweiten Soleus und den GA-Muskel zu isolieren.
  5. Isolierung der Trizepsmuskulatur (obere Vordergliedmaße, Rückenseite)
    1. Verwenden Sie eine gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen, um zwischen den Trizepsmuskel und den Oberarmknochen (den Hauptknochen des oberen Vorderbeins) zu gehen (Abbildung 2K-M).
    2. Schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um den Muskel zu trennen. Schneide das proximale Ende des Muskels durch.
    3. Greifen Sie das proximale Ende des Trizeps mit einer gekrümmten Pinzette und ziehen Sie es nach oben und über den Ellbogen, um Zugang zur distalen Sehne zu erhalten. Durchtrennen Sie die distale Sehne des Trizeps, übertragen Sie den Muskel in eine Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang für die andere Vordergliedmaße.
  6. Isolierung der Massetermuskulatur
    1. Entfernen Sie das Fell und die Haut vom Kiefer. Machen Sie mit einer Schere einen horizontalen Schnitt von 0,5 cm. Drücken Sie mit beiden Händen mit Daumen und Zeigefinger auf jede Seite des Einschnitts. Entfernen Sie die Haut, indem Sie nach oben und unten ziehen.
    2. Lokalisieren Sie die Hauptsehne des Kaumuskels (kaudal, unterhalb des Auges). Führen Sie die flache Skalpellklinge zwischen Knochen und Muskel ein (Abbildung 2N). Schneide die Sehne durch.
    3. Fassen Sie die Hauptkausehne mit einer gekrümmten Pinzette. Schneiden Sie es mit einer Skalpellklinge oder einer Schere in rostraler Richtung auf, um den Massetermuskel vom Kieferknochen zu trennen (Abbildung 2O, P). Legen Sie den isolierten Massetermuskel in die Petrischale. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kaumuskel.
  7. Isolierung des Zwerchfellmuskels
    Anmerkungen: Achten Sie beim Isolieren des Zwerchfellmuskels darauf, vorsichtig zu schneiden, um ein Einschneiden in die inneren Organe und den Darm zu vermeiden, da dies eine Kontaminationsquelle darstellt.
    1. Machen Sie mit einer Schere eine Thorakotomie (einen Schnitt zwischen den Rippen) in der Mitte des Brustbeins (ein langer flacher Knochen, der sich in der Mitte des Brustkorbs befindet und die Rippen verbindet) und schneiden Sie durch das Brustbein (Abbildung 2Q).
    2. Legen Sie die Membran frei, indem Sie 360° durch den Brustkorb schneiden.
    3. Trennen Sie den Oberkörper vom Unterkörper. Schneiden Sie mit einer Schere die Luftröhre, die Speiseröhre, die Hohlvene und die Bauchschlagader durch.
    4. Trennen Sie die Membran vom Unterkörper. Machen Sie mit einer Schere eine Laparotomie (ein chirurgischer Schnitt in die Bauchhöhle) 1 cm unterhalb des Brustbeins und machen Sie einen 360°-Schnitt (Abbildung 2R).
    5. Setzen Sie die geschlossene Schere zwischen Brustkorb und Bauchorgane und drücken Sie sie nach unten. Ziehen Sie vorsichtig am Brustkorb, um ihn von den Bauchorganen zu trennen (Abbildung 2S).
    6. Trennen Sie die Membran vom Brustkorb. Halten Sie die Membran locker zwischen zwei Fingern und schneiden Sie den Brustkorb mit einer Schere durch. Verwenden Sie eine Schere, um die Membran in einem 360°-Schnitt so nah wie möglich an den Rippen zu schneiden. Legen Sie das isolierte Diaphragma in eine Petrischale.
      HINWEIS: Während der zervikalen Luxation kann das Zwerchfell reißen und gegen den Brustkorb kollabieren, was die Lokalisierung erschwert. Der Muskel kann immer noch isoliert werden. Identifiziere den kollabierten Muskel, halte ihn zwischen zwei Fingern und schneide 360° entlang des Brustkorbs.

4. Muskelverdauung zu einer einzelligen Suspension (~1 h 35 min)

Anmerkungen: Die folgenden Schritte umfassen nicht sterile (Schritte 4.1-4.2) und sterile Arbeitsumgebungen (Schritt 4.3).

  1. Mechanischer Aufschluss
    1. Legen Sie die isolierten Muskeln in den Deckel einer 10 cm Petrischale.
    2. Greifen Sie mit einer gekrümmten Pinzette nacheinander nach den isolierten Muskeln. Entfernen Sie für den Soleus und GA die restlichen Teile der Achillessehne.
    3. Zerkleinern Sie die isolierten Muskeln mit einer Schere nacheinander, indem Sie sie in etwa 1 mm3 Stücke schneiden.
  2. Enzymatische Verdauung
    1. Bereiten Sie den Muskeldissoziationspuffer vor, indem Sie dem gewogenen Kollagenase-II-Pulver 40 ml kaltes Waschmedium hinzufügen (Kollagenase II: 650 U/ml in Waschmedien).
      Anmerkungen: Verwenden Sie frisch zubereiteten Muskeldissoziationspuffer, um eine optimale enzymatische Aktivität zu gewährleisten.
    2. Übertragen Sie die gehackten Muskeln in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Dissoziationspuffer.
    3. Inkubieren Sie das Röhrchen 35 min lang in einem 37 °C heißen Schüttelwasserbad bei 60 U/min.
    4. Nach der Inkubation wird Waschmedium auf ein Gesamtvolumen von 15 ml gegeben. Drehen Sie das Röhrchen bei 1.600 x g für 5 min bei 4 °C.
    5. Saugen Sie den Überstand mit einem vakuumbasierten Absauger auf ein Volumen von 4 ml ab. Um das Pellet nicht zu stören, saugen Sie langsam von oben ab und entfernen Sie das schwimmende Fett.
    6. Auftauen von Aliquoten von Dispase und Kollagenase II. 500 μl der Kollagenase-II-Lösung (1.000 U/ml, -20 °C) werden zu den verbleibenden 4 ml Probe gegeben. Als nächstes werden 500 μl der Dispase-Lösung (11 U/ml Stamm, -20 °C) hinzugefügt.
      HINWEIS: Dispase kann einen Niederschlag erzeugen. In diesem Fall 1 Minute vor Gebrauch die Dispase-Stammlösung bei 10.000 x g schleudern. Übertragen Sie den nun klaren Überstand in die Zellsuspension, ohne das Pellet zu stören.
    7. Wirbeln Sie die Proben kurz, um das Pellet aufzulösen.
    8. Inkubieren Sie die Proben für 20 min in einem 37 °C heißen Schüttelwasserbad bei 60 U/min.
      HINWEIS: Die Verdauung einer großen Anzahl von Muskelproben ist zeitaufwändig. Für die Schritte 4.3.1-4.3.6 ist eine Schätzung von 2-5 Minuten pro Probe zu erwarten. Dieser Schritt geht schneller, wenn er von zwei oder mehr Forschern parallel ausgeführt wird.
  3. Homogenisierung von Proben
    1. Homogenisieren Sie die Zellsuspension. Übertragen Sie die Suspension aus dem 15-ml-Röhrchen in ein 50-ml-Röhrchen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 20-G-Nadel, um die Probe zu resuspendieren, indem Sie die Probe 5x durch die Nadel auf und ab ziehen.
      Anmerkungen: Wenn unverdaute Muskelstücke die Nadel verstopfen, wischen Sie sie auf einem Papiertaschentuch ab.
    2. Setzen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
    3. Nehmen Sie die volle Zellsuspension in die Spritze auf und seihen Sie die Probe in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen mit einem Zellsieb ab. Die Probe wird abgeseiht, indem Sie das Gesamtvolumen direkt auf den Filter geben.
    4. Um alle einkernigen Zellen zu gewinnen, geben Sie 20 ml des Waschmediums in das leere konische Röhrchen und gießen Sie dieses durch das Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen, das die abgesiebte Probe enthält. Extrahieren Sie das verbleibende Volumen unter dem Zellsieb mit einer p1000-Pipette.
    5. Entsorgen Sie das Zellsieb und schleudern Sie die Probe bei 1.600 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
    6. Durch Pipettieren mit einer p1000-Pipette wird der Überstand abgesaugt, ohne das Pellet zu stören.
    7. Durch Pipettieren mit einer p1000-Pipette wird das Diaphragma-Pellet in 500 μL des Waschmediums resuspendiert und die anderen Muskelproben in jeweils 300 μL des Waschmediums resuspendiert.
      HINWEIS: Das Zwerchfell ist der größte der Muskeln mit dem höchsten Stammzellgehalt und kann daher für die Kontrollfärbungen verwendet werden.

5. Färben und Sortieren (~40 min + 30 min Sortierung/Probe)

Anmerkungen: Arbeiten Sie für die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung auf Eis.

  1. Übertragen Sie ein 50-μl-Aliquot der Diaphragmazelle-Suspension in vier neue 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die Kontrollfärbungen (je 50 μl). Geben Sie 250 μl des Waschmediums in jedes Kontrollröhrchen bis zu einem Endvolumen von 300 μl.
  2. Geben Sie 3 μL (1:100) der Fluoreszenz-Minus-Eins-Antikörper (FMO-Kontrolle) in die drei Kontrollfärberöhrchen und lassen Sie ein Röhrchen ohne Antikörper (ungefärbte Kontrolle) (siehe Tabelle 2).
  3. Fügen Sie 3 μL (1:100) der Antikörper (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC und SCA1-PacificBlue) zu den verbleibenden Muskeleinzelzellsuspensionen hinzu, einschließlich der verbleibenden Diaphragmaprobe.
  4. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen für 15 min bei 4 °C in einem Kopf-über-Kopf-Shaker.
    HINWEIS: Die Kontrollfärbungen sind notwendig, um die Hintergrundfluoreszenzwerte zu bestimmen und die Tore für die Durchflusszytometrie festzulegen. Es können verschiedene Antikörper verwendet werden, aber jeder hat eine bestimmte Arbeitskonzentration und Inkubationszeit, die getestet werden muss. Wenn Antikörper von unterschiedlichen Anbietern verwendet werden, kann die Konzentration und damit die Verdünnung variieren. Der Färbemischung kann ein Zellviabilitätsfarbstoff zugesetzt werden, um abgestorbene oder absterbende Zellen während der Sortierung zu entfernen.
  5. Schleudern Sie die Proben bei 1.600 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand, ohne das Pellet durch Pipettieren zu stören.
  6. Durch Pipettieren mit einer p1000-Pipette wird jede Probe in 800 μl des Waschmediums resuspendiert.
  7. Filtern Sie die Proben mit einem FACS-Röhrchen mit einer Zellsiebkappe (40 μm), um verbleibende Zellklumpen (oder Aggregate) zu entfernen.
  8. Waschen Sie das Zellsieb, indem Sie zusätzlich 800 μl des Waschmediums hinzufügen.
  9. Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse mit Alufolie bedeckt auf Eis auf.
    Anmerkungen: Wenn die Zellsuspension zu diesem Zeitpunkt aufgrund der hohen Zellkonzentration trüb/dicht erscheint, fügen Sie zusätzlich 800 μl des Waschmediums hinzu, um die Zelldichte zu verringern.
  10. Starten Sie das FACS mit einer 70 μm Düse.
  11. Verwenden Sie die unstained- und FMO-Regler, um die Gating-Strategie festzulegen: MuSCs sind negativ für CD45-FITC, CD31-FITC und SCA1-PacBlue und positiv für VCAM1-PECy7; Die FAPs sind negativ für CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 und positiv für SCA1-PacBlue.
  12. Sortieren Sie die gefärbten Einzelzellsuspensionen mittels Zwei-Wege-Sortierung und sammeln Sie die MuSCs und FAPs in separaten Sammelröhrchen mit 500 μL des Waschmediums.
    HINWEIS: Bei Verwendung von FACS mit vier Lasern (Konfiguration: 70 μm Düse, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) erfordert die gewählte Kombination von Fluorophoren keine Kompensation des Fluoreszenzsignals. Wenn jedoch ein anderes Durchflusszytometer oder eine andere Kombination von Fluorophoren verwendet wird, werden zusätzliche einfach gefärbte Kontrollproben zur Kompensation empfohlen. Von den kleineren Muskeln (EDL, Soleus, TA) sind Erträge von 3.000 MuSCs und 5.000 FAPs zu erwarten. Für die anderen größeren Muskeln sind Erträge von 20.000 MuSCs und FAPs zu erwarten. Die von der FACS-Software aufgelisteten Ereigniszahlen können von der tatsächlichen Anzahl der lebensfähigen Zellen im Sammelröhrchen abweichen. Die Zellzahl kann durch Zellzählung mit einem Hämozytometer bestätigt werden.
  13. Die sortierten Zellen bei 1.600 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern. Durch Pipettieren wird der Überstand abgesaugt, ohne das Zellpellet zu stören.
  14. Geben Sie 100 μl des Waschmediums zu jeder Probe und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, ohne Luftblasen zu bilden. Übertragen Sie die 100 μl der resuspendierten Probe in eine kollagenbeschichtete halbflächige 96-Well-Platte. Platte 1.000-3.000 Zellen pro Well.
    HINWEIS: Wenn die Zellen nicht richtig resuspendiert werden, können die Zellen in Klumpen zusammenkleben, was spätere Mikroskopieanalysen verwirrt.
  15. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop und notieren Sie ihre Verteilung, Form und Größe.
  16. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5% CO2. Die Zellen verkleben innerhalb von 2 Stunden.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Reinheit der gesammelten Zellpopulationen entweder durch durchflusszytometrische Analyse (durch Laden eines Aliquots der sortierten Probe auf den Sortierer und Aufzeichnen einer kleinen Anzahl von Ereignissen) oder durch Antikörperfärbung der plattierten Zellen mit anschließender Mikroskopie zu bestätigen (Pax7 ist ein definierender Marker für Maus-MuSCs, PDGFRa ist ein definierender Marker für Maus-FAPs). Ab Abschnitt 7 unten finden Sie ein Protokoll für die Färbung von Zellen auf Pax7- und PDGFRa-Proteinspiegel.

6. EdU-Inkorporations-Assay

Anmerkungen: Arbeiten Sie unter sterilen Bedingungen und verwenden Sie den chemischen Abzug beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA) für die folgenden Schritte. EdU ist ein Nukleotidanalogon, das in die DNA eingebaut wird, wenn die Zellen die S-Phase des Zellzyklus durchlaufen. Es ist in hohen Konzentrationen erbgutverändernd. Tragen Sie beim Umgang mit EdU immer Handschuhe. Informieren Sie sich über die örtlichen Richtlinien für den Umgang mit EdU-Abfällen.

  1. EdU-Puls (Tag 1)
    1. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von 2x EdU in einem frischen Waschmedium vor.
    2. Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Konfluenz zu überwachen. Bewegen Sie sich in die Laminar-Flow-Haube.
    3. Entfernen Sie 50 μl Medium durch Pipettieren von der Platte. Fügen Sie 50 μL 2x EdU-Arbeitslösung hinzu, so dass das Endvolumen in der Vertiefung 100 μL beträgt.
    4. Kultivieren Sie die Zellen in Gegenwart von EdU für den vorgesehenen Zeitraum bei 37 °C, 5% CO2.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt und die Dauer des EdU-Impulses können variieren. Im Durchschnitt benötigen ruhende MuSCs 2 Tage, um ihre erste Zellteilung vollständig zu aktivieren und abzuschließen19. EdU kann sofort nach dem Plattieren zu den sortierten Zellen hinzugefügt werden.
  2. Fixierung (Tag 2)
    HINWEIS: PFA ist krebserregend. Behandeln Sie PFA immer mit Sorgfalt. Machen Sie sich mit den örtlichen Vorschriften für den Umgang mit PFA und die Entsorgung von Abfällen vertraut.
    1. Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop und schieben Sie die Platte in den Abzug.
    2. Entfernen Sie durch Pipettieren das Medium und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 μl 4 % PFA in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in einem chemischen Abzug.
    3. Entfernen Sie das PFA mit einer Pipette und entsorgen Sie es in einem geeigneten Abfallbehälter.
    4. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 μl PBS in alle Vertiefungen geben. Saugen Sie das PBS durch Pipettieren ab und wiederholen Sie die Reinigung. Bewahren Sie die Zellen in 100 μl PBS auf.
      Anmerkungen: Um ein Auswaschen von Zellen zu vermeiden, geben Sie das PBS durch langsames Pipettieren an der Seite der Vertiefung ab.
  3. EdU-Kennzeichnung
    1. Permeabilisieren Sie die Zellen vor dem EdU-Nachweis, indem Sie das PBS entfernen und 100 μl 0,5 % Triton X-100 in PBS hinzufügen. Die Platte 5 min bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Triton X-100 ist ein Tensid und kann Hautreizungen verursachen. Mit Vorsicht behandeln und immer Handschuhe tragen.
    2. Saugen Sie den Triton X-100 nach 5 Minuten an und fügen Sie 100 μl PBS hinzu.
    3. Bereiten Sie ein EdU-Click-Chemie-Reaktionsgemisch gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
    4. Saugen Sie das PBS an und fügen Sie 33 μl des EdU-Click-Chemistry-Reaktionsgemisches hinzu. Die Platte wird 30 min lang bei RT inkubiert.
    5. Saugen Sie die EdU-Click-Chemistry-Reaktionsmischung an und waschen Sie die Zellen mit 100 μl PBS.
    6. Saugen Sie das PBS ab, geben Sie 100 μl PBS mit Hoechst (1:2.000) hinzu und inkubieren Sie es 10 min lang lichtgeschützt bei RT.
    7. Saugen Sie den Hoechst ab und waschen Sie ihn zweimal durch Zugabe von 100 μl PBS. Lagern Sie die Zellen in 100 μl PBS bei 4 °C im Dunkeln.
    8. Bilde die Zellen auf einem inversen Mikroskop ab. Die Zellen können monatelang im Dunkeln gelagert werden, solange die Vertiefungen nicht austrocknen.
      HINWEIS: Es ist möglich, die Zellen mit Antikörpern zu ko-färben. Fahren Sie in diesem Fall mit einem Blockierungsschritt fort, gefolgt von der Inkubation mit dem primären Antikörper. Wählen Sie einen Sekundärantikörper mit einem konjugierten Fluorophor aus, dessen Emissionsspektrum sich nicht mit dem des Fluorophors überschneidet, der zum Nachweis von EdU verwendet wird. Achten Sie darauf, keine Sekundärantikörper mit Fluorophoren zu verwenden, die sich mit dem Spektralbereich von Hoechst überlappen.

7. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann unabhängig von Abschnitt 6 durchgeführt werden. Wenn Sie Abschnitt 6 überspringen, führen Sie bitte die Schritte 6.3.1 und 6.3.2 aus, um die Zellpermeabilisierung zu aktivieren, bevor Sie mit Schritt 7.2 unten fortfahren.

  1. Nehmen Sie die Platte mit den EdU-markierten Zellen heraus.
  2. Bereiten Sie 20 ml Blockierungspuffer vor, indem Sie 2 ml Eselserum zu 18 ml PBS hinzufügen.
  3. Um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, entnehmen Sie 100 μl des PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie 50 μl des Blockierungspuffers mit einer p200-Pipette hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei RT, vor Licht geschützt und mit Alufolie abgedeckt, um ein Photobleichen des Fluorophor-markierten EdU zu verhindern.
    Anmerkungen: Die Zellen sind am Boden der Vertiefung befestigt, können sich aber lösen, wenn beim Pipettieren zu viel Kraft aufgebracht wird.
  4. Während Sie die Proben blockieren, bereiten Sie die primäre Antikörpermischung vor. Fügen Sie 8,0 μl (1:100) Maus-Anti-Pax7 und Kaninchen-Anti-PDGFRa zu 800 μl Blockierungspuffer hinzu, um 16 Wells (acht Gewebe, zwei Zelltypen) zu färben.
  5. Entfernen Sie nach dem Blockieren das Eselsserum und geben Sie 50 μl der primären Antikörpermischung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 °C, abgedeckt mit Alufolie.
  6. Entfernen Sie nach der Inkubation den primären Antikörper und geben Sie 50 μl Triton (0,5 % in PBS) in jede der Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte für 5 min bei RT vor Licht geschützt, um den ungebundenen Antikörper wegzuspülen. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
  7. Bereiten Sie den sekundären Antikörper-Mastermix vor, indem Sie 1,0 μl (1:1.000) Esel-Anti-Maus-Alexa647 und Esel-Anti-Kaninchen-Alexa555 in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.000 μl des Blockierungspuffers geben.
  8. Geben Sie 33 μl der sekundären Antikörper-Mastermischung in jede der Vertiefungen. Die Platte wird für 60 min bei RT lichtgeschützt inkubiert.
  9. Entfernen Sie den überschüssigen Sekundärantikörper durch Pipettieren, fügen Sie 50 μl Triton (0,1 % in PBS) hinzu und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang bei RT vor Licht geschützt. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
  10. Zum Schluss 100 μl PBS hinzufügen. Entscheiden Sie, ob Sie die Platte sofort mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer gekühlten CCD-Kamera abbilden oder die Platte bis zur späteren Analyse bei 4 °C lagern möchten, indem Sie die Plattenränder mit Parafolie versiegeln und die versiegelte Platte in Aluminiumfolie einwickeln.

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Representative Results

Nach dem Protokoll zur individuellen Skelettmuskelisolation (Abbildung 2) wurden die Gracilis-, TA-, EDL-, GA-, Soleus-, Trizeps-, Masseter- und Zwerchfellmuskeln aus drei männlichen Schweizer Mäusen isoliert, die aus einem lokalen Zuchtprogramm ausgezüchtet worden waren (Abbildung 2). Nach Gewebedissoziation und Antikörperfärbung wurden MuSCs und FAPs aus den einzelnen Muskeln mittels FACS aufgereinigt (Abbildung 3). Das anfängliche Gating wurde mit einer ungefärbten Probe durchgeführt, um die Zellen zu identifizieren und die Einzellinge von den Dubletten zu trennen (Abbildung 3A). Die nachfolgenden Gatter wurden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um Färbeschwellen zu identifizieren (Abbildung 3B). Die gefärbte Probe wurde dann auf CD31/CD45-FITC und Sca1-PacBlue untersucht. Die SCA1+/CD31-/CD45-Population (FAPs) wurde in ein separates Sammelröhrchen sortiert, während die doppelt negative Population auf VCAM1-PECy7 und Vorwärtsstreuung (FSC) aufgetragen wurde. Die VCAM1+-Population (MuSCs) wurde in ein separates Sammelröhrchen sortiert. MuSCs und FAPs wurden als prozentualer Anteil der Einzelstücke (Tabelle 3) quantifiziert und in separate Sammelröhrchen mit 500 μL des Waschmediums sortiert. Die einzelligen Suspensionen des Zwerchfell- und Trizepsmuskels weisen eine höhere relative Häufigkeit von MuSCs auf als FAPs, während die anderen einzelligen Suspensionen eine höhere relative Häufigkeit von FAPs aufweisen als MuSCs (Tabelle 3).

Von den sortierten Zellen wurden 1.000-3.000 Zellen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Nach 24 h Inkubationszeit wurde das Medium entfernt und durch ein frisches Medium mit EdU ersetzt. Die Zellen wurden nach 48 h fixiert, für EdU angefärbt und anschließend mit Antikörpern gegen das Pax7-Protein oder das PDGFRa-Protein versehen und mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop abgebildet. Die Bilder wurden mit dem Fidschi-Plugin in ImageJ quantifiziert. Es wurde eine robuste EdU-Färbung beobachtet, obwohl der Anteil der EdU-positiven Zellen für die beiden Stammzelltypen und die verschiedenen Muskeln unterschiedlich war (Abbildung 4A-C). MuSCs, die entweder aus der EDL oder GA isoliert wurden, zeigten eine signifikant geringere EdU-Inkorporation im Vergleich zu MuSCs, die entweder aus der TA, dem Diaphragma, dem Gracilis oder dem Trizeps isoliert wurden, während MuSCs, die aus dem Masseter und dem Soleus isoliert wurden, dazwischen liegen und sich von keiner der beiden Gruppen signifikant unterscheiden (Abbildung 4A, B). Dies steht im Einklang mit unseren bisherigen Ergebnissen22. Darüber hinaus handelt es sich bei den Geweben, aus denen die MuSCs hohe EdU-Inkorporationsniveaus aufweisen, um die gleichen Gewebe, von denen zuvor gezeigt wurde, dass die MuSCs hohe Konzentrationen des Pax3-Proteins22 exprimieren. FAPs, die aus dem EDL isoliert wurden, zeigten eine signifikant geringere EdU-Inkorporation im Vergleich zu FAPs, die aus dem GA und Soleus isoliert wurden, während FAPs, die aus dem TA isoliert wurden, eine signifikant geringere EdU-Inkorporation im Vergleich zu FAPs, die aus dem Soleus isoliert wurden, zeigten (Abbildung 4A, C). Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, Stammzellen aus einzelnen Geweben zu analysieren, anstatt Muskeln aus verschiedenen Geweben zur Isolierung zu bündeln. Für alle Gewebe war der mittlere Anteil der EdU-positiven MuSCs höher als der mittlere Anteil der EdU-positiven FAPs, was darauf hindeutet, dass MuSCs unter den gegebenen Bedingungen schneller aktiviert werden.

Schließlich wurde die Zellreinheit mittels Immunfluoreszenzfärbung bestätigt (Abbildung 4D). Im Durchschnitt waren 97,71 % (± 1,38 %) der MuSCs positiv für das Pax7-Protein und 88,16 % (±6,35 %) der FAPs positiv für das PDGFRa-Protein gefärbt, was die Spezifität unseres Stammzellisolierungsverfahrens bestätigt (Abbildung 4D).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung des Protokolls. Schematische Darstellung der beiden Hauptsegmente des Protokolls, MuSC-Isolierung (oberes Bild), Ruhe-Assay (unteres Bild) und die wichtigsten Schritte der jeweils verwendeten Methodik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Lokalisation und Isolation der Muskeln. (A) Ein Schema, das die Lage jedes Muskels zeigt. (B-S) Demonstration der Muskelisolation für (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) Trizeps, (K-M) GA/soleus, (N-P) Masseter und (Q-S) Zwerchfellmuskeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Gating-Strategie zur Identifizierung und Sortierung von MuSCs und FAPs in einer Zwerchfellmuskelprobe. Zellen werden anhand der Zellgröße (Forward Scatter (FSC)) und Granularität (Side Scatter (SSC)) identifiziert. Singlets werden auf der Grundlage von FSC-A und FSC-W ausgewählt. Lineage-Zellen werden für die anschließende Identifizierung von MuSCs (Lineage-/VCAM1+) und FAP-Zellen (Lineage-/SCA1+) für die Identifizierung von FAPs gesperrt. Die gleiche Gating-Strategie wurde auf (A) eine ungefärbte Kontrolle, (B) FMO-Kontrollen (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC und FMO-VCAM1-PECy7) und (C) eine gefärbte Probe angewendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Quantifizierung der Zellaktivierung durch EdU-Färbung. (A) Repräsentative Bilder der EdU-Färbung von MuSCs (obere Tafeln) und FAPs (untere Tafeln) aus einer Diaphragmaprobe. Gezeigt werden zusammengefügte Bilder von EdU und Hoechst (linke Tafeln) sowie die einzelnen Kanäle in grün (EdU, mittlere Tafeln) und blau (Hoechst, rechte Tafeln). (B,C) Balkendiagramm mit dem prozentualen Anteil von EdU-positiven (B) MuSCs oder (C) FAPs für indizierte Muskeln. Geplottet ist der Mittelwert ± SEM. Jeder Punkt steht für eine Maus. Die statistische Analyse wurde in GraphPad mit zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt, wobei die Signifikanz auf *p < 0,05 und **p < 0,01 eingestellt wurde. (D) Immunfluoreszenzfärbung von MuSCs (obere Tafeln) und FAPs (untere Tafeln) mit Antikörpern gegen den MuSC-Marker Pax7 (linke Seite) und den FAP-Marker PDGFRa (rechte Seite). Gezeigt werden zusammengefügte Bilder von Pax7 mit Hoechst, gefolgt von den einzelnen Kanälen, und zusammengeführte Bilder von PDGFRa mit Hoechst, gefolgt von den einzelnen Kanälen. N = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Lösungen Reagenzien Menge 
Waschmedium F-10 Nährstoffmischung (Schinken) (1x), +L-Glutamin 445 ml
Serum für Pferde 50 ml
Pen/Streptokokken 5 ml
Dissoziationspuffer (1. Verdauung) Kollagenase Typ II 650 U/ml
Waschmedium 100 ml
Dispase Brühe (2. Verdauung) Dispase in PBS 11 U/ml
Kollagenase-Stamm (2. Verdauung) Kollagenase Typ II in PBS 1000 U/ml
PBS 1x PBS 10x Pulverkonzentrat 9,89 g/L
Autoklaviertes/steriles Wasser 1 L
Saures Wasser Eisessig (100%) wasserfrei für die Analyse 5,15 ml
Autoklaviertes/steriles Wasser 895 ml
Kollagenlösung (0,002%) Kollagen aus Kalbsleder 20 ml
Saures Wasser 800 ml
Triton X-100 Triton X-100 0,5 % (v/v)
PBS 1x 99.5%
Blockierender Puffer PBS 1x 18 ml
Esel-Serum 2 ml

Tabelle 1: Tabelle der Rezepte.

Muster-Nr. Name 
1 Ungefleckt
2 Fluoreszenz minus VCAM1-PeCy7
3 Fluoreszenz minus SCA1-PacificBlue
4 Fluoreszenz minus CD31/45-FITC
5 Experimentelle Färbung (alle vier Antikörper)

Tabelle 2: Übersicht über die Färbung, die Kontrollen und die Proben, die für jedes Gewebe vor der Sortierung vorbereitet wurden.

Gewebe Antikörper-Mix Zellen Unterhemden Lin neg FAPs MuSCs
Zwerchfell ungefleckt 100% 82% 55% 0.5% 0.0%
FMO Sca1-PacBlue 100% 83% 19% 0.3% 4.3%
FMO CD31/45-488 100% 84% 40% 9.4% 5.6%
FMO Vcam1-PeCy7 100% 78% 20% 5.6% 0.0%
fleckig 100% 77% 19% 2.4% 3.8%
Gracilis fleckig 100% 96% 11% 2.6% 1.4%
DANKE fleckig 100% 88% 16% 2.8% 2.2%
EDL fleckig 100% 86% 26% 19.2% 0.8%
Schollenmuskel fleckig 100% 91% 41% 13.3% 1.1%
GA fleckig 100% 94% 51% 6.1% 1.5%
Trizeps fleckig 100% 92% 30% 2.6% 4.5%
Masseter fleckig 100% 85% 27% 19.3% 2.6%

Tabelle 3: Übersicht über die relative Zelltyphäufigkeit in den FACS-Daten.

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Discussion

Mehrere Schritte sind bei der Ausführung dieses Protokolls entscheidend, um gute Erträge zu erzielen. Die einzelnen Muskeln haben ein kleines Volumen im Vergleich zu der Muskelmenge, die bei Bulk-Isolationsprotokollen verwendet wird. Dadurch besteht die Gefahr, dass der Muskel während der Dissektion austrocknet, was die Ausbeute verringert. Um dies zu verhindern, ist es wichtig, den Muskeln unmittelbar nach der Präparation Medium zuzuführen. Wenn die Präparation länger dauert, kann die Haut von einer Gliedmaße nach der anderen entfernt werden, um die Zeit zu verkürzen, in der die Muskeln der Luft ausgesetzt sind. Das kleinere Volumen führt auch zu einem erhöhten Risiko einer Überverdauung. Um dem entgegenzuwirken, erfordert die vorliegende Methode geringere Mengen an Kollagenase II-Enzym und kürzere Verdauungszeiten im Vergleich zu Bulk-Muskelprotokollen 9,16. Der enzymatische Aufschluss hängt auch von der Reinheit der Enzyme ab, und eine geringere Reinheit kann sich negativ auf die Ausbeute auswirken. Darüber hinaus ist der mechanische Aufschluss von entscheidender Bedeutung. Im Falle eines unzureichenden Schnitts behindert die verringerte Oberfläche die enzymatische Verdauung und verringert die Stammzellausbeute. Wenn zu viel geschnitten wird, führt die vergrößerte Oberfläche zu einer Überverdauung und verringert die Stammzellausbeute. Das Schüttelwasserbad verhindert die Ausfällung des verdauten Muskels, verbessert die Verteilung des Enzyms und trägt dazu bei, eine homogene Temperatur zu erzeugen, was insgesamt kürzere Inkubationszeiten ermöglicht. Daher ermöglicht das vorliegende Verfahren eine signifikante Verkürzung der Inkubationszeit im Vergleich zu anderen Methoden.

Dieses Protokoll hängt von der Dissoziation und Reinigung der Zellen ab. Diese Verfahren ahmen eine Gewebeverletzung nach, die die Stammzellen aktiviert. Neuere Studien haben immer wieder gezeigt, dass MuSCs ihre Genexpressionsprogramme während des Isolationsverfahrens verändern27,28,29,30. Dadurch unterscheiden sich die gereinigten Stammzellen in Bezug auf die Genexpressionsmuster von den Zellen in vivo. Ein zweiter limitierender Faktor des Protokolls ist seine Abhängigkeit von FACS, die den Zugang zu teuren Geräten erfordert. FACS ist der Goldstandard für die gleichzeitige Isolierung mehrerer Zellpopulationen mit hoher Reinheit20. Jüngste Fortschritte unter Verwendung von magnetischen Kügelchen und Mikrobläschen bieten Kostensenkungen31,32, aber ob sie vergleichbare Erträge für die Arbeit an einzelnen Muskeln bieten, muss noch ermittelt werden. Schließlich ist die Ausbeute des Protokolls aufgrund der geringen Größe der Muskeln begrenzt, was potenzielle nachgeschaltete Assays einschränkt.

Frühere Studien haben sich bei der Isolierung von MuSCs und/oder FAPs auf die Bündelung verschiedener Muskeln verlassen, um die Zellausbeute zu maximieren. Dadurch werden jedoch alle gewebespezifischen Unterschiede im Verhalten und in der Funktion von Stammzellen zwischen verschiedenen Muskeln gemittelt. Das aktuelle Protokoll ermöglicht die Isolierung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Muskeln für die nachgelagerte Analyse der Stammzellfunktion. Als Beispiel für einen Downstream-Assay wurde die Stammzellaktivierung durch EdU-Inkorporation untersucht, wobei sich zeigte, dass Stammzellen aus verschiedenen Geweben eine unterschiedliche Aktivierungskinetik aufweisen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Verwendung anderer nachgelagerter Assays machbar ist. Diese Assays erfordern kleinere Zellzahlen, wie z. B. SmartSeq2-Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Zelltransplantation, mikrofluidische PCR und klonale Expansionsassays 22,33,34,35.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Dissektion einzelner Muskeln, um MuSCs und FAPs zu isolieren und zu untersuchen. Diese Strategie wird es Experimenten ermöglichen, ein besseres Verständnis der Stammzellfunktion in verschiedenen Muskeln in Gesundheit und Krankheit zu erlangen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Zellsortierung wurde an der FACS Core Facility der Universität Aarhus, Dänemark, durchgeführt. Die Figuren wurden mit Biorender.com erstellt. Wir danken Dr. J. Farup für die Bereitstellung des Kaninchen-Anti-PDGFRa-Antikörpers. Diese Arbeit wurde durch einen AUFF Starting Grant an E.P. und Start Package Grants von NovoNordiskFonden an E.P. (0071113) und an A.D.M. (0071116) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 72.706.700 1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.554.502 15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube Falcon, Fisher Scientific  352054 FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon, Fisher Scientific   352235 FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) VWR collection 525.0946 5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.547.254 50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3 BD FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810 eppendorf EP022628188 Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387287 (Cat# C10337) Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin  Bioreagent, Sigma Aldrich  Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II Worthington, Fisher Scientific  Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) Collagenase
Dispase Gibco, Fisher Scientific  Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) Dispase
Donkey serum (non-sterile) Sigma Aldrich, Merck Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.327 Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.335 Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31 BioLegend, NordicBioSite MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45 BioLegend, NordicBioSite 30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%) EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator  Fisher Scientific  15534080 (Model no. 88861052) Head over head mini-tube rotator
Horse serum Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15 FisherBrand, Fisher Scientific 15325887 Shaking water bath
MS2 mini-shaker  IKA  Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) BD microlance, Fisher Scientific  304827 20G needle 
Neutral formalin buffer 10% CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3945.040 Cell strainer 
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend, NordicBioSite D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody DSHB Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate Fisher BioReagents, Fisher Scientific BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) BioLegend, NordicBioSite 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep Gibco, Fisher Scientific  Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2140-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2279-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2149P-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2069-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad Abena  ACTC-7712  60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS Mettler Toledo, Thermo Scientific  2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha RabMAb, abcam AB134123
Scalpel (shaft no. 3) Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.502 Scalpel
Scalpel blade no. 11 Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.0911 Scalpel
Scanlaf mars Labogene class 2 cabinet: Mars Flow bench
ScanR Olympus Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors FST 14568-09
Series 8000 DH Thermo Scientific 3540-MAR Incubator
Serological pipette 10 mL VWR 612-3700 Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL VWR, Avantor delivered by VWR 612-3702 Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile  BD Emerald, Fisher Scientific 307731 Syringe
TC Dish 100, standard Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3902 Petri dish 
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 Corning, Sigma Aldrich 3764 96-well Half bottom plate
Triton X-100 Sigma Aldrich, Merck Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Widerruf Heft 190
Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln
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Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).

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