Summary
Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.
Abstract
İskelet kası, dokunun homeostazına ve onarımına katkıda bulunan yetişkin kök hücrelerin farklı popülasyonlarını barındırır. İskelet kası kök hücreleri (MuSC'ler) yeni kas yapma yeteneğine sahipken, fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) stromal destek dokularına katkıda bulunur ve fibroblastlar ve adipositler yapma yeteneğine sahiptir. Hem MuSC'ler hem de FAP'lar, sessizlik adı verilen uzun süreli geri dönüşümlü hücre döngüsü çıkışı durumunda bulunur. Sessiz durum, işlevlerinin anahtarıdır. Sessiz kök hücreler genellikle tek bir numunede bir araya getirilen çoklu kas dokularından saflaştırılır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, farklı kaslardan izole edilen MuSC'lerin moleküler profillerinde ve sessizlik derinliğinde belirgin farklılıklar ortaya koymuştur. Bu protokol, MuSC'lerin ve FAP'ların bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu ve çalışmasını açıklamakta ve kök hücre aktivasyonunun moleküler analizini gerçekleştirmek için stratejiler sunmaktadır. Diyafram, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastroknemius (GA), soleus, ekstansör digitorum longus (EDL) ve masseter kasları gibi farklı gelişimsel kökenli, kalınlıklı ve fonksiyonlardaki kasların nasıl izole edileceğini ve sindirileceğini ayrıntılarıyla açıklar. MuSC'ler ve FAP'lar floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile saflaştırılır ve immünofloresan boyama ve 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) birleştirme testi ile analiz edilir.
Introduction
İskelet kası, kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) varlığı nedeniyle yenilenme için yüksek bir kapasiteye sahiptir. MuSC'ler miyofiberler üzerinde, bazal laminanın altında bulunur ve uzamış, geri dönüşümlü hücre döngüsü çıkışı 1,2,3,4'ün sessiz bir durumunda bulunur. Yaralanma üzerine, MuSC'ler aktive olur ve yeni miyofiberler oluşturmak için farklılaşabilen ve kaynaşabilen çoğaltıcı progenitörlere yol açmak için hücre döngüsüne girer 2,5. Önceki çalışmalar, MuSC'lerin kas yenilenmesi için kesinlikle gerekli olduğunu göstermiştir 6,7,8. Dahası, tek bir MuSC hem yeni kök hücreleri hem de yeni miyofiberleri aşılayabilir ve üretebilir9. İskelet kası ayrıca, kas rejenerasyonu sırasında MuSC fonksiyonunu desteklemede çok önemli bir rol oynayan fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) adı verilen mezenkimal stromal hücrelerin bir popülasyonunu barındırır 6,10,11,12.
Kas rejenerasyonunu koordine etme potansiyelleri nedeniyle, MuSC'lerin ve FAP'ların nasıl çalıştığını anlamaya büyük ilgi duyulmuştur. Sessiz MuSC'ler, transkripsiyon faktörleri Pax7 ve Sprouty1'in ve hücre yüzey proteini kalsitonin reseptörünün ekspresyonu ile işaretlenirken, sessiz FAP'lar hücre yüzeyi proteini trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa) 10,12,13,14,15 ile işaretlenir . Önceki çalışmalar, MuSC'lerin ve FAP'ların hücre yüzey belirteçleri ve floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak iskelet kaslarından saflaştırılabileceğini göstermiştir9,15,16,17,18,19,20,21. Bu protokoller MuSC'leri ve FAP'ları inceleme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, bir dezavantajı, bu protokollerin çoğunun MuSC'lerin farklı kas dokularından oluşan bir havuzdan izole edilmesini gerektirmesidir. Bizden ve diğerlerinden yapılan son çalışmalar, farklı dokulardan izole edilen MuSC'ler arasındaki hücre fenotipinde ve gen ekspresyon düzeylerinde farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur22,23. Diyafram, triseps ve gracilisten gelen MuSC'ler, alt arka ekstremite kaslarından MuSC'lerdendaha hızlı aktivasyon gösterirken, ekstraoküler kaslardan MuSC'ler, diyaframdan ve alt arka ekstremite kaslarından MuSC'lerden daha hızlı farklılaşma gösterir23.
Bu protokol, MuSC'lerin ve FAP'ların bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar (Şekil 1). Buna diyafram, triseps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, ekstansör digitorum longus (EDL), gastroknemius (GA) ve masseter kaslarının diseksiyonu dahildir. Disseke kaslar daha sonra kollajenaz II (kollajendeki Pro-X-Gly-Pro amino dizisini spesifik olarak hedef alan, bağ dokusunun ve doku ayrışmasının bozulmasını sağlayan bir proteaz)24) ve dispaz (fibronektin ve kollajen IV'ü parçalayan ve daha fazla hücre ayrışmasını sağlayan bir proteaz) kullanılarak enzimatik sindirim ile ayrıştırılır25). MuSC'ler ve FAP'lar, FACS tarafından tek hücreli süspansiyonlardan izole edilir. Hücre analizi için aşağı akış tahlillerine örnek olarak, kök hücre aktivasyonu 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) katılımı ile belirlenirken, hücre saflığı, hücre tipine özgü belirteçler Pax7 ve PDGFRa için immünofloresan boyaması ile belirlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Aarhus Üniversitesi'ndeki hayvan bakımı yönergelerine ve yerel etik yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Hayvan deneyleri ve ölüm sonrası kemirgen örneklerinin işlenmesi için yerel etik kurulun düzenlemelerine uyduğunuzdan emin olun. Fareler potansiyel bir alerjen kaynağıdır; Varsa, egzoz havalandırmasını açın ve alerjenlere aşırı maruz kalmamak için çalışma alanının üzerine yerleştirin. Alternatif olarak, deney düzenli olarak yapılıyorsa bir yüz maskesi takın. Bu protokol keskin uçlarla çalışmayı içerir ve araştırmacıların bir kesim durumunda ilk yardım uygulamak için prosedürlere ve lojistiğe aşina olmaları önerilir.
1. Hazırlık (1-2 saat; diseksiyondan önceki gün)
NOT: Çözeltiler, plakalar ve ortamlar steril koşullar altında hazırlanır ve aksi belirtilmedikçe kullanımdan önce filtrelenir (0,45 μm). Dispaz (PBS'de 11 U/mL) ve kollajenaz II (PBS'de 1.000 U/mL) stok çözeltilerini hazırlayın ve -20 °C'de saklayın (Tablo 1). Stoklar çözülür ve adım 4.2.6'da ikincil sindirim için kullanılır.
- 96 delikli yarım alanlı plakanın kollajen kaplaması
- Asitli su hazırlayın. 2 L'lik bir beherde 895 mL otoklavlanmış suya 5.15 mL buzul asetik asit ekleyin.
- Çözeltiyi 0,45 μm, 500 mL filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Filtrelenmiş asitli suyun 800 mL'sini 1 L'lik bir şişeye aktarın.
- Şişeye 40 mL steril kollajen stok çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi döndürerek yavaşça karıştırın ve kullanılana kadar ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın.
- Bir veya daha fazla 96 kuyucuklu yarım alan plakasını kollajen ile kaplayın. Her bir oyuğa 50 μL kollajen kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca (AÇIK) 4 ° C'de kaplayın.
- Ertesi gün vakum bazlı bir aspiratör kullanarak kollajen çözeltisini aspire edin ve 100 μL otoklavlanmış su ekleyerek ve aspire ederek plakayı 2 kat yıkayın.
- Plakanın kapağını eğin ve plakanın davlumbazda 20-30 dakika kurumasını bekleyin.
- Plaka tamamen kuruduğunda, alüminyum folyoya sarın ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın. Kaplamalı plakalar 4 haftaya kadar saklanabilir.
NOT: Kollajen kaplama hücre yapışmasını sağlar. Serbest kollajenin yıkanması önemlidir, çünkü hücre fonksiyonuna ve sinyalizasyonuna müdahale edebilir (örneğin, kollajen V'nin MuSC'lerdeki kalsitonin reseptörlerine bağlanması)26.
2. Hazırlık (0.5 saat; diseksiyon günü):
- Ek çözümlerin ve çalışma alanının hazırlanması
- 445 mL HAM F10 ortamına 50 mL at serumu ve 5 mL kalem/strep ekleyerek steril yıkama ortamı hazırlayın. Kirlenmeyi önlemek için laminer akış davlumbazında çalışın.
- Ayrışma tamponunu hazırlamak için gereken uygun miktarda kollajenaz II'yi hesaplayın ve tartın. (Her fare için, 650 U / mL kollajenaz II'de 40 mL ayrışma tamponu yapmak için 26.000 birim kollajenaz II kullanılır). Tartılan tozu 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde saklayın.
- Kas izolasyonu için iki adet 10 cm'lik tabak hazırlayın. Her Petri kabına 3 mL yıkama ortamı (Tablo 1) dökün. 10 cm'lik tabakları daha sonra kullanmak üzere laminer akış davlumbazının dışına getirin.
- Malzemeleri kas sindirimi için hazırlayın. Numune sayısına bağlı olarak, uygun sayıda 50 mL konik tüpü etiketleyin (fare başına sekiz, her kas için bir tane) ve bunları tezgahta bırakın. İğneleri, 10 mL şırıngaları ve 40 μm hücre süzgeçlerini %70 etanol (fare başına sekiz, her kas için bir tane) ile püskürtün ve laminer akış başlığının içine getirin. İğneleri şırıngalara takın.
- Malzemeleri sıralama için hazırlayın. 5 mL yuvarlak tabanlı tüpleri, numune sayısına göre hücre süzgeç kapaklarıyla etiketleyin. Tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve laminer akış başlığında bırakın.
- Sıralanan numune ve popülasyon sayısına karşılık gelen, hücre toplama için 500 μL yıkama ortamına sahip 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın (fare başına 16, kas dokusu başına her hücre popülasyonu için bir tüp). Bu tüpleri buz üzerinde saklayın.
3. Kas diseksiyonu (20-30 dk.)
NOT: Protokolün bu bölümü steril olmayan bir ortamda gerçekleştirilir. Prosedür bir veya birkaç fare kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir fare hem örnekleri sıralamaya hazırlamak hem de telafi ve FACS kapılarını ayarlamak için kontrolleri hazırlamak için yeterlidir.
- Kas izolasyonunun başlatılması
- Steril olmayan çalışma alanını diseksiyon ve kas izolasyonu için hazırlayın. İş istasyonunu %70 etanol ile dezenfekte edin. İş istasyonuna steril koruyucu tek kullanımlık bir alt ped yerleştirin.
- Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, daha sonra izole edilmiş kası yerleştirmek için Petri kabı kapağının üstüne her kas için bir kutu çizin.
- Cerrahi aletlere %70 etanol püskürtün.
- Fareyi CO2 inhalasyonu ve / veya servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Bireysel kasları izole edin (birkaç fare kullanıyorsanız, bir seferde bir fareden). Kürkü ıslatmak ve cildi dezenfekte etmek için fareye% 70 etanol püskürtün. Fareyi karnı yukarı bakacak şekilde alt altlığa yerleştirin. Sekiz kasın tümüne ve ilgili anatomik konumlarına genel bir bakış Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Gracilis kaslarının izole edilmesi
- Karın derisine 0,5 cm'lik yatay bir kesi yapmak için bir çift makas kullanın.
- Cildi çıkarın: Her iki elinizi de kullanarak, insizyonun üst ve alt kısmına tutunmak için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. Gövde ve alt ekstremitelerin derisini yırtmak ve ayırmak için insizyonun her iki tarafını da çekin. Her iki arka bacağı da (kalçadan ayak parmaklarına kadar aşağıya) açığa çıkarmak için alt ekstremitenin derisini aşağı çekin. Aynı şekilde, gövdeyi açığa çıkarmak için yukarı doğru çekin.
- Gracilis kasını (uyluk içi) bulun. Kavisli forseps kullanarak, gracilis'e tutun ve kası hafifçe kaldırın (Şekil 2B). Makasla, gracilisin kesildiği ve tamamen izole edildiği 0,5 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2C). İkinci gracilis kasını izole etmek için diğer bacak için bunu tekrarlayın.
- TA ve EDL kaslarının izole edilmesi (alt arka bacak, ventral taraf)
- Bir neşter kullanarak, tibianın lateral tarafı (en kalın alt arka bacak kemiği) boyunca 0,5 cm'lik bir kesi yaparak fasyayı kesin. Fasyayı kapmak için kavisli forseps kullanın ve çıkarmak için çekin.
NOT: Fasya tamamen çıkarıldığında, arka bacağın distal ucundaki tendonlar görülebilir ve ayrılabilir. - TA'nın distal tendonu (tibianın lateral tarafı) ile EDL (TA'nın altında) arasına girmek için süper ince uçlu düz forseps kullanın (Şekil 2E-G).
NOT: Tecrübeyle, düz forseps yerine neşter bıçağının kör ucu kullanılabilir. - Kasları ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın.
- Düz forsepsleri distal uca geri getirin. Distal tendonu kesin.
- Kasın distal tendonunu kavisli forsepslerle yavaşça tutun. Kasları yukarı ve proksimal bağlantısının üzerine kaldırın ve proksimal tendonu bağlanma noktasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde dikkatlice kesin. Diğer ucu kesin ve TA'yı bir Petri kabına aktarın.
- EDL'nin distal tendonunun altına girmek için süper ince uçlu düz forseps kullanın.
- Kasları ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın.
- Düz forsepsleri distal uca geri getirin. Kaslara zarar vermeden distal tendonu kesin.
- EDL'nin distal tendonunu kavisli forsepslerle yavaşça tutun. Kasları yukarı ve proksimal bağlantısının üzerine kaldırın ve proksimal tendonu bağlanma noktasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde dikkatlice kesin. Diğer ucunu kesin ve EDL'yi bir Petri kabına aktarın. İkinci TA ve EDL kaslarını izole etmek için diğer arka bacak için tekrarlayın.
- Bir neşter kullanarak, tibianın lateral tarafı (en kalın alt arka bacak kemiği) boyunca 0,5 cm'lik bir kesi yaparak fasyayı kesin. Fasyayı kapmak için kavisli forseps kullanın ve çıkarmak için çekin.
- GA ve soleus kaslarının izole edilmesi (alt arka bacak, sırt tarafı)
- Aşil tendonu ile alt arka bacak kemikleri arasına girmek için süper ince uçlu düz forseps kullanın.
- Kasları ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın.
- Düz forsepsleri distal uca geri getirin. Distal tendonu kesin.
NOT: GA'nın altında yatan soleus kasına zarar vermemek için, distal Aşil tendonu ekine mümkün olduğunca yakın keserek tendonun bir parçasını GA'ya bağlı bırakın (Şekil 2H). - Soleus kasını ortaya çıkarmak ve izole etmek için, GA'yı fibulanın (alt arka bacaktaki iki kemiğin en ince kemiği) yukarı ve üzerine çekin.
NOT: Soleus kası, GA'ya göre karakteristik koyu kırmızı rengi ile ayırt edilir (Şekil 2I). - Proksimal soleus tendonunu bulun. Düz forseps ile soleus ve GA arasına girin.
- Soleusu GA'dan ayırmak için forsepsleri kasın distal ucuna doğru hareket ettirin.
- Önce soleusu izole edin. Proksimal tendonunu kesin, tendonu kavisli forsepslerle tutun ve distal tendonuna erişmek için soleusu dikkatlice kaldırın. Soleusu GA'dan izole etmek için distal tendonu kesin. soleusu yıkama ortamı ile Petri kabına yerleştirin (Şekil 2J)
- GA'yı kesin ve Petri kabına yerleştirin. İkinci soleus ve GA kaslarını izole etmek için diğer bacak için bunu tekrarlayın.
- Triseps kaslarının izole edilmesi (üst ön ayak, sırt tarafı)
- Triseps kası ile humerus kemiği (üst ön bacağın ana kemiği) arasına girmek için süper ince uçlu düz forseps kullanın (Şekil 2K-M).
- Kasları ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın. Kasın proksimal ucunu kesin.
- Trisepsin proksimal ucunu kavisli forsepslerle tutun ve distal tendona erişmek için dirseğin üzerinden yukarı ve yukarı çekin. Trisepsin distal tendonunu kesin, kası bir Petri kabına aktarın ve diğer ön ayak için prosedürü tekrarlayın.
- Masseter kaslarının izole edilmesi
- Kürkü ve cildi çeneden çıkarın. Makasla 0,5 cm'lik yatay bir kesi yapın. Her iki elinizi kullanarak, başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak insizyonun her iki tarafına sıkıştırın. Cildi yukarı ve aşağı doğru çekerek çıkarın.
- Masseterin ana tendonunu bulun (kaudal, gözün altında). Düz neşter bıçağını kemik ve kas arasına yerleştirin (Şekil 2N). Tendonu kesin.
- Büyük masseter tendonunu kavisli forsepslerle tutun. Masseter kasını çene kemiğinden ayırmak için rostral yönde bir neşter bıçağı veya makasla kesin (Şekil 2O, P). İzole masseter kasını Petri kabına yerleştirin. İkinci masseter kası için prosedürü tekrarlayın.
- Diyafram kasının izole edilmesi
NOT: Diyafram kasını izole ederken, iç organlara ve bağırsağa kesilmemek için dikkatlice kestiğinizden emin olun, çünkü bu bir kontaminasyon kaynağıdır.- Makas kullanarak, sternumun ortasında bir torakotomi (kaburgalar arasında bir kesik) yapın (kaburgaları birbirine bağlayan göğsün ortasında yer alan uzun düz bir kemik) ve sternumdan kesin (Şekil 2Q).
- Göğüs kafesinden 360° keserek diyaframı açığa çıkarın.
- Üst vücudu alt kısımdan / karından ayırın. Bir çift makas kullanarak trakea, yemek borusu, vena kava ve abdominal aortu kesin.
- Diyaframı alt gövdeden ayırın. Makas kullanarak, sternumun 1 cm altında bir laparotomi (karın boşluğuna cerrahi bir kesi) yapın ve 360 ° 'lik bir kesim yapın (Şekil 2 R).
- Kapalı makası göğüs kafesi ile karın organları arasına yerleştirin ve aşağı doğru bastırın. Karın organlarından ayırmak için göğüs kafesini yavaşça çekin (Şekil 2S).
- Diyaframı göğüs kafesinden ayırın. Diyaframı iki parmağınız arasında gevşek bir şekilde tutun ve göğüs kafesini makasla kesin. Diyaframı 360°'lik bir kesimle kaburgalara mümkün olduğunca yakın kesmek için makas kullanın. İzole diyaframı bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Servikal çıkık sırasında, diyafram yırtılabilir ve göğüs kafesine doğru çökebilir, bu da yerini belirlemeyi zorlaştırır. Kas hala izole edilebilir. Çökmüş kası tanımlayın, iki parmağınız arasında tutun ve göğüs kafesini takiben 360 ° kesin.
4. Tek hücreli bir süspansiyona kas sindirimi (~ 1 saat 35 dakika)
NOT: Aşağıdaki adımlar steril olmayan (adım 4.1-4.2) ve steril çalışma ortamlarını (adım 4.3) içerir.
- Mekanik sindirim
- İzole kasları 10 cm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirin.
- Kavisli forseps kullanarak, izole kaslara birer birer tutun. Soleus ve GA için, Aşil tendonunun kalan kısımlarını çıkarın.
- Makas kullanarak, izole edilmiş kasları kabaca 1 mm3 parçaya bölerek tek tek kıyın.
- Enzimatik sindirim
- Tartılan kollajenaz II tozuna 40 mL soğuk yıkama ortamı ekleyerek kas ayrışma tamponunu hazırlayın (kollajenaz II: yıkama ortamında 650 U/mL).
NOT: Optimal enzimatik aktiviteyi sağlamak için taze hazırlanmış kas ayrışma tamponu kullanın. - Kıyılmış kasları, 5 mL ayrışma tamponu içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Tüpü 60 rpm'de 37 ° C'lik bir sallanan su banyosunda 35 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, toplam 15 mL hacme yıkama ortamı ekleyin. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'de döndürün.
- Vakum bazlı bir aspiratör kullanarak süpernatantı 4 mL'lik bir hacme kadar aspire edin. Peletin rahatsız edilmesini önlemek için, üstten yavaşça aspire edin ve yüzen yağları çıkarın.
- Dispaz ve kollajenaz II stok alikotlarını çözün. Kalan 4 mL numuneye 500 μL kollajenaz II çözeltisi (1.000 U/mL stok, -20 °C) ekleyin. Daha sonra, 500 μL dispase çözeltisi ekleyin (11 U / mL stok, -20 ° C).
NOT: Dispase bir çökelti oluşturabilir. Bu meydana gelirse, dispase stok çözeltisini kullanımdan 1 dakika önce 10.000 x g'de döndürün. Şimdi berrak olan süpernatantı pelet rahatsız etmeden hücre süspansiyonuna aktarın. - Pelet çözmek için numuneleri kısaca vorteks.
- Numuneleri 60 rpm'de 37 °C sallanan su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Çok sayıda kas örneğini sindirmek zaman alıcıdır. 4.3.1-4.3.6 adımları için, numune başına 2-5 dakika süreceğini tahmin edin. Bu adım, iki veya daha fazla araştırmacı tarafından paralel olarak gerçekleştirildiğinde daha hızlı ilerler.
- Tartılan kollajenaz II tozuna 40 mL soğuk yıkama ortamı ekleyerek kas ayrışma tamponunu hazırlayın (kollajenaz II: yıkama ortamında 650 U/mL).
- Numunelerin homojenizasyonu
- Hücre süspansiyonunu homojenize edin. Süspansiyonu 15 mL'lik tüpten 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Numuneyi iğneden 5x yukarı ve aşağı çekerek numuneyi yeniden askıya almak için 20G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanın.
NOT: Sindirilmemiş kas parçaları iğneyi tıkarsa, bunları bir kağıt mendil üzerinde silin. - Yeni bir 50 mL konik tüp üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
- Şırıngadaki tam hücre süspansiyonunu alın ve numuneyi, üstünde bir hücre süzgeci bulunan yeni bir 50 mL konik tüpe süzün. Toplam hacmi doğrudan filtreye dağıtarak numuneyi süzün.
- Tüm monoçekirdekli hücreleri almak için, boş konik tüpe 20 mL yıkama ortamı ekleyin ve bunu hücre süzgecinden gergin numuneyi içeren 50 mL konik tüpe dökün. Hücre süzgecinin altında kalan hacmi bir p1000 pipet ile alın.
- Hücre süzgecini atın ve numuneyi 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'de döndürün.
- Bir p1000 pipet ile pipetleme yaparak, peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- Bir p1000 pipetle pipetleme yaparak, diyafram peletini yıkama ortamının 500 μL'sinde yeniden askıya alın ve diğer kas örneklerini her biri yıkama ortamının 300 μL'sinde yeniden askıya alın.
NOT: Diyafram, en yüksek kök hücre içeriğine sahip kasların en büyüğüdür ve bu nedenle kontrol boyamaları için kullanılabilir.
- Hücre süspansiyonunu homojenize edin. Süspansiyonu 15 mL'lik tüpten 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Numuneyi iğneden 5x yukarı ve aşağı çekerek numuneyi yeniden askıya almak için 20G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanın.
5. Boyama ve sıralama (~ 40 dakika + 30 dakika sıralama / örnek)
NOT: Aşağıdaki adımlar için buz üzerinde steril bir ortamda çalışın.
- Diyafram hücresi süspansiyonunun 50 μL'lik bir alikuotunu kontrol lekeleri için dört yeni 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (her biri 50 μL). Her bir kontrol tüpüne 250 μL yıkama ortamını 300 μL'lik son hacme kadar ekleyin.
- Üç kontrol boyama tüpüne floresan eksi bir antikordan (FMO-kontrol) 3 μL (1:100) ekleyin ve bir tüpü antikorsuz bırakın (lekesiz kontrol) (bkz. Tablo 2).
- Kalan diyafram örneği de dahil olmak üzere kalan kas tek hücreli süspansiyonlarına antikorların (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC ve SCA1-PacificBlue) 3 μL'sini (1:100) ekleyin.
- Hücre süspansiyonlarını 4 ° C'de 15 dakika boyunca bir kafa üstü çalkalayıcıda inkübe edin.
NOT: Kontrol boyamaları, arka plan floresan seviyelerini belirlemek ve akış sitometrisi için kapıları ayarlamak için gereklidir. Farklı antikorlar kullanılabilir, ancak her birinin test edilmesi gereken belirli bir çalışma konsantrasyonu ve inkübasyon süresi olacaktır. Farklı satıcılardan antikorlar kullanılıyorsa, konsantrasyon ve dolayısıyla seyreltme değişebilir. Sıralama sırasında ölü veya ölmekte olan hücreleri ortadan kaldırmak için boyama karışımına bir hücre canlılığı boyası eklenebilir. - Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'de döndürün. Pipetleme ile peleti rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- Bir p1000 pipet ile pipetleme yaparak, her numuneyi 800 μL yıkama ortamında tekrar askıya alın.
- Kalan hücre kümelerini (veya agregaları) çıkarmak için hücre süzgeç kapağına (40 μm) sahip bir FACS tüpü kullanarak numuneleri filtreleyin.
- Hücre süzgecini ilave 800 μL yıkama ortamı ekleyerek yıkayın.
- Numuneleri analize kadar buz üzerinde alüminyum folyo ile kaplı tutun.
NOT: Bu noktada, yüksek hücre konsantrasyonu nedeniyle hücre süspansiyonu bulutlu/yoğun görünüyorsa, hücre yoğunluğunu azaltmak için yıkama ortamından ilave 800 μL ekleyin. - FACS'ı 70 μm'lik bir nozul ile çalıştırın.
- Geçit stratejisini belirlemek için lekesiz ve FMO kontrollerini kullanın: MuSC'ler CD45-FITC, CD31-FITC ve SCA1-PacBlue için negatiftir ve VCAM1-PECy7 için pozitiftir; FAP'lar CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 için negatif ve SCA1-PacBlue için pozitiftir.
- Lekeli tek hücreli süspansiyonları iki yönlü sıralama kullanarak sıralayın ve MuSC'leri ve FAP'ları 500 μL yıkama ortamı içeren ayrı toplama tüplerinde toplayın.
NOT: FACS'ı dört lazerle (konfigürasyon: 70 μm nozul, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm) kullanarak, seçilen florofor kombinasyonu floresan sinyalinin telafisi gerektirmez. Bununla birlikte, farklı bir akış sitometresi veya farklı bir florofor kombinasyonu kullanılıyorsa, kompanzasyon için ek tek boyalı kontrol numuneleri önerilir. Daha küçük kaslardan (EDL, soleus, TA), 3.000 MuSC ve 5.000 FAP verimi beklenir. Diğer büyük kaslar için, 20.000 MuSC ve FAP verimi beklenmektedir. FACS yazılımı tarafından listelenen olay sayıları, toplama tüpündeki gerçek canlı hücre sayısından sapabilir. Hücre sayıları bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı ile doğrulanabilir. - Sıralanmış hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.600 x g'de döndürün. Pipetleme yaparak, hücre topağını rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- Her numuneye 100 μL yıkama ortamı ekleyin ve hava kabarcıkları oluşturmadan hücreleri dikkatlice askıya alın. Yeniden askıya alınan numunenin 100 μL'sini kollajen kaplı yarım alanlı 96 delikli bir plakaya aktarın. Kuyu başına 1.000-3.000 hücre plakası.
NOT: Hücreler uygun şekilde yeniden askıya alınmazsa, hücreler kümeler halinde birbirine yapışabilir ve daha sonraki mikroskopi analizlerini karıştırabilir. - Hücreleri mikroskop altında inceleyin ve dağılımlarını, şekillerini ve boyutlarını not edin.
- Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin. Hücreler 2 saat içinde yapışacaktır.
NOT: Toplanan hücre popülasyonlarının saflığının, akış sitometrisi analizi (sıralanan numunenin bir alikotunu ayıklayıcıya yükleyerek ve az sayıda olayı kaydederek) veya kaplanmış hücrelerin antikor boyaması ve ardından mikroskopi ile doğrulanması önerilir (Pax7, fare MuSC'leri için tanımlayıcı bir belirteçtir, PDGFRa, fare FAP'ları için tanımlayıcı bir belirteçtir). Aşağıdaki bölüm 7'den başlayarak, Pax7 ve PDGFRa protein seviyeleri için hücrelerin boyanması için bir protokoldür.
6. EdU kuruluş testi
NOT: Steril koşullar altında çalışın ve aşağıdaki adımlar için paraformaldehit (PFA) kullanırken kimyasal duman davlumbazını kullanın. EdU, hücreler hücre döngüsünün S-fazından geçerken DNA'ya dahil edilen bir nükleotid analoğudur. Yüksek konsantrasyonlarda mutajeniktir. EdU'yu kullanırken daima eldiven giyin. EdU atıklarının işlenmesi için yerel yönergeleri kontrol edin.
- EdU nabzı (1. gün)
- Taze bir yıkama ortamında 2x EdU'luk bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- 96 delikli plakayı, hücrelerle birlikte inkübatörden çıkarın. Birleşmeyi izlemek için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Laminer akış davlumbazına geçin.
- Pipetleme ile plakadan 50 μL ortamı çıkarın. Kuyudaki son hacmin 100 μL olması için 50 μL 2x EdU çalışma çözeltisi ekleyin.
- Hücreleri EdU varlığında 37 ° C'de amaçlanan süre boyunca kültürleyin,% 5 CO2.
NOT: EdU darbesinin zamanlaması ve süresi değişebilir. Ortalama olarak, sessiz MuSC'lerin ilk hücre bölünmelerini19'u tamamen aktive etmeleri ve tamamlamaları 2 gün sürer. EdU, kaplamadan hemen sonra sıralanan hücrelere eklenebilir.
- Fiksasyon (2. gün)
NOT: PFA bir kanserojendir. PFA'yı her zaman dikkatli kullanın. PFA'nın işlenmesi ve atıkların bertaraf edilmesiyle ilgili yerel yönetmeliklere aşina olun.- 96 delikli plakayı, hücrelerle birlikte inkübatörden çıkarın. Hücreleri mikroskop altında inceleyin ve plakayı duman davlumbazına taşıyın.
- Pipetleme ile ortamı çıkarın ve her bir oyuğa 50 μL% 4 PFA ekleyerek hücreleri sabitleyin. Plakayı kimyasal bir duman davlumbazında oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inkübe edin.
- PFA'yı bir pipetle çıkarın ve uygun bir atık kabına atın.
- Tüm kuyucuklara 100 μL PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Pipetleme ile PBS'yi aspire edin ve yıkamayı tekrarlayın. Hücreleri 100 μL PBS'de tutun.
NOT: Herhangi bir hücrenin yıkanmasını önlemek için, PBS'yi yavaşça pipetleyerek kuyunun kenarına dağıtın.
- EdU etiketleme
- PBS'yi çıkararak ve PBS'ye 100 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyerek EdU tespitinden önce hücreleri geçirgenleştirin. Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Triton X-100 bir yüzey aktif maddedir ve cilt tahrişine neden olabilir. Dikkatli kullanın ve daima eldiven kullanın. - 5 dakika sonra, Triton X-100'ü aspire edin ve 100 μL PBS ekleyin.
- Üreticinin protokolüne göre bir EdU tıklama kimyası reaksiyon karışımı hazırlayın.
- PBS'yi aspire edin ve 33 μL EdU tıklama kimyası reaksiyon karışımı ekleyin. Plakayı RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- EdU tıklama kimyası reaksiyon karışımını aspire edin ve hücreleri 100 μL PBS ile yıkayın.
- PBS'yi aspire edin, Hoechst (1:2.000) ile 100 μL PBS ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca ışıktan korunan inkübe edin.
- Hoechst'i aspire edin ve 100 μL PBS ekleyerek iki kez yıkayın. Hücreleri karanlıkta 4 °C'de 100 μL PBS'de saklayın.
- Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleyin. Hücreler, kuyular kurumadığı sürece aylarca karanlıkta saklanabilir.
NOT: Hücreleri antikorlarla birlikte boyamak mümkündür. Bu durumda, bir blokaj adımı ve ardından birincil antikor ile inkübasyon ile devam edin. Emisyon spektrumu EdU'yu tespit etmek için kullanılan floroforunkiyle örtüşmeyen konjuge bir florofora sahip ikincil bir antikor seçin. Hoechst'in spektral aralığı ile örtüşen floroforlara sahip ikincil antikorlar kullanmadığınızdan emin olun.
- PBS'yi çıkararak ve PBS'ye 100 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyerek EdU tespitinden önce hücreleri geçirgenleştirin. Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
7. İmmünofloresan boyama
NOT: Protokolün bu bölümü, bölüm 6'dan bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Bölüm 6'yı atlarken, aşağıdaki adım 7.2'ye geçmeden önce hücre geçirgenliğini etkinleştirmek için lütfen 6.3.1 ve 6.3.2 adımlarını uygulayın.
- EdU etiketli hücreleri içeren plakayı çıkarın.
- 18 mL PBS'ye 2 mL eşek serumu ekleyerek 20 mL bloke edici tampon hazırlayın.
- Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için, her bir kuyucuktan 100 μL PBS'yi çıkarın ve bir p200 pipet ile 50 μL bloke edici tampon ekleyin. Florofor etiketli EdU'nun fotobeyazlamasını önlemek için plakayı RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin, ışıktan koruyun ve alüminyum folyo ile kaplanın.
NOT: Hücreler kuyucuğun dibine sabitlenmiştir, ancak pipetleme sırasında çok fazla kuvvet uygulanırsa ayrılabilir. - Numuneleri bloke ederken, birincil antikor karışımını hazırlayın. 16 kuyucuğu (sekiz doku, iki hücre tipi) boyamak için 800 μL blokaj tamponuna 8,0 μL (1:100) fare anti-Pax7 ve tavşan anti-PDGFRa ekleyin.
- Bloke ettikten sonra, eşek serumunu çıkarın ve her bir kuyucuğa 50 μL birincil antikor karışımı ekleyin. Plakayı gece boyunca alüminyum folyo ile kaplı 4 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, birincil antikoru çıkarın ve kuyucukların her birine 50 μL Triton (PBS'de% 0.5) ekleyin. Bağlanmamış antikoru temizlemek için plakayı ışıktan korunan RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- 1.000 μL blokaj tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne 1.0 μL (1:1.000) eşek anti-fare-Alexa647 ve eşek anti-tavşan-Alexa555 ekleyerek ikincil antikor ana karışımını hazırlayın.
- Kuyucukların her birine 33 μL ikincil antikor ana karışımı ekleyin. Plakayı ışıktan korunan RT'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Pipetleme ile fazla ikincil antikoru çıkarın, 50 μL Triton (PBS'de %0,1) ekleyin ve ışıktan korunan RT'de 5 dakika inkübe edin. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- Son olarak, 100 μL PBS ekleyin. Soğutulmuş bir CCD kamera ile ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak plakayı hemen görüntüleyip görüntülemeyeceğinize karar verin veya plaka kenarlarını parafilmle kapatarak ve kapalı plakayı alüminyum folyoya sararak plakayı daha sonraki analizlere kadar 4 ° C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bireysel iskelet kası izolasyonu protokolünü takiben (Şekil 2), gracilis, TA, EDL, GA, soleus, triceps, masseter ve diyafram kasları, yerel bir üreme programından kesilen üç İsviçreli erkek dışlanmış fareden izole edildi (Şekil 2). Doku ayrışması ve antikor boyamasını takiben, bireysel kaslardan MuSC'ler ve FAP'lar FACS ile saflaştırıldı (Şekil 3). İlk geçit, hücreleri tanımlamak ve singlet'ları çiftlerden ayırmak için lekesiz bir numune ile elde edildi (Şekil 3A). Sonraki kapılar, boyama eşiklerini tanımlamak için FMO kontrolleri kullanılarak ayarlandı (Şekil 3B). Lekeli numune daha sonra CD31 / CD45-FITC ve Sca1-PacBlue için kapılıydı. SCA1+/CD31-/CD45- popülasyonu (FAP'lar) ayrı bir toplama tüpüne ayrılırken, çift negatif popülasyon VCAM1-PECy7 ve ileri saçılma (FSC) için kapılı ve çizilmiştir. VCAM1+ popülasyonu (MuSC'ler) ayrı bir toplama tüpünde sıralandı. MuSC'ler ve FAP'lar teklilerin yüzdesi olarak ölçüldü (Tablo 3) ve 500 μL yıkama ortamı içeren ayrı toplama tüplerine ayrıldı. Diyafram ve triseps kası tek hücreli süspansiyonları, FAP'lardan daha yüksek bir MuSC nispi bolluğuna sahipken, diğer tek hücreli süspansiyonlar, MuSC'lerden daha yüksek bir göreceli FAP bolluğuna sahiptir (Tablo 3).
Sıralanan hücrelerden 1.000-3.000 hücre tohumlandı ve 24 saat boyunca inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra, ortam çıkarıldı ve EdU içeren taze bir ortam ile değiştirildi. Hücreler 48 saatte sabitlendi, EdU için boyandı ve daha sonra Pax7 proteinine veya PDGFRa proteinine karşı antikorlarla boyandı ve ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Görüntüler, ImageJ'deki Fiji eklentisi kullanılarak ölçüldü. Sağlam EdU boyaması gözlendi, ancak EdU-pozitif hücrelerin fraksiyonu iki kök hücre tipi ve farklı kaslar için farklıydı (Şekil 4A-C). EDL veya GA'dan izole edilen MuSC'ler, TA, diyafram, gracilis veya trisepslerden izole edilen MuSC'lere kıyasla anlamlı derecede daha düşük EdU katılımı gösterirken, masseter ve soleus'tan izole edilen MuSC'ler aralarına girer ve her iki gruptan da anlamlı olarak farklı değildir (Şekil 4A, B). Bu, önceki sonuçlarımızla tutarlıdır22. Dahası, MuSC'lerin yüksek EdU birleşme seviyeleri gösterdiği dokular, MuSC'lerin daha önce yüksek seviyelerde Pax3 proteini22'yi ifade ettiği gösterilen dokularla aynıdır. EDL'den izole edilen FAP'lar, GA ve soleus'tan izole edilen FAP'lara kıyasla anlamlı derecede daha düşük bir EdU birleşmesi gösterirken, TA'dan izole edilen FAP'lar, soleus'tan izole edilen FAP'lara kıyasla anlamlı derecede daha düşük bir EdU birleşmesi göstermiştir (Şekil 4A, C). Bu, izolasyon için farklı dokulardan kasları bir araya getirmek yerine, kök hücreleri bireysel dokulardan analiz etmenin önemini vurgulamaktadır. Tüm dokular için, EdU-pozitif MuSC'lerin ortalama fraksiyonu, EdU-pozitif FAP'ların ortalama fraksiyonuna kıyasla daha yüksekti, bu da MuSC'lerin verilen koşullar altında daha hızlı aktive olduğunu düşündürmektedir.
Son olarak, immünofloresan boyama ile hücre saflığı doğrulandı (Şekil 4D). Ortalama olarak, MuSC'lerin% 97.71'i (±% 1.38) Pax7 proteini için pozitif boyandı ve FAP'ların% 88.16'sı (% ±% 6.35) PDGFRa proteini için pozitif boyandı ve kök hücre izolasyon prosedürümüzün özgüllüğünü doğruladı (Şekil 4D).
Şekil 1: Protokolün şematik özeti. Protokolün iki ana segmentini, MuSC izolasyonunu (üst panel), sessizlik testini (alt panel) ve her birinde kullanılan metodolojinin temel adımlarını gösteren şematik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kas yerleşimi ve izolasyonu. (A) Her kasın yerini gösteren bir şema. (B-S) (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) triseps, (K-M) GA/soleus, (N-P) masseter ve (Q-S) diyafram kasları için kas izolasyonunun gösterilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir diyafram kası örneğinde MuSC'leri ve FAP'ları tanımlamak ve sıralamak için kullanılan geçit stratejisi. Hücreler, hücre boyutuna (İleri Saçılma (FSC)) ve ayrıntı düzeyine (Yan Saçılma (SSC)) göre tanımlanır. Tekliler FSC-A ve FSC-W'ye göre seçilir. Soy hücreleri, MuSC'lerin (Soy-/VCAM1+) daha sonra tanımlanması için kapılıdır ve FAP (Soy-/SCA1+) hücreleri, FAP'ları tanımlamak için geçitlidir. Aynı geçit stratejisi (A) lekesiz bir kontrole, (B) FMO kontrollerine (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC ve FMO-VCAM1-PECy7) ve (C) lekeli bir numuneye uygulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EdU boyama ile hücre aktivasyonunun nicelleştirilmesi. (A) Bir diyafram örneğinden MuSC'lerin (üst paneller) ve FAP'ların (alt paneller) EdU boyamasının temsili görüntüleri. EdU ve Hoechst'in birleştirilmiş görüntüleri (sol paneller) ve yeşil (EdU, orta paneller) ve mavi (Hoechst, sağ paneller) tek kanallar gösterilmektedir. (B,C) Belirtilen kaslar için EdU-pozitif (B) MuSC'lerin veya (C) FAP'ların yüzdesini gösteren çubuk grafik. Çizilen, SEM'± ortalamadır. Her nokta bir fareyi temsil eder. İstatistiksel analiz GraphPad'de iki kuyruklu Student'ın t-testleri kullanılarak, anlamlılık *p < 0.05 ve **p < 0.01 olarak ayarlanarak gerçekleştirilmiştir. (D) MuSC'lerin (üst paneller) ve FAP'ların (alt paneller) MuSC markeri Pax7 (sol taraf) ve FAP markörü PDGFRa'ya (sağ taraf) karşı antikorlarla immünofloresan boyanması. Pax7'nin Hoechst ile birleştirilmiş görüntüleri, ardından tek kanallar ve PDGFRa'nın Hoechst ile birleştirilmiş görüntüleri ve ardından tek kanallar gösterilir. N = 3. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözümleri | Reaktif | Miktar |
| Yıkama ortamı | F-10 Besin karışımı (jambon) (1x), +L-glutamin | 445 milyon L |
| At serumu | 50 mL | |
| Kalem/strep | 5 mL | |
| Ayrışma tamponu (1. sindirim) | Kollajenaz tip II | 650 U/mL |
| Yıkama ortamı | 100 mL | |
| Dispase stoğu (2. sindirim) | PBS'de Dispase | 11 U/mL |
| Kollajenaz stoğu (2. sindirim) | PBS'de kollajenaz tip II | 1000 U/mL |
| PBS 1 kat | PBS 10x toz konsantresi | 9.89 g/L |
| Otoklavlanmış/steril su | 1 L | |
| Asitli su | Buzul asetik asit (%100) Analiz için susuz | 5,15 milyon L |
| Otoklavlanmış/steril su | 895 mL | |
| Kollajen çözeltisi (% 0.002) | Dana derisinden kollajen | 20 mL |
| Asitli su | 800 mL | |
| Triton X-100 | Triton X-100 | %0,5 (v/d) |
| PBS 1 kat | 99.5% | |
| Engelleme arabelleği | PBS 1 kat | 18 mL |
| Eşek serumu | 2 mL |
Tablo 1: Yemek tarifleri tablosu.
| Örnek no. | Ad |
| 1 | Lekesiz |
| 2 | Floresan eksi VCAM1-PeCy7 |
| 3 | Floresan eksi SCA1-PacificBlue |
| 4 | Floresan eksi CD31/45-FITC |
| 5 | Deneysel boyama (dört antikorun tümü) |
Tablo 2: Sıralamadan önce her doku için hazırlanan boyama, kontrol ve numunelere genel bakış.
| Doku | Antikor karışımı | Hücre | Tekliler | Lin neg | FAP'lar | MuSC'ler |
| Diyafram | lekesiz | 100% | 82% | 55% | 0.5% | 0.0% |
| FMO Sca1-PacBlue | 100% | 83% | 19% | 0.3% | 4.3% | |
| FMO CD31/45-488 | 100% | 84% | 40% | 9.4% | 5.6% | |
| FMO Vcam1-PeCy7 | 100% | 78% | 20% | 5.6% | 0.0% | |
| Lekeli | 100% | 77% | 19% | 2.4% | 3.8% | |
| Arjantin | Lekeli | 100% | 96% | 11% | 2.6% | 1.4% |
| Teşekkür ederim | Lekeli | 100% | 88% | 16% | 2.8% | 2.2% |
| cesaret | Lekeli | 100% | 86% | 26% | 19.2% | 0.8% |
| Arjantin | Lekeli | 100% | 91% | 41% | 13.3% | 1.1% |
| GA | Lekeli | 100% | 94% | 51% | 6.1% | 1.5% |
| Triceps | Lekeli | 100% | 92% | 30% | 2.6% | 4.5% |
| Masseter | Lekeli | 100% | 85% | 27% | 19.3% | 2.6% |
Tablo 3: FACS verilerindeki göreli hücre tipi bolluğuna genel bakış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi verim elde etmek için bu protokolün yürütülmesinde birkaç adım anahtardır. Bireysel kaslar, toplu izolasyon protokollerinde kullanılan kas miktarına kıyasla küçük bir hacme sahiptir. Bu, diseksiyon sırasında kasın kuruma riski ile sonuçlanır ve bu da verimi azaltır. Bunu önlemek için, diseksiyondan hemen sonra kaslara orta eklemek önemlidir. Ek olarak, diseksiyon daha uzun sürüyorsa, kasların havaya maruz kalma süresini azaltmak için cilt bir seferde bir uzuvdan çıkarılabilir. Daha küçük hacim aynı zamanda aşırı sindirim riskinin artmasına neden olur. Buna karşı koymak için, mevcut yöntem, toplu kas protokollerine kıyasla daha düşük miktarlarda kollajenaz II enzimi ve azaltılmış sindirim süreleri gerektirir 9,16. Enzimatik sindirim ayrıca enzimlerin saflığına da bağlıdır ve daha düşük saflık verimi olumsuz yönde etkileyebilir. Ek olarak, mekanik sindirim çok önemlidir. Yetersiz kesim durumunda, azalan yüzey alanı enzimatik sindirimi engelleyecek ve kök hücre verimini düşürecektir. Çok fazla kesim yapılması durumunda yüzey alanının artması aşırı sindirime neden olacak ve kök hücre verimini düşürecektir. Sallanan su banyosu, sindirilen kasın çökelmesini önler, enzimin dağılımını iyileştirir ve homojen bir sıcaklık oluşturmaya yardımcı olur, böylece tamamen daha kısa inkübasyon süreleri sağlar. Bu nedenle, mevcut yöntem, inkübasyon süresinin diğer yöntemlere kıyasla önemli ölçüde azaltılmasına izin verir.
Bu protokol hücre ayrışmasına ve saflaştırılmasına bağlıdır. Bu prosedürler, kök hücreleri aktive eden doku hasarını taklit eder. Sürekli olarak, son çalışmalar MuSC'lerin izolasyon prosedürü sırasında gen ekspresyon programlarını değiştirdiğini ortaya koymuştur27,28,29,30. Sonuç olarak, saflaştırılmış kök hücreler, gen ekspresyon paternleri açısından in vivo hücrelerden farklıdır. Protokoldeki ikinci bir sınırlayıcı faktör, pahalı ekipmanlara erişim gerektiren FACS'a bağımlılığıdır. FACS, birden fazla hücre popülasyonunu aynı anda yüksek saflıkta izole etmek için altın standarttır20. Manyetik boncuklar ve mikro kabarcıklar kullanan son gelişmeler, maliyette31,32 düşüş sağlar, ancak tek kaslar üzerinde çalışmak için karşılaştırılabilir verim sunup sunmadıklarının belirlenmesi gerekir. Son olarak, protokolün verimi, kasların küçük boyutu nedeniyle sınırlıdır, bu nedenle potansiyel aşağı akış tahlillerinde kısıtlamalar ortaya çıkarmaktadır.
Önceki çalışmalar, hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için MuSC'leri ve / veya FAP'ları izole ederken farklı kasların bir araya getirilmesine dayanıyordu. Bununla birlikte, bu, kök hücre davranışındaki dokuya özgü farklılıkların ortalamasını alır ve farklı kaslar arasındaki işlevi gösterir. Mevcut protokol, kök hücre fonksiyonunun aşağı akış analizleri için MuSC'lerin ve FAP'ların bireysel kaslardan izole edilmesini sağlar. Bir aşağı akış testinin bir örneği olarak, kök hücre aktivasyonu EdU kuruluşu tarafından test edildi ve farklı dokulardan kök hücrelerin farklı aktivasyon kinetiği gösterdiğini ortaya koydu. Önceki çalışmalarda, diğer aşağı akış tahlillerini kullanmanın fizibilitesi gösterilmiştir; Bu testler, SmartSeq2 tek hücreli RNA dizilimi, hücre transplantasyonu, mikroakışkan PCR ve klonal genişleme testleri 22,33,34,35 gibi daha küçük hücre sayıları gerektirir.
Sonuç olarak, bu protokol MuSC'leri ve FAP'ları izole etmek ve incelemek için bireysel kasların diseksiyonu için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu strateji, deneylerin sağlık ve hastalıktaki farklı kaslardaki kök hücre fonksiyonlarını daha iyi anlamasını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları ve çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Hücre ayıklama, Danimarka'daki Aarhus Üniversitesi, FACS Çekirdek Tesisi'nde gerçekleştirildi. Rakamlar Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Tavşan anti-PDGFRa antikorunu paylaştığı için Dr. J. Farup'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, NovoNordiskFonden'den E.P.'ye (0071113) ve A.D.M.'ye (0071116) bir AUFF Başlangıç Hibesi ve Başlangıç Paketi hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
