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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Immunfärbungsbasierter Nachweis dynamischer Veränderungen in Erythrozytenproteinen

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

Die Erfassung dynamischer Veränderungen in der Proteinaktivierung entkernter roter Blutkörperchen stellt methodische Herausforderungen dar, wie z.B. die Konservierung dynamischer Veränderungen akuter Stimuli für eine spätere Bewertung. Das vorgestellte Protokoll beschreibt Probenvorbereitungs- und Färbetechniken, die die Konservierung und Analyse relevanter Proteinveränderungen und den anschließenden Nachweis ermöglichen.

Abstract

Die Antikörpermarkierung von Erythrozytenproteinen (RBC) ist eine häufig verwendete, semiquantitative Methode, um Veränderungen des Gesamtproteingehalts oder akute Veränderungen der Proteinaktivierungszustände zu erkennen. Es erleichtert die Beurteilung von Erythrozytenbehandlungen, die Charakterisierung von Unterschieden in bestimmten Krankheitszuständen und die Beschreibung zellulärer Kohärenzen. Der Nachweis einer akut veränderten Proteinaktivierung (z.B. durch Mechanotransduktion) erfordert eine adäquate Probenvorbereitung, um ansonsten temporäre Proteinmodifikationen zu erhalten. Das Grundprinzip beinhaltet die Immobilisierung der Zielbindungsstellen der gewünschten Erythrozytenproteine, um die initiale Bindung spezifischer Primärantikörper zu ermöglichen. Die Probe wird weiterverarbeitet, um optimale Bedingungen für die Bindung des Sekundärantikörpers an den entsprechenden Primärantikörper zu gewährleisten. Die Auswahl von nicht-fluoreszierenden Sekundärantikörpern erfordert eine zusätzliche Behandlung, einschließlich der Biotin-Avidin-Kopplung und der Anwendung von 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB), um die Färbung zu entwickeln, die in Echtzeit unter dem Mikroskop kontrolliert werden muss, um die Oxidation und damit die Färbeintensität rechtzeitig zu stoppen. Für die Detektion der Färbeintensität werden Bilder mit einem Standard-Lichtmikroskop aufgenommen. In einer Modifikation dieses Protokolls kann stattdessen ein Fluorescein-konjugierter Sekundärantikörper eingesetzt werden, was den Vorteil hat, dass kein weiterer Entwicklungsschritt notwendig ist. Dieses Verfahren erfordert jedoch ein Fluoreszenzobjektiv, das an einem Mikroskop befestigt ist, um die Färbung zu detektieren. Angesichts des semi-quantitativen Charakters dieser Methoden ist es unerlässlich, mehrere Kontrollfärbungen bereitzustellen, um unspezifische Antikörperreaktionen und Hintergrundsignale zu berücksichtigen. Hier stellen wir sowohl Färbeprotokolle als auch die entsprechenden analytischen Verfahren vor, um die jeweiligen Ergebnisse und Vorteile der verschiedenen Färbetechniken zu vergleichen und zu diskutieren.

Introduction

Rote Blutkörperchen (RBCs) durchqueren das Herz-Kreislauf-System 70 bis 140 Tage lang, mit einem mittleren Erythrozytenalter von etwa 115 Tagen 1,2. Seneszente oder beschädigte Erythrozyten werden durch Erythrophagozytose, einen effizienten Clearing-Prozess, der von Makrophagen angetrieben wird, aus dem Kreislauf entfernt3. Die vorgegebene Lebensdauer dieser Zellen ist eine Folge der Abgabe der Zellorganellen, einschließlich des Zellkerns, der Mitochondrien und der Ribosomen, während der Differenzierung und Reifung4. Daher sind zirkulierende Erythrozyten frei von einer Translationsmaschinerie, was die Synthese neuer Proteine ausschließt3. Daraus folgt, dass dynamische, posttranslationale Modifikationen an bestehenden Proteinen den einzigen praktikablen Mechanismus der akuten, biochemischen Regulation als Reaktion auf extrazelluläre und intrazelluläre Stressoren darstellen, die auf Erythrozyten einwirken5.

Mechanische Kräfte scheinen die wichtigsten extrazellulären Signale zu sein, die die Aktivierung oder Modulation biochemischer Signalwege innerhalb von Erythrozyten verursachen. Die Entdeckung des mechanosensitiven Proteins Piezo1 in Erythrozytenmembranen6 inspirierte mehrere Forschungslinien, die die mechanisch aktivierte Signalübertragung in diesen Zellen untersuchten7. Jüngste Fortschritte haben beispielsweise gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften von Erythrozyten aktiv durch akute und dynamische Veränderungen von Proteinenreguliert werden 8, einschließlich der posttranslationalen Phosphorylierung und Ubiquitinierung9. Da sich diese normalen Modifikationen bei bestimmten Erkrankungen unterscheiden 9,10,11, scheint es von wissenschaftlichem und klinischem Interesse zu sein, den Aktivierungszustand von Erythrozytenproteinen zu bestimmen, insbesondere in Bezug auf mechanobiologische Prozesse.

Die Bestimmung akuter Veränderungen in den Aktivierungszuständen von Erythrozytenproteinen bringt einige methodische Herausforderungen mit sich. Zum Beispiel erfordert die Lagerung von Erythrozytenproben für die spätere Analyse die Konservierung der modifizierten Erythrozytenproteine, da posttranslationale Modifikationen nicht dauerhaft sind. Darüber hinaus sind klassische Proteinnachweismethoden (z. B. Western Blotting) in Erythrozyten aufgrund der geringen Häufigkeit von Proteinen im Vergleich zum Hämoglobin, das ~98% des Proteingehalts in diesen Zellen ausmacht, notorisch schwer zu standardisieren12. Daher ist die Antikörper-basierte Färbung chemisch konservierter Erythrozyten die Methode der Wahl bei der Untersuchung akuter Modifikationen wichtiger Erythrozytenproteine, wie z. B. der RBC-spezifischen Isoform der Stickstoffmonoxid-Synthase (RBC-NOS)13,14. Es wurde gezeigt, dass Erythrozyten-NOS enzymatisch Stickstoffmonoxid (NO) produziert, das für wesentliche Erythrozyteneigenschaften, einschließlich der Erythrozytenverformbarkeit, unverzichtbar zu seinscheint 15,16,17. Posttranslationale Modifikationen von RBC-NOS regulieren die katalytische Enzymaktivität, wobei die Phosphorylierung des Serin-1177-Rests beschrieben wird, um die Enzymaktivität zu erhöhen, während die Phosphorylierung der Reste Serin 114 oder Threonin 495 mit einer verminderten RBC-NOS-Aktivität in Verbindung gebracht wurde18,19.

Insgesamt tragen temporäre Modifikationen von Erythrozytenproteinen zu einer wichtigen zellulären Funktion bei, und standardisierte Protokolle, die den Nachweis dieser modifizierten Proteine ermöglichen, sind von großem Wert. In dieser Arbeit stellen wir zwei unterschiedliche Protokolle vor, die spezifische Antikörper nutzen, um den Nachweis der Aktivierung des RBC-NOS-Proteins zu erleichtern, und diskutieren Empfehlungen für die Datenanalyse und -interpretation.

Die Leistung der beschriebenen Protokolle wurde durch Messung des gut berichteten Anstiegs der Phosphorylierung von RBC-NOS am Serin-1177-Rest als Reaktion auf mechanische Kräfte bewertet, die die im menschlichen Gefäßsystem auftretenden Kräfte widerspiegeln (5 Pa).

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Protocol

Die hier beschriebenen Protokolle stehen im Einklang mit der Deklaration von Helsinki und wurden von den Ethikkommissionen der Deutschen Sporthochschule Köln (16.9.2013) und der Griffith University (2019/808) genehmigt. Die Probanden wurden untersucht, um sicherzustellen, dass keine relevanten Pathologien vorhanden waren, und erhielten eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Färbung von Erythrozytenproteinen mit immunhistochemischen Protokollen

HINWEIS: Eine detaillierte Liste der erforderlichen Chemikalien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. In den folgenden Abschnitten wird die Herstellung der erforderlichen Lösungen beschrieben, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung des immunhistochemischen Protokolls (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der einzelnen Schritte, die für die immunhistochemische und Immunfluoreszenzfärbung von Erythrozyten-NOS an der Phosphorylierungsstelle 1177 erforderlich sind. Es wird ein typischer Arbeitsablauf der vorgestellten Protokolle vorgestellt, der von der Lösungsvorbereitung über die Blutentnahme bis hin zur Antikörper-basierten Detektion und Visualisierung reicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Entnahme der Blutprobe
    1. Entnehmen Sie Blutproben (10 ml Vollblut) von sieben gesunden Männern. Bei den Freiwilligen handelte es sich um gesunde Personen, die Berichten zufolge frei von kardiovaskulären, hämatologischen, neurologischen, endokrinen oder metabolischen Erkrankungen waren. Die Freiwilligen waren auch Nichtraucher.
    2. Das Blut wird mit einer sterilen Nadel und Spritze aus einer prominenten Vene im antecubitalen Bereich des Unterarms entnommen und sofort in Röhrchen umgefüllt, die mit einem der folgenden Antikoagulanzien beschichtet sind: Natriumheparin (für die Immunhistochemie) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; für die Fluoreszenzmarkierung).
    3. Die antikoagulierten Blutproben werden mit einem Couette-Schersystem,wie oben 7,20 beschrieben, genau kontrollierten mechanischen Kräften ausgesetzt.
      1. Die Schervorrichtung besteht aus einem drehbaren Becher und einem stationären Bob, die durch einen Spalt von 300 μm voneinander getrennt sind. Die Blutprobe wird in den Spalt überführt, wodurch die präzise steuerbare Rotationsgeschwindigkeit des Bechers gut kontrollierte mechanische Kräfte auf die Probe ausübt. Die hier präsentierten repräsentativen Daten wurden durch Anwendung mechanischer Kräfte erzeugt, die die im menschlichen Gefäßsystem auftretenden Kräfte (5 Pa) über einen längeren Zeitraum (300 s) widerspiegeln.
  2. Herstellung von Lösungen, die für die Immunfärbung erforderlich sind
    1. Bereiten Sie die Lösungen wie in Tabelle 1 vor. Die Lösungen können vor der Durchführung des Immunfärbeverfahrens hergestellt und bei einer bestimmten Temperatur gelagert werden, bis sie benötigt werden.
      HINWEIS: Die Lagerdauer kann je nach Chemikalien variieren. Prüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt.
  3. Probenvorbereitung
    1. Verarbeiten Sie Vollblut unmittelbar nach der Entnahme oder experimentellen Behandlung (falls zutreffend; z. B. mechanischer Reiz in unseren Proben; siehe Schritt 1.1.3), um kurzlebige Effekte erkennen zu können, z. B. nach Scherbelastung, Belastung, kurzzeitiger Hypoxie-Exposition usw.
    2. Führen Sie die Erythrozytenproteinfixierung mit Formaldehyd wie folgt durch: Vollblut im Verhältnis 1:2 in 4%iger Paraformaldehydlösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) verdünnen. Die Probe wird bei 132 x g für 3 min bei RT zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernt.
    3. Das Erythrozytenpellet wird in zwei Volumina von 0,1 mol/l phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1:3-Verdünnung) resuspendiert und 5 min bei RT inkubiert. Wiederholen Sie die Zentrifugation wie oben beschrieben und entfernen Sie den Überstand, der klar sein sollte, durch Pipettieren. Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in einem Volumen von 0,1 mol/L PBS (1:2-Verdünnung).
    4. Bereiten Sie Blutausstriche wie folgt vor: Beschriften Sie einen Objektträger mit der Proben-ID, dem applizierten Antikörper usw. mit einem alkoholbeständigen Stift (z. B. Bleistift). Geben Sie dann 10 μl der vorbereiteten Erythrozytenlösung direkt über das Etikettenfeld.
    5. Legen Sie einen zweiten Objektträger in einem Winkel von ca. 45° auf die Probe und verteilen Sie die Probe gleichmäßig entlang des Objektträgers. Fixieren Sie den Objektträger über einem Bunsenbrenner, indem Sie die Probe mit konstanter Bewegung 5-7 s lang über den Brenner schweben lassen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Proben vor der Hitzefixierung an der Luft zu trocknen. Die Proben können bis zur Färbung bei RT gelagert werden (Abbildung 2).
  4. Immunhistochemische Färbung
    1. Markieren Sie auf jedem Objektträger zwei Bereiche: einen Testbereich, in dem die Erythrozyten mit dem jeweiligen Primär- und Sekundärantikörper inkubiert werden, und einen Kontrollbereich, in dem der Primärantikörper durch eine Kontrolllösung ersetzt wird. Dieser Bereich dient als Kontrolle innerhalb des Assays, um das Hintergrundsignal der Erythrozyten zu bestimmen.
    2. Bereiten Sie die Lösungen vor oder während des Eingriffs gemäß Tabelle 2 vor. Es wird ein Volumen von 300 μl pro Testbereich und 200 μl pro Kontrollbereich benötigt.
      HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese antikörperbasierten Färbeverfahren eher semiquantitative als quantitative Daten liefern. Um sicherzustellen, dass aus den gewonnenen Daten aussagekräftige Schlussfolgerungen gezogen werden können, sind daher geeignete Kontrollproben (d.h. als Referenzpunkt für die bewerteten relativen Veränderungen der Proteinaktivierung) unbedingt erforderlich.
    3. Für den Trypsinaufschluss werden 0,1 % Trypsin aufgetaut und auf RT äquilibriert. Markieren Sie mit einem Fettstift zwei Bereiche auf jedem Objektträger: einen Testbereich (2/3 des Objektträgers) und einen Kontrollbereich (1/3 des Objektträgers). Tragen Sie Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vorsichtig mit Transferpipetten auf, um die Probenbereiche zu waschen. Lassen Sie die TBS 30 s ruhen und gießen Sie sie dann ab. Wiederholen Sie den Waschschritt.
      Hinweis: Fügen Sie die folgenden Lösungen sowohl dem Steuerelement als auch dem Testbereich hinzu, sofern nicht anders beschrieben. Die Bereiche müssen mit der jeweiligen Lösung ausreichend abgedeckt sein. Tragen Sie die Lösungen mit Einweg-Transferpipetten auf und wechseln Sie die Pipetten nach jeder Lösung.
    4. Fügen Sie 0,1 % Trypsin hinzu, decken Sie die Objektträger mit einer speziell angefertigten Inkubationskammer mit einem Deckel oder Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator. Stoppen Sie nach der Inkubation die Enzymreaktion durch Zugabe von Leitungswasser. Gießen Sie die Lösung ab. Waschen Sie beide Bereiche 3x mit TBS, wie oben beschrieben.
    5. Um die Peroxidaseaktivierung zu blockieren, fügen Sie Methanollösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT. Decken Sie die Objektträger während dieser Zeit ab. Gießen Sie die Lösung ab.
      ANMERKUNG: Für den Immunfluoreszenznachweis (Abschnitt 2) kann dieser Schritt entfallen, da die Blockierung endogener Peroxidasen dazu dient, ein künstliches Signal zu verhindern, das durch den Nachweis mit Meerrettichperoxidase (HRP) und 3,3′-Diaminobenzidinhydrat (DAB) verursacht wird.
    6. Waschen Sie beide Bereiche 3x mit TBS, wie in Schritt 1.4.3 beschrieben. Fügen Sie 3%ige Magermilchlösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT, um zu blockieren. Gießen Sie die Lösung ab. Danach nicht mehr waschen.
    7. Primärantikörper (AB) nur in den Testbereich geben. Geben Sie die AB-Steuerungslösung (siehe Tabelle 2) in den Kontrollbereich ein. Die Proben werden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Decken Sie die Objektträger während dieser Zeit ab, um ein Austrocknen zu verhindern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Lösungen aus dem Test- in den Kontrollbereich zu übertragen, da dies die Kontrollwerte beeinflusst.
    8. Gießen Sie die Antikörperlösung ab. Waschen Sie beide Bereiche 3x mit TBS, wie in Schritt 1.4.3 beschrieben.
    9. Führen Sie einen Blockierungsschritt aus, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Fügen Sie 3% normales Ziegenserum hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT. Gießen Sie die Lösung ab.
    10. Fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT. Gießen Sie die Antikörperlösung ab. Waschen Sie die Stellen 3x mit TBS, wie in Schritt 1.4.3 beschrieben.
  5. Entwicklung von Färbung und Abdeckung
    1. Die Avidin-gekoppelte HRP-Reaktion (siehe Verdünnung in Tabelle 2) wird durch Zugabe von verdünnter Avidin-Peroxidase-Lösung durchgeführt und 30 Minuten lang bei RT inkubiert.
    2. Bereiten Sie die DAB-Mischung vor, um die Immunfärbung vor der Verwendung gemäß Tabelle 3 zu entwickeln.
      VORSICHT: DAB ist gefährlich. Beachten Sie die Gefahrenhinweise H341 (im Verdacht, genetische Defekte zu verursachen) und H350 (kann Krebs verursachen). Beachten Sie die folgenden Sicherheitshinweise: P201, P202, P280, P308+P313, P405 und P501.
    3. Führen Sie die DAB-Kontrollfärbung wie folgt durch: Die HRP-Lösung aus Schritt 1.5.1 wird von einem Objektträger entnommen und vor dem Färben mit einem kleinen Volumen (z. B. 1 ml) der vorbereiteten DAB-Lösung in einem separaten Zentrifugenröhrchen gemischt. Die Mischung sollte eine braun/graue Farbe entwickeln.
    4. Legen Sie die Objektträger unter ein Mikroskop (mindestens 200-fache Vergrößerung) und geben Sie DAB-Lösung in beide Bereiche. Überwachen Sie die Färbung der Erythrozyten kontinuierlich und stoppen Sie die Färbung, indem Sie die DAB-Lösung mit einer Einwegpipette entfernen, bevor der Hintergrund zu färben beginnt. Für die RBC-NOS-Serin-1177-Färbung beträgt die DAB-Inkubationszeit etwa 17 Minuten.
    5. Führen Sie eine Probentrocknung durch. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgestell und tauchen Sie sie jeweils 5 s lang in Ethanollösungen verschiedener Verdünnungen, beginnend mit 70 %, gefolgt von 96 %, dann 100 % und schließlich in Xylol. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Gestell und legen Sie sie auf ein Taschentuch mit Erythrozyten an der Oberseite, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen.
    6. Geben Sie zwei oder drei Tropfen Eindeckmedium auf den Objektträger. Decken Sie die Folie mit einem Deckglas ab. Vermeiden Sie den Einschluss von Luftblasen, da dies die mikroskopische Auswertung behindert. Trocknen Sie die Proben mindestens über Nacht in einem Abzug.
  6. Durchführung mikroskopischer Auswertungen
    1. Zur Visualisierung und Bildgebung werden Objektträger in ein Durchlichtmikroskop mit mindestens 200-facher Vergrößerung gelegt. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit einer Kamera gekoppelt ist, um Bilder der gefärbten Erythrozyten aufzunehmen.
    2. Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein. Schalten Sie die am Mikroskop angeschlossene Kamera ein und starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie, um den geeigneten Fokus zu bestimmen, indem Sie die Grob- und Feinfokuseinstellknöpfe drehen und die Fokusebene finden, auf der Erythrozyten sichtbar sind.
    3. Stellen Sie die Hintergrundwerte der Bilder auf 220 ± 5 Grauwerte ein, gemessen an drei zellenfreien Bereichen der Folie. Öffnen Sie dazu das erste Bild mit der frei verfügbaren Software ImageJ. Wählen Sie die Option Mittlere Grauwerte über das Panel Messungen festlegen. Verwenden Sie das ovale Symbol, um den Grauwert mit dem Befehl Messen zu messen. Liegen die Messwerte außerhalb des zulässigen Bereichs, passen Sie die Hintergrundbeleuchtung am Mikroskop entsprechend an. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Hintergrundwerte korrekt sind.
      HINWEIS: Diese Hintergrundwerte sollten für alle aufgenommenen Bilder innerhalb des angegebenen Bereichs liegen. Andernfalls sind die Daten nicht vergleichbar.
    4. Um den Grauwert der Erythrozyten zu analysieren, markieren Sie die Kante jedes Erythrozyten mit dem Auswahlwerkzeug Oval in der ImageJ-Software. Ermitteln Sie die Grauwerte einzelner RBCs mit dem Befehl Messen . Messen Sie die Grauwerte von mindestens 50 Erythrozyten aus dem Test und von mindestens 10 Erythrozyten aus dem Kontrollbereich.
      HINWEIS: Die Gesamtzahl der analysierten Erythrozyten kann individuell angepasst werden. Je mehr Erythrozyten analysiert werden, desto aussagekräftiger ist das Ergebnis. Die Gesamtzahl der analysierten Erythrozyten sollte jedoch für jede Erkrankung, jeden Probanden usw. innerhalb eines bestimmten Experiments vergleichbar sein.
      1. Vermeiden Sie die Analyse von Erythrozyten in der Nähe des Fettstifts, da die Verfärbung in diesem Bereich unvollständig sein kann. Vermeiden Sie die Analyse von überlappenden Erythrozyten, da dies die Färbeintensität beeinflusst. Verwenden Sie nur Erythrozyten, die von anderen Erythrozyten getrennt sind. Analysieren Sie mindestens fünf Bilder aus dem Test und mindestens zwei Bilder aus dem Kontrollbereich für die Bewertung von 50/10 Erythrozyten. Beziehen Sie Erythrozyten aus jedem Bild in die endgültige Analyse ein.
    5. Um die Färbeintensität zu berechnen, berechnen Sie die Endsignale wie folgt:
      (Einzelkontrollbereich RBC - mittlerer Hintergrund des Testbereichs) - (Einzelkontrollbereich RBC - mittlerer Kontrollbereichshintergrund)

Figure 2
Abbildung 2: Darstellung des Fixierprozesses und der Blutausstrichentstehung. (Schema, das mit BioRender.com erstellt wurde.) Verdünnte Blutproben werden chemisch in Paraformaldehyd fixiert, dann zentrifugiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Zum Schluss wird resuspendiertes Blut auf einen Objektträger geschmiert und durch Schweben über einer Bunsenbrennerflamme thermisch fixiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zubereitungs- und Lagerbedingungen für Lösungen, die für die immunhistochemische Färbung erforderlich sind. Die Lösung kann vor dem Protokoll vorbereitet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Beschreibung von Antikörperlösungen zur sofortigen Anwendung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Komponenten und Protokoll zur Vorbereitung der DAB-Lösung für den sofortigen Einsatz. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Fluoreszenzmarkierung von Erythrozytenproteinen

ANMERKUNG: Der folgende Abschnitt skizziert eine Anpassung des immunhistochemischen Protokolls, das mit dem Ziel entwickelt wurde, die Verwendung von Antikörpern mit fluoreszierenden Konjugaten zu ermöglichen (Abbildung 1).

Die Vorbereitung der Blutprobe für das Immunfluoreszenzprotokoll ist identisch mit der in Abschnitt 1 beschriebenen, so dass der folgende Abschnitt mit der Färbung der Proben beginnt.

  1. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Mit dem sekundären, fluoreszierenden konjugierten Antikörper (für das Volumen siehe Schritt 1.4.2) für 30 Minuten bei lichtgeschützter RT inkubieren, entweder mit einer speziell angefertigten Inkubationskammer oder Aluminiumfolie.
    2. Gießen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und waschen Sie die Proben 3x mit TBS. Lassen Sie die letzte Wäsche auf den Proben, um ein Austrocknen zu verhindern.
    3. Gießen Sie das TBS ab und nehmen Sie die Proben nacheinander aus dem Probenrack, um eine längere Lichteinwirkung zu vermeiden. Um die Proben zu dehydrieren, werden die Objektträger jeweils ~5 s lang verschiedenen Ethanollösungen ausgesetzt, beginnend mit 70 %, gefolgt von 90 % und schließlich 100 %. Belichten Sie die Objektträger 5 s lang mit Xylol/Xylol-Lösung.
    4. Bereiten Sie ein Deckglas mit zwei oder drei Tropfen Eindeckmedium vor und montieren Sie dann den Objektträger mit dem Deckglas. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung des Eindeckmediums, indem Sie leichten Druck mit einer Pinzette oder einem ähnlichen, sterilen Metallinstrument ausüben. Beseitigen Sie Luftblasen, die sonst die Bildgebung stören könnten, mit demselben Instrument. Lassen Sie die Proben über Nacht an einem dunklen und trockenen Ort trocknen.
  2. Mikroskopische Auswertung
    1. Zur Visualisierung und Bildgebung legen Sie den Objektträger mit einer Gesamtvergrößerung von mindestens 400x auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie die Mikroskoplichtquelle und die Leuchtstofflampe ein und stellen Sie sicher, dass die Leuchtstofflichtquelle auf maximale Intensität eingestellt ist.
    2. Schalten Sie die am Mikroskop angeschlossene Kamera ein und starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie, um den geeigneten Fokus zu bestimmen, indem Sie die Knöpfe für die Grob- und Feinfokuseinstellung drehen und die Fokusebene finden, auf der Erythrozyten sichtbar sind.
      HINWEIS: Übermäßige Lichteinwirkung kann zu einem Photobleichen der fluoreszierenden Konjugate führen. Zu diesem Zweck kann ein Objektträger aus einem früheren Experiment verwendet werden, um die Lichteinwirkung der noch zu analysierenden Objektträger zu minimieren.
    3. Bestimmen Sie die optimale Laserintensität, indem Sie Erythrozyten im Kontrollbereich inspizieren. Stellen Sie sicher, dass die Intensität hoch genug ist, dass die Erythrozyten sichtbar sind, ohne ein großes Hintergrundsignal zu erzeugen. Halten Sie die Intensität und Belichtungszeit zwischen Bereichen und Proben konsistent, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
    4. Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder in mindestens drei verschiedenen Bereichen des Testbereichs des Objektträgers, die nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden. Um einen Bereich auszuwählen, schwenken Sie mit den Bedienelementen des Mikroskoptisches von den Rändern des Objektträgers weg, die durch den Lipidstift markiert sind. Wählen Sie einen Bereich aus, der eine gleichmäßige Verteilung einer einzelnen RBC-Schicht aufweist.
    5. Stellen Sie die Belichtungszeit für fluoreszierende Bilder auf 1 s ein und nehmen Sie ein Bild mit den Softwaresteuerungen der Mikroskopsteuerungssoftware auf. Wechseln Sie in den Hellfeld-Modus, stellen Sie die Belichtungszeit auf "Auto" und nehmen Sie das entsprechende Hellfeldbild auf.
    6. Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder in mindestens zwei verschiedenen, zufällig ausgewählten Bereichen des Kontrollbereichs des Objektträgers, indem Sie Schritt 2.2.3 wiederholen.
    7. Speichern Sie die Bilder im .tif-Format, um die ursprünglichen Grauwerte der Pixel beizubehalten, Komprimierung zu verhindern und Metadaten der Erfassung zu speichern.
    8. Messen Sie die Grauwerte der erfassten Erythrozyten. Öffnen Sie ImageJ (oder FIJI21; siehe Zusatzdatei 1). Ermitteln Sie die Grauwerte der einzelnen Erythrozyten. Markieren Sie dazu jede einzelne Zelle mit dem Auswahlwerkzeug Oval und analysieren Sie sie mit dem Befehl Messen .
      HINWEIS: Erythrozyten sollten nicht analysiert werden, wenn sie sich mit anderen Zellen überlappen, da dies das resultierende Signal verstärken kann.
    9. Markieren Sie zwischen drei und fünf Bereiche, die frei von Erythrozyten sind, und bestimmen Sie die Grauwerte, um ein Maß für das Hintergrundsignal zu erhalten. Analysieren Sie mindestens 150 Erythrozyten aus mindestens drei unterschiedlichen Bildern für jeden Testbereich und mindestens 50 Erythrozyten aus mindestens zwei unterschiedlichen Bildern für jeden Kontrollbereich.
      HINWEIS: Die Analyse weiterer Zellen/Bereiche kann empfohlen werden, um die Variabilität zu minimieren. Da die Erythrozytenpopulation von Natur aus heterogen ist, kann die Zell-Zell-Variabilität des Signals je nach interessiertem Protein signifikant sein.
    10. Führen Sie eine alternative Datenanalyse der aufgenommenen Bilder mit einem Makrobefehl durch. Erstellen/installieren Sie einen Makrobefehl über die FIJI-Version von ImageJ für die automatische Auswahl, Hintergrundkorrektur und Grauwertanalyse eines bestimmten Bildes.
      HINWEIS: Diese Routine verwendet automatische Schwellenwerte, um die in einem bestimmten Bild vorhandenen Zellen anhand einer Kopie des Originalbildes zu erkennen, wodurch eine Überlagerung erzeugt wird, die dem Originalbild auferlegt wird, um Grauwerte von fluoreszierenden Erythrozyten zu extrahieren. Das Makro wird als .ijm-Datei als Supplementary Coding File 1 abgelegt.
    11. Öffnen Sie die Bilddatei im .tif-Format, bereit für die Analyse in FIJI. Öffnen Sie das Makro RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) und klicken Sie auf Ausführen.
      HINWEIS: Das Makro ist für Bilder eingerichtet, die mit 600-facher Vergrößerung und einem großen Signal-Rausch-Verhältnis aufgenommen wurden. Die automatische Auswahl von Zellen sollte vom Prüfarzt überprüft werden.
  3. Berechnen Sie die Endsignale wie folgt:
    (Prüfbereich RBC - Prüfbereichshintergrund) - (Regelbereich RBC - Kontrollbereich Hintergrund) für die manuelle Analyse;
    (Testbereich - Kontrollbereich) für die automatisierte Analyse.

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Representative Results

Das vorgestellte Protokoll, das Methoden beschreibt, die den Nachweis akuter Veränderungen in Erythrozytenproteinen erleichtern, wurde an einer bekannten mechanisch sensitiven Proteinveränderung getestet: der Phosphorylierung von Erythrozyten-NOS am Serin-1177-Rest. Vollblut wurde von gesunden Probanden gewonnen und anschließend in zwei separate Aliquots aufgeteilt. Eine gegebene Blutprobe wurde 300 s lang mechanischer Scherbelastung physiologischer Größenordnung (5 Pa) ausgesetzt, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie eine Erythrozyten-NOS-Phosphorylierung an Serin 117714 hervorruft. Unmittelbar nach Beendigung der mechanischen Scherexposition wurde die Blutprobe in Paraformaldehyd fixiert. Als Kontrolle wurde eine Blutprobe exponiert, in die Schervorrichtung geladen und 300 s lang ruhen gelassen, bevor sie in Paraformaldehyd fixiert wurde. Das Signal von Antikörpern, die gegen Erythrozyten-NOS gerichtet sind, phosphorylierte am Serin-1177-Rest im Ruhezustand und als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung wurde sowohl mit Hilfe der Immunhistochemie (Abbildung 3A,B) als auch der Immunfluoreszenz (Abbildung 3C,D) untersucht. Gescherte und nicht gescherte Proben erzeugten statistisch signifikant unterschiedliche Signale [Friedman-Test: χ2(3) = 18,71, p = 0,0003]. Ein vergleichbarer, etwa dreifacher Anstieg des Signals von Antikörpern, die gegen Erythrozyten-NOS gerichtet sind, die am Serin-1177-Rest phosphoryliert sind, wurde als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung von Erythrozyten im Vergleich zu den jeweiligen ungescherten Zellen (beide p < 0,01) festgestellt, wenn sie entweder mit dem immunhistochemischen oder dem Immunfluoreszenzprotokoll untersucht wurden (Abbildung 3E).

Der Vergleich der mit beiden Methoden erzielten Ergebnisse deutet somit auf eine hervorragende Übereinstimmung zwischen den vorgestellten Protokollen hin, die auch eine erhöhte Erythrozyten-NOS-Phosphorylierung als Reaktion auf mechanische Stimulation erfolgreich und zuverlässig nachweisen konnten.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative gepoolte Daten aus der immunhistochemischen (A,B) und immunfluoreszierenden (C,D) Färbung der RBC-NOS-Serin-1177-Phosphorylierung nach mechanischer Scherung. Die Analyse der Signalintensität dieser Proben ist in (E) dargestellt, wobei die weißen Balken die mit der HRP-Färbung gewonnenen Daten und die schwarzen Balken die mit der Fluoreszenzmethode gewonnenen Daten darstellen. Das Blut wurde entweder in Ruhe oder unmittelbar nach der Einwirkung mechanischer Kraft (d. h. Scherung) aufbereitet. N = 7 Blutproben wurden von verschiedenen Spendern entnommen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts angezeigt. **p < 0,01, bestimmt mit einem nicht-parametrischen Friedman-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: Automatisierter semi-quantitativer Bildanalyse-Rohcode mit Schritt-für-Schritt-Annotationen für Bilder von immunfluoreszierenden roten Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: Kompilierter Code, der mit der FIJI/ImageJ-Software kompatibel ist, um eine automatisierte Bildanalyse von immunfluoreszierenden roten Blutkörperchen durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Neuere Literatur deutet stark darauf hin, dass das Erythrozyten-NOS-Protein von entscheidender Bedeutung für die Regulation der Verformbarkeit von Erythrozytenist 15,22,23, was wiederum ihre Passage durch enge Kapillaren erleichtert 24. Die Proteinaktivität hängt in hohem Maße von posttranslationalen Proteinmodifikationen ab, insbesondere von der Phosphorylierung bestimmter Reste18. Der Fokus des Interesses liegt auf der Phosphorylierungsstelle 1177, die mit der Aktivierung des RBC-NOS-Proteins23 zusammenhängt. Veränderungen dieses Proteins wurden bei einer Vielzahl von Krankheiten gezeigt 25,26,27,28,29, so dass die Untersuchung dieser Veränderungen nicht nur für das Verständnis bestimmter Krankheiten, sondern auch für die Entwicklung und Steuerung spezifischer Therapien wertvolle Erkenntnisse liefern könnte30.

Es wurden mehrere Stimuli identifiziert, die die Phosphorylierung des RBC-NOS-Serins 1177 erhöhen22, aber mechanische Kräfte scheinen ein wichtiger extrazellulärer Stimulus zu sein, der die Aktivierung oder Modulation des RBC-NOS-Proteinsbewirkt 13,18,31,32. Modulationen der RBC-NOS-Aktivität sind jedoch eher vorübergehend33; Daher muss die Analyse/Konservierung scherabhängiger Veränderungen sofort durchgeführt werden. Immunhistochemische und später Immunfluoreszenzprotokolle wurden entwickelt, um die Konservierung und Analyse akuter, regulatorischer Modifikationen von Erythrozyten-NOS zu erleichtern.

Die hier vorgestellten Ergebnisse, die mittels immunhistochemischer und Immunfluoreszenzprotokolle gewonnen wurden, zeigen ein hohes Maß an Übereinstimmung hinsichtlich der erhöhten Phosphorylierung von RBC-NOS-Serin 1177 nach Scherexposition. Somit eignen sich beide Protokolle für die Untersuchung transienter posttranslationaler Veränderungen von Erythrozytenproteinen, und der jeweilige Experimentator kann unter Berücksichtigung der lokal verfügbaren Ressourcen und Infrastruktur entscheiden, welche Methode er in seinem jeweiligen Labor verwenden möchte. Angesichts der breiten kommerziellen Verfügbarkeit von Antikörpern, die auf Proteine abzielen, sowohl in ihrem nativen Zustand als auch nach posttranslationalen Modifikationen, sind die vorliegenden Assays für eine beträchtliche Bandbreite von Zielstrukturen anpassbar. Daher stellen sie nützliche Werkzeuge zur Beurteilung der Erythrozytensignalisierungdar 14,27,34.

Bestimmte Aspekte sollten während des Verfahrens berücksichtigt werden. Die genannten Antikörper wurden nicht speziell für die Anwendung in Erythrozyten entwickelt. Stattdessen handelt es sich um spezifische Antikörper vom endothelialen Typ NOS (eNOS). Da eNOS und RBC-NOS eine große Homologie zu habenscheinen 22,23, wurden traditionell eNOS-spezifische Antikörper verwendet, um die Aktivierung von Erythrozyten-NOS sichtbar zu machen. Es ist wichtig zu beachten, dass Antikörper, die gegen die induzierbaren (iNOS) oder neuronalen (nNOS) Isoformen gerichtet sind, keine Signale in Erythrozyten erzeugen, was darauf hindeutet, dass RBC-NOS eine signifikante strukturelle Ähnlichkeit mit eNOS22 aufweist. Die geeignete Verdünnung muss getestet werden, bevor Antikörper im Experiment verwendet werden, da die vom Lieferanten empfohlenen Daten nicht ohne Test auf Erythrozytenexperimente angewendet werden können. Darüber hinaus erfordert ein Wechsel des Vertriebsunternehmens vor der Verwendung übermäßige Tests verschiedener Verdünnungen. Wir empfehlen, beim Testen von neu beschafften Antikörpern/Chemikalien einen hochgradig systemischen Ansatz zu verfolgen. Neue Komponenten sollten mit Dosis-Wirkungs-Ansätzen getestet werden, bei denen nur die spezifischen Schritte zur Einführung der neuen Komponente geändert werden sollten. Positivkontrollen (d. h. Stimulierung der Erythrozyten-NOS-Aktivierung) sollten durch den Vergleich von geschorenem mit ungeschorenem Blut bereitgestellt werden, wie hier dargestellt. Alternativ wurde gezeigt, dass die pharmakologische Stimulation der RBC-NOS-Phosphorylierung mit 350 pM Insulin zu einer erhöhten RBC-NOS-Phosphorylierung führt, ähnlich wie bei mechanischer Krafteinwirkung7.

Die Einschränkungen der vorgestellten Nachweismethoden erstrecken sich auf allgemeine Einschränkungen von Methoden, die auf der Spezifität kommerziell gewonnener Primärantikörper (z. B. Western Blot) beruhen. Zunächst muss ein primärer Antikörper gegen das interessierende Antigen verfügbar sein. Falls verfügbar, muss der Antikörper spezifisch für das Ziel sein, was durch funktionelle Maßnahmen (d. h. pharmakologische Behandlung mit Aktivatoren/Inhibitoren) oder durch Western Blot bestätigt werden kann. Darüber hinaus müssen die Daten, die mit den beschriebenen Methoden erzeugt werden, sorgfältig interpretiert werden. Das heißt, die vorgestellten Methoden sind semi-quantitativ und liefern Informationen über Veränderungen der Proteinmodifikationen im Vergleich zu geeigneten Kontrollproben. Die hier vorgestellte semi-quantitative Auswertung bezieht sich immer auf die Aktivierung des Enzyms und sollte nicht mit der Enzymaktivität verwechselt werden. Messungen der Enzymaktivität erfordern separate Assays, wie z. B. den Arginin-Citrullin-Assay, der die Umwandlungsrate (fmol/min) von [3 H] L-Arginin in [3H] Citrullin oder [14 C] L-Arginin in [14 C] Citrullin35,36 misst. Um zu überprüfen, ob eine erhöhte Erythrozyten-NOS-Aktivierung auch mit höheren NO-Spiegeln und/oder erhöhten Erythrozyten-Verformbarkeitswerten einhergeht, sollte z. B. eine zusätzliche Analyse der NO-Konzentration durchgeführt werden. Um Erythrozyten-NOS als NO-Quelle zu identifizieren, sollten außerdem NOS-Inhibitoren wie L-NIO eingesetzt werden15.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden gut entwickelt sind, um Veränderungen der RBC-NOS-Aktivierung als Reaktion auf applizierte Stimuli im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollzellen zu analysieren. Diese Methoden tragen somit zum Verständnis bei, wie sich mechanischer Stress auf die Funktionen von Erythrozytenproteinen auswirkt, die für die zelluläre Funktion entscheidend sind und letztendlich für eine ausreichende Durchblutung des Arbeitsgewebes und den Gasaustausch unerlässlich sind.

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Disclosures

Alle Autoren haben offengelegt, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Acknowledgments

LK bedankt sich für die Unterstützung durch ein Stipendium des australischen Forschungsausbildungsprogramms.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

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References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

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Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

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