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Biochemistry

Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.

Abstract

A marcação de anticorpos de proteínas eritrocitárias é um método semiquantitativo comumente usado para detectar mudanças no conteúdo global de proteínas ou alterações agudas em estados de ativação proteica. Facilita a avaliação de tratamentos eritrocitários, a caracterização de diferenças em determinados estados patológicos e a descrição de coerências celulares. A detecção de ativação proteica agudamente alterada (por exemplo, através de mecanotransdução) requer preparação adequada da amostra para preservar modificações proteicas temporárias. O princípio básico inclui a imobilização dos sítios de ligação alvo das proteínas eritrocitárias desejadas para permitir a ligação inicial de anticorpos primários específicos. A amostra é posteriormente processada para garantir condições ideais para a ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário correspondente. A seleção de anticorpos secundários não fluorescentes requer tratamento adicional, incluindo o acoplamento biotina-avidina e a aplicação de 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) para desenvolver a coloração, que precisa ser controlada em tempo real sob um microscópio para interromper a oxidação e, assim, colorir a intensidade a tempo. Para a detecção da intensidade da coloração, as imagens são obtidas usando um microscópio de luz padrão. Em uma modificação deste protocolo, um anticorpo secundário conjugado à fluoresceína pode ser aplicado em seu lugar, o que tem a vantagem de que nenhuma etapa adicional de desenvolvimento é necessária. Este procedimento, no entanto, requer uma objetiva de fluorescência acoplada a um microscópio para detecção da coloração. Dada a natureza semiquantitativa desses métodos, é imperativo fornecer várias colorações de controle para explicar reações de anticorpos inespecíficos e sinais de fundo. Aqui, apresentamos os protocolos de coloração e os processos analíticos correspondentes para comparar e discutir os respectivos resultados e vantagens das diferentes técnicas de coloração.

Introduction

As hemácias (hemácias) atravessam o sistema cardiovascular por 70 a 140 dias, com idade média das hemácias de aproximadamente 115 dias 1,2. As hemácias senescentes ou lesadas são removidas da circulação por eritrofagocitose, um eficiente processo de clareamento conduzido por macrófagos3. O tempo de vida predeterminado dessas células é uma consequência da entrega das organelas celulares, incluindo o núcleo, as mitocôndrias e os ribossomos, durante a diferenciação e maturação4. Assim, as hemácias circulantes são desprovidas de maquinaria translacional, impossibilitando a síntese de novas proteínas3. Conclui-se que modificações dinâmicas e pós-traducionais em proteínas existentes representam o único mecanismo viável de regulação bioquímica aguda em resposta a estressores extracelulares e intracelulares que atuam sobre as hemácias5.

As forças mecânicas parecem ser as principais pistas extracelulares que causam a ativação ou modulação de vias bioquímicas dentro das hemácias. A descoberta da proteína mecanossensível, Piezo1, em membranas eritrocitárias6 inspirou várias linhas de pesquisa investigando a sinalização ativada mecanicamente nessas células7. Por exemplo, avanços recentes têm mostrado que as propriedades físicas das hemácias são ativamente reguladas por mudanças agudas e dinâmicas das proteínas8, o que inclui fosforilação pós-traducional e ubiquitinação9. Como essas modificações normais diferem em certas doenças 9,10,11, parece ser de interesse científico e clínico determinar o estado de ativação das proteínas eritrocitárias, especificamente em relação aos processos mecanobiológicos.

A determinação de alterações agudas nos estados de ativação de proteínas eritrocitárias apresenta alguns desafios metodológicos. Por exemplo, o armazenamento de amostras de hemácias para análise posterior requer a preservação das proteínas eritrocitárias modificadas, uma vez que as modificações pós-traducionais não são duráveis. Além disso, os métodos clássicos de detecção de proteínas (por exemplo, western blotting) são notoriamente difíceis de padronizar em hemácias devido à baixa abundância de proteínas em relação à hemoglobina, que responde por ~98% do conteúdo proteico nessas células12. Assim, a coloração de hemácias quimicamente preservadas com base em anticorpos tem sido o método de escolha na investigação de modificações agudas de importantes proteínas eritrocitárias, como a isoforma eritrocitária específica da óxido nítrico sintase (RBC-NOS)13,14. Demonstrou-se que as hemácias-NOS produzem enzimaticamente óxido nítrico (NO), o que parece indispensável para propriedades essenciais das hemácias, incluindo a deformabilidade das hemácias15,16,17. Modificações pós-traducionais de RBC-NOS regulam a atividade enzimática catalítica, com a fosforilação do resíduo de serina 1177 sendo descrita para aumentar a atividade enzimática, enquanto a fosforilação dos resíduos serina 114 ou treonina 495 tem sido associada à diminuição da atividade de RBC-NOS18,19.

Coletivamente, modificações temporárias de proteínas eritrocitárias contribuem para importante função celular, e protocolos padronizados que permitem a detecção dessas proteínas modificadas são de alto valor. Aqui, apresentamos dois protocolos distintos que exploram anticorpos específicos para facilitar a detecção da ativação da proteína eritrocitária-NOS, e discutimos recomendações para análise e interpretação dos dados.

O desempenho dos protocolos descritos foi avaliado medindo-se o aumento bem relatado na fosforilação de eritrócitos-NOS no resíduo de serina 1177 em resposta a forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa).

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Protocol

Os protocolos aqui descritos estão alinhados com a Declaração de Helsinque e foram aprovados pelos Comitês de Ética da Universidade Alemã de Esportes de Colônia (16/9/2013) e da Universidade Griffith (2019/808). Os voluntários foram triados para garantir a ausência de patologias relevantes e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Coloração de proteínas eritrocitárias utilizando protocolos de imunohistoquímica

NOTA: Uma lista detalhada dos produtos químicos e materiais necessários é fornecida na Tabela de Materiais. As seções a seguir descrevem o preparo das soluções necessárias, seguidas de uma descrição detalhada do protocolo de imuno-histoquímica (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Esquema dos passos individuais necessários para a coloração imunoistoquímica e imunofluorescência das hemácias-NOS no sítio de fosforilação 1177. Um fluxo de trabalho típico dos protocolos apresentados, desde o preparo da solução e coleta de sangue até a detecção e visualização baseada em anticorpos, é apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Coleta de amostra de sangue
    1. Obter amostras de sangue (10 mL de sangue total) de sete homens saudáveis. Os voluntários eram indivíduos saudáveis e livres de doenças cardiovasculares, hematológicas, neurológicas, endócrinas ou metabólicas. Os voluntários também não eram tabagistas.
    2. Coletar sangue usando uma agulha estéril e seringa de uma veia proeminente na região antecubital do antebraço e transferir imediatamente para tubos revestidos com um dos seguintes anticoagulantes: heparina sódica (para imunohistoquímica) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA; para marcação fluorescente).
    3. Expor as amostras de sangue anticoagulado a forças mecânicas controladas com precisão usando um sistema de cisalhamento tipo Couette, como descrito anteriormente 7,20.
      1. O aparelho de cisalhamento é composto por um copo giratório e um bob estacionário, separados por um gap de 300 μm. Transfira a amostra de sangue para a lacuna, o que faz com que a velocidade de rotação precisamente controlável do copo exerça forças mecânicas bem controladas sobre a amostra. Os dados representativos aqui apresentados foram produzidos pela aplicação de forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa) por longas durações (300 s).
  2. Preparação de soluções necessárias para imunomarcação
    1. Prepare as soluções conforme a Tabela 1. As soluções podem ser preparadas antes da realização do procedimento de imunomarcação e armazenadas em determinada temperatura até que seja necessário.
      NOTA: A duração do armazenamento pode variar entre os produtos químicos. Verifique a ficha de dados de segurança do material.
  3. Preparo da amostra
    1. Processar o sangue total imediatamente após a retirada ou tratamento experimental (quando aplicável; por exemplo, estímulo mecânico em nossas amostras; ver etapa 1.1.3) para ser capaz de detectar efeitos de curta duração, por exemplo, após a aplicação de tensão de cisalhamento, exercício, exposição à hipóxia de curta duração, etc.
    2. Realizar a fixação da proteína eritrocitária com formaldeído da seguinte forma: diluir o sangue total na proporção de 1:2 em solução de paraformaldeído a 4% por 20 min à temperatura ambiente (TR). Centrifugar a amostra a 132 x g durante 3 min em RT e remover cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.
    3. Ressuspender o pellet de hemácias em dois volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,1 mol/L (diluição 1:3) e incubar por 5 min na RT. Repita a centrifugação conforme descrito acima e remova o sobrenadante, que deve estar claro, por pipetagem. Ressuspender a pastilha de hemácias em um volume de PBS 0,1 mol/L (diluição 1:2).
    4. Prepare esfregaços de sangue da seguinte forma: rotule uma lâmina de microscópio com o ID da amostra, anticorpo aplicado, etc. usando uma caneta resistente ao álcool (por exemplo, lápis). Em seguida, adicione 10 μL da solução de hemácia preparada logo acima do campo do rótulo.
    5. Coloque uma segunda lâmina sobre a amostra em um ângulo de aproximadamente 45° e disperse a amostra uniformemente ao longo da lâmina. Fixe o calor da lâmina sobre um queimador de Bunsen passando a amostra sobre o queimador com movimento constante por 5-7 s.
      NOTA: Recomenda-se secar ao ar as amostras antes da fixação térmica. As amostras podem ser armazenadas em RT até a coloração (Figura 2).
  4. Coloração imunoistoquímica
    1. Marque duas áreas em cada lâmina: uma área de teste na qual as hemácias são incubadas com o respectivo anticorpo primário e secundário e uma área de controle na qual o anticorpo primário é substituído por uma solução de controle. Esta área serve como um controle interno do ensaio para determinar o sinal de fundo das hemácias.
    2. Preparar soluções antes ou durante o procedimento, conforme Tabela 2. É necessário um volume de 300 μL por área de teste e 200 μL por área de controle.
      NOTA: É importante notar que esses procedimentos de coloração baseados em anticorpos produzem dados semiquantitativos, em vez de quantitativos. Assim, para garantir que conclusões significativas possam ser tiradas dos dados produzidos, amostras de controle apropriadas (ou seja, para fornecer um ponto de referência para as alterações relativas avaliadas na ativação de proteínas) são absolutamente necessárias.
    3. Para a digestão de tripsina, descongele a tripsina a 0,1% e equilibre para RT. Marque duas áreas em cada lâmina usando um lápis de gordura: uma área de teste (2/3 da lâmina) e uma área de controle (1/3 da lâmina). Aplique cuidadosamente solução salina tamponada com tris (TBS) usando pipetas de transferência para lavar as áreas da amostra. Deixe o TBS descansar por 30 s e depois despeje. Repita a etapa de lavagem.
      Observação : adicione as seguintes soluções para o controle e a área de teste, a menos que descrito de outra forma. As áreas precisam ser suficientemente cobertas com a respectiva solução. Aplicar as soluções utilizando pipetas de transferência descartáveis e alternar pipetas após cada solução.
    4. Adicione 0,1% de tripsina, cubra as lâminas usando uma câmara de incubação construída especificamente com uma tampa ou papel alumínio e incube por 30 min a 37 °C em uma incubadora. Após a incubação, pare a reação enzimática adicionando água da torneira. Despeje a solução. Lave ambas as áreas 3x com TBS, conforme descrito acima.
    5. Para bloquear a ativação da peroxidase, adicione solução de metanol e incube por 30 min em RT. Cubra as lâminas durante esse tempo. Despeje a solução.
      NOTA: Para a detecção de imunofluorescência (secção 2), este passo pode ser omitido, uma vez que o bloqueio das peroxidases endógenas serve para prevenir o sinal artifactual causado pela detecção com peroxidase de raiz forte (HRP) e hidrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAB).
    6. Lavar ambas as áreas 3x com TBS, conforme descrito no passo 1.4.3. Adicionar 3% de solução de leite desnatado e incubar por 30 min em RT para bloquear. Despeje a solução. Não lave depois.
    7. Adicionar anticorpo primário (AB) apenas à área de teste. Adicione a solução de controle AB (consulte a Tabela 2) à área de controle. Incubar as amostras a 4 °C durante a noite. Cubra as lâminas durante esse tempo para evitar a secagem.
      NOTA: Evite transferir as soluções do teste para a área de controle, pois isso influenciará os valores de controle.
    8. Despeje a solução de anticorpos. Lavar ambas as áreas 3x com TBS, conforme descrito no passo 1.4.3.
    9. Execute uma etapa de bloqueio para evitar vinculação inespecífica. Adicionar 3% de soro normal de cabra e incubar por 30 min em RT.
    10. Adicione a solução de anticorpos secundários e incube por 30 min na RT. Despeje a solução de anticorpos. Lavar as áreas 3x com TBS, conforme descrito no passo 1.4.3.
  5. Desenvolvimento de coloração e cobertura
    1. Efectuar a reacção HRP associada à avidina (ver diluição no quadro 2) adicionando solução diluída de avidina-peroxidase e incubando durante 30 minutos em RT.
    2. Preparar a mistura DAB para desenvolver a imunomarcação antes do uso, conforme Tabela 3.
      CUIDADO: DAB é perigoso. Considere as advertências de perigo H341 (suspeita de causar defeitos genéticos) e H350 (pode causar câncer). Considere as seguintes declarações de precaução: P201, P202, P280, P308+P313, P405 e P501.
    3. Realizar a coloração de controle DAB da seguinte forma: coletar a solução de HRP da etapa 1.5.1 de uma lâmina e misturar com um pequeno volume (por exemplo, 1 mL) de solução DAB preparada em um tubo de centrífuga separado antes da coloração. A mistura deve desenvolver uma cor marrom/cinza.
    4. Coloque as lâminas sob um microscópio (aumento de pelo menos 200x) e adicione solução DAB a ambas as áreas. Monitore a coloração das hemácias continuamente e pare a coloração removendo a solução DAB com uma pipeta descartável antes que o fundo comece a colorir. Para a coloração de serina 1177 RBC-NOS, o tempo de incubação do DAB é de cerca de 17 min.
    5. Realizar a desidratação da amostra. Coloque as lâminas em uma cremalheira de vidro e mergulhe por 5 s cada em soluções de etanol de várias diluições, começando com 70%, seguido por 96%, depois 100% e, finalmente, em xilol. Retire as lâminas do rack e coloque em um tecido, com hemácias na parte superior para absorver o excesso de líquido.
    6. Adicione duas ou três gotas de meio de montagem em todo o slide. Cubra o slide usando uma lamínula. Evitar a inclusão de bolhas de ar, pois isso dificulta a avaliação microscópica. Seque as amostras pelo menos durante a noite em um exaustor.
  6. Realização de avaliação microscópica
    1. Para visualização e obtenção de imagens, coloque as lâminas em um microscópio de luz transmitida com aumento de pelo menos 200x. Certifique-se de que o microscópio esteja acoplado a uma câmera para tirar fotos das hemácias coradas.
    2. Ligue a fonte de luz do microscópio. Ligue a câmera acoplada ao microscópio e inicie o software de controle do microscópio. Use a microscopia de campo brilhante para determinar o foco apropriado, girando os botões de ajuste de foco grosso e fino e encontrando o nível de foco onde as hemácias são visíveis.
    3. Defina os valores de plano de fundo das imagens como 220 ± 5 valores de cinza, medidos em três áreas livres de células do slide. Para fazer isso, abra a primeira imagem usando o software disponível gratuitamente ImageJ. Selecione a opção Valores médios de cinza usando o painel Definir medidas. Use o ícone oval para medir o valor cinza usando o comando Medir . Se os valores medidos estiverem fora do intervalo, ajuste a luz de fundo no microscópio de acordo. Repita essas etapas até que os valores de plano de fundo estejam corretos.
      Observação : esses valores de plano de fundo devem estar dentro do intervalo fornecido para todas as imagens tiradas. Caso contrário, os dados não serão comparáveis.
    4. Para análise do valor de cinza RBC, marque a borda de cada RBC usando a ferramenta de seleção Oval dentro do software ImageJ. Determine os valores de cinza de hemácias individuais usando o comando Measure . Medir os valores de cinza de um mínimo de 50 hemácias do teste e um mínimo de 10 hemácias da área de controle.
      NOTA: O número total de hemácias analisadas pode ser ajustado individualmente. Quanto mais hemácias analisadas, mais significativo é o resultado. No entanto, o número total de hemácias analisadas deve ser comparável para cada condição, sujeito, etc. dentro de um determinado experimento.
      1. Evite a análise de hemácias perto do lápis de gordura, pois a coloração pode estar incompleta nessa área. Evite a análise de hemácias sobrepostas, pois isso afeta a intensidade da coloração. Utilizar somente hemácias separadas de outras hemácias. Analisar pelo menos cinco imagens do teste e pelo menos duas imagens da área de controle para a avaliação de 50/10 hemácias. Incluir hemácias de cada foto na análise final.
    5. Para calcular a intensidade de coloração, calcule os sinais finais como:
      (RBC da área de teste individual - fundo médio da área de teste) - (RBC da área de controle individual - fundo da área de controle médio)

Figure 2
Figura 2: Representação do processo fixador e geração de esfregaço sanguíneo. (Esquema criado com BioRender.com.) As amostras de sangue diluídas são fixadas quimicamente em paraformaldeído, depois centrifugadas e lavadas com solução salina tamponada com fosfato. Finalmente, o sangue ressuspendido é manchado em uma lâmina de vidro e fixado termicamente através do pairar sobre uma chama de queimador de Bunsen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Condições de preparo e armazenamento das soluções necessárias para a coloração imunoistoquímica. A solução pode ser preparada antes do protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Descrição das soluções de anticorpos para uso imediato. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Componentes e protocolo para preparar a solução DAB para uso imediato. Clique aqui para baixar esta tabela.

2. Marcação fluorescente de proteínas eritrocitárias

NOTA: A seção a seguir descreve uma adaptação do protocolo de imunohistoquímica, desenvolvido com o objetivo de possibilitar o uso de anticorpos com conjugados fluorescentes (Figura 1).

A preparação da amostra de sangue para o protocolo de imunofluorescência é idêntica à descrita na secção 1, pelo que a secção seguinte começa a partir da coloração das amostras.

  1. Coloração por imunofluorescência
    1. Incubar com o anticorpo conjugado fluorescente secundário (para o volume, ver passo 1.4.2) durante 30 minutos em RT protegido da luz, utilizando uma câmara de incubação construída especificamente ou folha de alumínio.
    2. Deite a solução de anticorpos secundários e lave as amostras 3x com TBS. Deixe a lavagem final nas amostras para evitar que sequem.
    3. Despeje o TBS e remova as amostras do rack de amostras, uma de cada vez, para evitar a exposição prolongada à luz. Para desidratar as amostras, exponha as lâminas a diferentes soluções de etanol por ~5 s cada, começando com 70%, seguido por 90% e, finalmente, 100%. Expor as lâminas à solução de xilol/xileno por 5 s.
    4. Prepare uma lamínula com duas ou três gotas de meio de montagem e, em seguida, monte a corrediça com a lamínula. Garanta a distribuição uniforme do meio de montagem aplicando uma leve pressão com uma pinça ou um instrumento de metal estéril similar. Elimine bolhas de ar, que podem interferir com a imagem, com o mesmo instrumento. Deixe as amostras secar durante a noite em um espaço escuro e seco.
  2. Avaliação microscópica
    1. Para visualização e aquisição de imagens, colocar a lâmina no palco do microscópio com um aumento total de pelo menos 400x. Ligue a fonte de luz do microscópio e a fonte de luz fluorescente, garantindo que a fonte de luz fluorescente seja ajustada para a intensidade máxima.
    2. Ligue a câmera acoplada ao microscópio e inicie o software de controle do microscópio. Use a microscopia de campo brilhante para determinar o foco apropriado, girando os botões de ajuste de foco grosso e fino e encontrando o nível de foco onde as hemácias são visíveis.
      NOTA: A exposição excessiva à luz pode causar fotobranqueamento dos conjugados fluorescentes. Pode-se utilizar uma lâmina de um experimento anterior para esse fim, para minimizar a exposição à luz das lâminas que ainda serão analisadas.
    3. Determine a intensidade ideal do laser inspecionando as hemácias na área de controle. Certifique-se de que a intensidade seja alta o suficiente para que as hemácias estejam visíveis, enquanto não produzem um grande sinal de fundo. Mantenha a intensidade e o tempo de exposição consistentes entre áreas e amostras para garantir a comparabilidade.
    4. Capture imagens de campo claro e fluorescentes em pelo menos três áreas distintas da área de teste da lâmina, selecionadas aleatoriamente. Para selecionar uma área, afaste-se das bordas da lâmina marcadas pela caneta lipídica, usando os controles de estágio do microscópio. Selecione uma área que exiba distribuição uniforme de uma camada singular de eritrócitos.
    5. Defina o tempo de exposição para 1 s para imagens fluorescentes e capture uma imagem usando os controles de software do software de controle do microscópio. Alterne para o modo de campo brilhante, defina o tempo de exposição como 'Automático' e capture a imagem de campo brilhante correspondente.
    6. Capture imagens de campo brilhante e fluorescentes em pelo menos duas áreas distintas selecionadas aleatoriamente da área de controle da lâmina repetindo a etapa 2.2.3.
    7. Salve as imagens em .tif formato para preservar os valores de cinza originais dos pixels, impedir a compactação e transportar metadados da aquisição.
    8. Meça os valores de cinza das hemácias capturadas. Abra o ImageJ (ou FIJI21; consulte Arquivo Suplementar 1). Determine os valores de cinza de hemácias individuais. Para isso, marque cada célula individual com a ferramenta de seleção Oval e analise usando o comando Medir .
      NOTA: As hemácias não devem ser analisadas se se sobreporem a outras células, pois isso pode aumentar o sinal resultante.
    9. Realce entre três e cinco áreas livres de hemácias e determine os valores de cinza para fornecer uma medida do sinal de fundo. Analisar pelo menos 150 hemácias de pelo menos três imagens distintas para cada área de teste e pelo menos 50 hemácias de pelo menos duas imagens distintas para cada área de controle.
      NOTA: A análise de mais células/áreas pode ser aconselhada para minimizar a variabilidade. Dado que a população de eritrócitos é inerentemente heterogênea, a variabilidade célula-célula no sinal pode ser significativa, dependendo da proteína de interesse.
    10. Execute a análise de dados alternativos das imagens capturadas usando o comando macro. Crie/instale um comando de macro por meio da versão FIJI do ImageJ para seleção automatizada, correção de plano de fundo e análise de valor cinza de uma determinada imagem.
      Observação : essa rotina usa o limiar automatizado para detectar as células presentes em uma determinada imagem usando uma cópia da imagem original, produzindo uma sobreposição que é imposta à imagem original para extrair valores de cinza de hemácias fluorescentes. A macro é depositada como um arquivo .ijm, como arquivo de codificação suplementar 1.
    11. Abra o arquivo de imagem em .tif formato pronto para análise em FIJI. Abra a macro fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) do RBC e clique em Executar.
      NOTA: A macro está configurada para imagens obtidas com ampliação de 600x e uma grande relação sinal-ruído. A seleção automática de células deve ser revista pelo investigador.
  3. Calcule os sinais finais como:
    (área de teste RBC - fundo da área de teste) - (área de controle RBC - fundo da área de controle) para análise manual;
    (área de teste - área de controle) para análise automatizada.

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Representative Results

O protocolo apresentado, descrevendo métodos que facilitam a detecção de alterações agudas em proteínas eritrocitárias, foi testado em uma conhecida alteração proteica mecanicamente sensível: a fosforilação de hemácias-NOS no resíduo de serina 1177. O sangue total foi obtido de voluntários saudáveis e posteriormente dividido em duas alíquotas separadas. Uma determinada amostra de sangue foi exposta a tensão de cisalhamento mecânica de magnitude fisiológica (5 Pa) por 300 s, que foi previamente demonstrada para eliciar a fosforilação de eritrócitos-NOS na serina 117714. Imediatamente após a cessação da exposição ao cisalhamento mecânico, a amostra de sangue foi fixada em paraformaldeído. Como controle, uma amostra de sangue foi exposta, carregada no dispositivo de cisalhamento e deixada em repouso por 300 s antes da fixação em paraformaldeído. O sinal de anticorpos direcionados contra eritrócitos-NOS fosforilados no resíduo de serina 1177 em repouso e em resposta à exposição à força mecânica foi avaliado por imunoistoquímica (Figura 3A,B) e imunofluorescência (Figura 3C,D). Amostras cisalhadas e não cisalhadas produziram sinais estatisticamente diferentes [teste de Friedman: χ2(3) = 18,71, p = 0,0003]. Um aumento comparável, de aproximadamente três vezes, no sinal de anticorpos direcionados contra hemácias-NOS fosforilados no resíduo de serina 1177 foi detectado em resposta à exposição à força mecânica das hemácias, em comparação com as respectivas células não cisalhadas (ambos p < 0,01) quando avaliados com o protocolo de imuno-histoquímica ou imunofluorescência (Figura 3E).

Assim, a comparação dos resultados obtidos com os dois métodos indica excelente concordância entre os protocolos apresentados, que também detectaram com sucesso e confiabilidade o aumento da fosforilação das hemácias-NOS em resposta à estimulação mecânica.

Figure 3
Figura 3: Dados agrupados representativos da coloração imunoistoquímica (A,B) e imunofluorescente (C,D) da fosforilação da serina 1177 eritrocitária-NOS após cisalhamento mecânico. A análise da intensidade de sinal dessas amostras é apresentada em (E), onde barras brancas refletem dados obtidos pela coloração HRP, e barras pretas representam dados obtidos pelo método fluorescente. O sangue foi preparado em repouso ou imediatamente após a exposição à força mecânica (isto é, cisalhamento). N = 7 amostras de sangue foram obtidas de doadores distintos. Os dados apresentados como média ± erro padrão da média. **p < 0,01, determinado por meio de teste não paramétrico de Friedman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Código bruto de análise semiquantitativa automatizada de imagens com anotações passo a passo para imagens de hemácias imunofluorescentes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: Código compilado compatível com o software FIJI/ImageJ para executar análise automatizada de imagens de hemácias imunofluorescentes. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A literatura recente sugere que a proteína RBC-NOS é de fundamental importância para a regulação da deformabilidade das hemácias 15,22,23, o que, por sua vez, facilita sua passagem por capilares estreitos 24. A atividade proteica depende fortemente de modificações proteicas pós-traducionais, particularmente da fosforilação de certos resíduos18. O foco de interesse está no sítio de fosforilação 1177, que se relaciona com a ativação da proteína eritrocitária-NOS23. Alterações dessa proteína têm sido demonstradas em uma variedade de doenças25,26,27,28,29, assim, a investigação dessas alterações poderia fornecer conhecimentos valiosos não só para o entendimento de determinadas doenças, mas também para desenvolver e orientar terapiasespecíficas30.

Vários estímulos têm sido identificados para aumentar a fosforilação da serina 1177 eritrocitária22, mas as forças mecânicas parecem ser um importante estímulo extracelular que causa ativação ou modulação da proteína eritrocitária-NOS 13,18,31,32. No entanto, as modulações da atividade das hemácias-NOS são bastante temporárias33; Assim, a análise/preservação das alterações cisalhantes dependentes deve ser realizada imediatamente. Protocolos de imuno-histoquímica e, posteriormente, de imunofluorescência foram desenvolvidos para facilitar a preservação e análise de modificações agudas e regulatórias da RBC-NOS.

Os resultados aqui apresentados, obtidos através de protocolos de imuno-histoquímica e imunofluorescência, mostram um alto nível de concordância quanto ao aumento da fosforilação da serina 1177 eritrocitária NOS após exposição ao cisalhamento. Assim, ambos os protocolos são adequados para a investigação de alterações pós-traducionais transitórias de proteínas eritrocitárias, e o respectivo experimentador pode decidir qual método poderá utilizar em seu respectivo laboratório, considerando os recursos e a infraestrutura localmente disponíveis. Dada a ampla disponibilidade comercial de anticorpos direcionados a proteínas, tanto em seu estado nativo quanto após modificações pós-traducionais, os presentes ensaios são adaptáveis para uma gama considerável de alvos. Assim, apresentam ferramentas úteis para avaliar a sinalização eritrocitária14,27,34.

Alguns aspectos devem ser considerados durante o procedimento. Os anticorpos mencionados não são desenvolvidos especificamente para serem aplicados em hemácias. Em vez disso, estes são anticorpos específicos do tipo endotelial NOS (eNOS). Como a eNOS e a RBC-NOS parecem compartilhar grande homologia22,23, anticorpos específicos para eNOS têm sido tradicionalmente usados para visualizar a ativação de hemácias-NOS. É importante notar que anticorpos dirigidos contra as isoformas induzíveis (iNOS) ou neuronais (nNOS) não produzem sinais nas hemácias, sustentando que as hemácias-NOS compartilham semelhança estrutural significativa com a eNOS22. A diluição adequada deve ser testada antes de qualquer anticorpo ser utilizado na experiência, uma vez que os dados recomendados pelo fornecedor não podem ser aplicados à experimentação de eritrócitos sem ensaio. Além disso, uma mudança de empresas distribuidoras requer testes excessivos de várias diluições antes do uso. Recomendamos seguir uma abordagem altamente sistêmica ao testar anticorpos/produtos químicos de origem recente; Novos componentes devem ser testados com abordagens dose-resposta, onde apenas as etapas específicas que introduzem o novo componente devem ser alteradas. Controles positivos (isto é, estimulando a ativação de eritrócitos-NOS) devem ser fornecidos comparando-se sangue cortado com sangue não cisalhado, como apresentado aqui. Alternativamente, a estimulação farmacológica da fosforilação de eritrócitos-NOS com insulina 350 pM demonstrou resultar em aumento da fosforilação de CH-NOS, semelhante ao observado com a aplicação de força mecânica7.

As limitações dos métodos de detecção apresentados estendem-se a limitações comuns de métodos que dependem da especificidade de anticorpos primários obtidos comercialmente (por exemplo, western blot). Primeiro, um anticorpo primário direcionado para o antígeno de interesse deve estar disponível. Se disponível, o anticorpo deve ser específico para o alvo, o que pode ser confirmado por medidas funcionais (ou seja, tratamento farmacológico com ativadores/inibidores) ou usando western blotting. Além disso, os dados produzidos através dos métodos descritos devem ser cuidadosamente interpretados. Ou seja, os métodos apresentados são semiquantitativos, fornecendo informações sobre mudanças nas modificações proteicas em relação às amostras controle apropriadas. A avaliação semiquantitativa aqui apresentada refere-se sempre à ativação da enzima, não devendo ser confundida com a atividade enzimática. Medidas da atividade enzimática requerem ensaios separados, como o ensaio arginina-citrulina que mede a taxa de conversão (fmol/min) de [3 H] L-arginina em [3H] citrulina ou [14 C] L-arginina em [14 C] citrulina35,36. Para verificar se o aumento da ativação das hemácias-NOS também é acompanhado por níveis mais elevados de NO e/ou maiores valores de deformabilidade das hemácias, análises adicionais da concentração de NO, por exemplo, devem ser realizadas. Além disso, para destacar as hemácias como fonte de NO, inibidores da NO, como a L-NIO devem ser empregados15.

Pode-se resumir que os métodos aqui apresentados são bem desenvolvidos para analisar mudanças na ativação de hemácias-NOS em resposta a estímulos aplicados em relação a células controle não estimuladas. Esses métodos contribuem, portanto, para o entendimento de como o estresse mecânico afeta as funções das proteínas eritrocitárias, que são críticas para a função celular e, em última análise, vitais para a perfusão adequada do tecido de trabalho e das trocas gasosas.

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Disclosures

Todos os autores declararam não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

A LK reconhece o apoio de uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

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References

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Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

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