Denne protokollen beskriver metoder for evaluering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider. Inkludert her er omfattende pletterings- og fargemetoder, samt detaljerte, objektive kvantifiseringsprosedyrer.
Immunfluorescens er en av de mest brukte teknikkene for å visualisere målantigener med høy følsomhet og spesifisitet, noe som muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av proteiner, glykaner og små molekyler. Mens denne teknikken er veletablert i todimensjonal (2D) cellekultur, er mindre kjent om bruken i tredimensjonale (3D) cellemodeller. Eggstokkreftorganoider er 3D-tumormodeller som rekapitulerer tumorcelle klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. Dermed er de overlegne cellelinjer for evaluering av legemiddelfølsomhet og funksjonelle biomarkører. Derfor er evnen til å utnytte immunfluorescens på primære eggstokkreftorganoider ekstremt gunstig for å forstå biologien til denne kreften. Den nåværende studien beskriver teknikken for immunfluorescens for å oppdage DNA-skadereparasjonsproteiner i høyverdige serøse pasientavledede eggstokkreftorganoider (PUD). Etter å ha utsatt PUDene for ioniserende stråling, utføres immunfluorescens på intakte organoider for å evaluere nukleære proteiner som foci. Bilder samles inn ved hjelp av z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi og analyseres ved hjelp av automatisert programvare for focitelling. De beskrevne metodene tillater analyse av tidsmessig og spesiell rekruttering av DNA-skadereparasjonsproteiner og samlokalisering av disse proteinene med cellesyklusmarkører.
Eggstokkreft er den viktigste dødsårsaken på grunn av gynekologisk malignitet. De fleste pasienter behandles med DNA-skadelige legemidler som karboplatin, og de med homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) -mangelfulle svulster kan gis poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hemmere 1,2. Imidlertid utvikler de fleste pasienter motstand mot disse terapiene og dør innen 5 år etter diagnosen. Dysregulering av DNA-skaderesponsen (DDR) har vært assosiert med utvikling av eggstokkreft og både kjemoterapi og PARP-hemmerresistens3. Dermed er studiet av DDR viktig for å forstå patofysiologien til eggstokkreft, potensielle biomarkører og nye målrettede terapier.
Nåværende metoder for å evaluere DDR benytter immunfluorescens (IF), da dette muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av DNA-skadeproteiner og nukleotidanaloger. Når det er en dobbeltstrenget pause (DSB) i DNA, blir histonproteinet H2AX raskt fosforylert, og danner et fokus der DNA-skadereparasjonsproteiner samles4. Denne fosforyleringen kan lett identifiseres ved hjelp av IF; faktisk har ɣ-H2AX-analysen ofte blitt brukt for å bekrefte induksjonen av en DSB 5,6,7,8,9. Økt DNA-skade har vært assosiert med platinafølsomhet og effekt av DNA-skadelige midler 10,11,12, og ɣ-H2AX har blitt foreslått som en biomarkør assosiert med kjemoterapirespons i andre kreftbehandlinger 13. På en DSB utfører en celle dyktig i HRR en rekke hendelser som fører til at BRCA1 og BRCA2 rekrutterer RAD51 for å erstatte replikasjonsprotein A (RPA) og binde seg til DNA. HRR-reparasjon bruker en DNA-mal for å reparere DSB trofast. Men når svulster er mangelfull i HRR, er de avhengige av alternative reparasjonsveier som ikke-homolog endekobling (NHEJ). NHEJ er kjent for å være utsatt for feil og skaper en høy mutasjonsbelastning på cellen, som bruker 53BP1 som en positiv regulator14. Disse DNA-skadeproteinene kan alle nøyaktig identifiseres som foci ved hjelp av IF. I tillegg til farging for proteiner, kan IF brukes til å studere gaffelbeskyttelse og enkeltstrenget DNA-gapdannelse. Evnen til å ha stabile gafler har vært korrelert med platinarespons, og nylig har gapanalyser vist potensialet til å forutsi responsen på PARP-hemmere 6,15,16,17. Derfor er farging for nukleotidanalogene etter innføring i genomet en annen måte å studere DDR på.
Hittil har evaluering av DDR i eggstokkreft i stor grad vært begrenset til homogene 2D-cellelinjer som ikke rekapitulerer den klonale heterogeniteten, mikromiljøet eller arkitekturen til in vivo-svulster 18,19. Nyere forskning tyder på at organoider er overlegne 2D-cellelinjer når de studerer komplekse biologiske prosesser som DDR-mekanismer6. Den nåværende metodikken evaluerer RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA og geminin i PUD. Disse metodene vurderer den intakte organoiden og tillater studier av DDR-mekanismer i en setting som ligner mer på in vivo-tumormikromiljøet. Sammen med konfokalmikroskopi og automatisert foci-telling, kan denne metoden hjelpe til med å forstå DDR-banen i eggstokkreft og tilpasse behandlingsplaner for pasienter.
DNA-skaderesponsen spiller en integrert rolle i både utviklingen av eggstokkreft og kjemoterapiresistens. Derfor er en grundig forståelse av DNA-reparasjonsmekanismer avgjørende. Her presenteres en metodikk for å studere DNA-skadereparasjonsproteiner i 3D, intakte organoider. En reproduserbar, pålitelig protokoll er utviklet ved hjelp av kjennetegn antistoffer for å evaluere DNA-skade, homolog rekombinasjon, ikke-homolog slutt sammenføyning, og replikasjonsstress. Det er viktig at disse metodene valideres ved hjel…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for veiledningen fra Pavel Lobachevsky, PhD i etableringen av denne protokollen. Vi vil også gjerne anerkjenne Washington University’s School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington Universitys Dean’s Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.
1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
Pipette | Rainin | 17014382 | |
Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |