Visualisera DNA-skador reparera proteiner i patient-derived äggstockscancer organoider via immunofluorescensanalyser
Summary
Detta protokoll beskriver metoder för att utvärdera DNA-skadereparationsproteiner i patient-derived ovarial cancer organoids. Här ingår omfattande pläterings- och färgningsmetoder samt detaljerade, objektiva kvantifieringsförfaranden.
Abstract
Immunofluorescens är en av de mest använda teknikerna för att visualisera målantigener med hög känslighet och specificitet, vilket möjliggör noggrann identifiering och lokalisering av proteiner, glykaner och små molekyler. Medan denna teknik är väletablerad i tvådimensionell (2D) cellodling, är mindre känt om dess användning i tredimensionella (3D) cellmodeller. Äggstockscancerorganoider är 3D-tumörmodeller som rekapitulerar tumörcellklonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cellmatrisinteraktioner. Således är de överlägsna cellinjer för utvärdering av läkemedelskänslighet och funktionella biomarkörer. Därför är förmågan att utnyttja immunofluorescens på primära äggstockscancerorganoider extremt fördelaktigt för att förstå biologin hos denna cancer. Den aktuella studien beskriver tekniken för immunofluorescens för att detektera DNA-skadereparationsproteiner i höggradiga serösa patient-härledda äggstockscancerorganoider (SUB). Efter exponering av SUB: erna för joniserande strålning utförs immunofluorescens på intakta organoider för att utvärdera kärnproteiner som foci. Bilder samlas in med z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi och analyseras med hjälp av automatiserad programvara för fociräkning. De beskrivna metoderna möjliggör analys av tidsmässig och speciell rekrytering av DNA-skador, reparationsproteiner och samlokalisering av dessa proteiner med cellcykelmarkörer.
Introduction
Äggstockscancer är den vanligaste dödsorsaken på grund av gynekologisk malignitet. Majoriteten av patienterna behandlas med DNA-skadliga läkemedel som karboplatin, och de med homolog rekombinationsreparation (HRR) -bristfälliga tumörer kan ges poly (ADP-ribos) polymeras (PARP) hämmare 1,2. De flesta patienter utvecklar dock resistens mot dessa terapier och dör inom 5 år efter diagnos. Dysreglering av DNA-skaderesponsen (DDR) har associerats med utvecklingen av äggstockscancer och både kemoterapi och PARP-hämmareresistens3. Således är studier av DDR absolut nödvändiga för att förstå patofysiologin för äggstockscancer, potentiella biomarkörer och nya riktade terapier.
Nuvarande metoder för att utvärdera DDR använder immunofluorescens (IF), eftersom detta möjliggör noggrann identifiering och lokalisering av DNA-skadeproteiner och nukleotidanaloger. När det finns en dubbelsträngad paus (DSB) i DNA, fosforyleras histonproteinet H2AX snabbt och bildar ett fokus där DNA-reparationsproteiner samlas4. Denna fosforylering kan lätt identifieras med hjälp av IF; i själva verket har ɣ-H2AX-analysen vanligtvis använts för att bekräfta induktionen av en DSB 5,6,7,8,9. Ökad DNA-skada har associerats med platinakänslighet och effekt av DNA-skadliga medel 10,11,12, och ɣ-H2AX har föreslagits som en biomarkör associerad med kemoterapisvar i andra cancerbehandlingar 13. Vid en DSB utför en cell som är skicklig i HRR en serie händelser som leder till att BRCA1 och BRCA2 rekryterar RAD51 för att ersätta replikationsprotein A (RPA) och binda till DNA. HRR-reparation använder en DNA-mall för att troget reparera DSB. Men när tumörer har brist på HRR, förlitar de sig på alternativa reparationsvägar såsom icke-homolog ändfogning (NHEJ). NHEJ är känt för att vara felbenägen och skapar en hög mutationsbörda på cellen, som använder 53BP1 som en positiv regulator14. Dessa DNA-skadeproteiner kan alla identifieras exakt som foci med hjälp av IF. Förutom färgning för proteiner kan IF användas för att studera gaffelskydd och enkelsträngad DNA-gapbildning. Förmågan att ha stabila gafflar har korrelerats med platinasvar, och nyligen har gapanalyser visat potentialen att förutsäga svaret på PARP-hämmare 6,15,16,17. Därför är färgning för nukleotidanalogerna efter införande i genomet ett annat sätt att studera DDR.
Hittills har utvärderingen av DDR i äggstockscancer i stor utsträckning begränsats till homogena 2D-cellinjer som inte rekapitulerar den klonala heterogeniteten, mikromiljön eller arkitekturen hos in vivo-tumörer 18,19. Ny forskning tyder på att organoider är överlägsna 2D-cellinjer när det gäller att studera komplexa biologiska processer som DDR-mekanismer6. Den nuvarande metoden utvärderar RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA och geminin i SUB. Dessa metoder bedömer den intakta organoiden och möjliggör studier av DDR-mekanismer i en miljö som mer liknar tumörmikromiljön in vivo. Tillsammans med konfokalmikroskopi och automatiserad foci-räkning kan denna metod hjälpa till att förstå DDR-vägen vid äggstockscancer och anpassa behandlingsplaner för patienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-skadesvaret spelar en integrerad roll i både utvecklingen av äggstockscancer och kemoterapiresistens. Därför är en grundlig förståelse av DNA-reparationsmekanismer absolut nödvändig. Här presenteras en metodik för att studera DNA-skadereparerande proteiner i 3D, intakta organoider. Ett reproducerbart, tillförlitligt protokoll utvecklas med hjälp av kännetecknande antikroppar för att utvärdera DNA-skador, homolog rekombination, icke-homolog ändfogning och replikationsstress. Det är viktigt att dessa …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för vägledningen från Pavel Lobachevsky, PhD vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University’s School of Medicine i St. Louis’s Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University’s Dean’s Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Referencias
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Investigación sobre el cáncer. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Investigación sobre el cáncer. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Investigación sobre el cáncer. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
