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Artículo de método

Producción de suero condicionado autólogo modificado y evaluación ex vivo de su potencial curativo en el epitelio corneal murino

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DOI:

10.3791/64911

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24 de marzo de 2023

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1Department of Education, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 2School of Medicine, Chang Gung University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology, 4Cell Therapy Center, Tri-Service General Hospital, 5Department of General Surgery, Bo-Ai Clinic, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 7Institute of Clinical Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un protocolo para simplificar el proceso y hacer que la preparación de suero condicionado autólogo (SCA) sea menos costosa. No se necesitan jeringas especiales ni perlas de vidrio recubiertas superficialmente. Además, el SCA modificado (mACS) tiene ventajas competitivas sobre el suero autólogo convencional en la cicatrización de heridas corneales de ojos murinos ex vivo.

Resumen

Las terapias tópicas derivadas de la sangre humana han sido una bendición para los médicos en las últimas décadas. El suero autólogo (EA) y el plasma rico en plaquetas (PRP) están enriquecidos en factores de crecimiento epiteliotrópicos que son esenciales en la cicatrización de heridas corneales. A diferencia de AS, PRP se basa en un sistema de centrifugación diferencial, produciendo más factores de crecimiento derivados de plaquetas. El suero autólogo condicionado (SCA) no solo preserva la preparación de AS y PRP, sino que también se centra en las propiedades inmunomoduladoras, que son importantes en las enfermedades inflamatorias.

La falta de protocolos estandarizados y los altos costos de preparación son limitaciones para la aplicación clínica de SCA. Este experimento en video demuestra un procedimiento operativo estándar para preparar gotas oftálmicas modificadas de suero autólogo condicionado (mACS). Primero, se agregó glicerol en jeringas de heparina como estabilizador de células sanguíneas durante la incubación hipóxica. Para activar las células sanguíneas, se inició una incubación de 4 h a 37 °C. Luego, las muestras de sangre se centrifugaron a 3.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm, las gotas oftálmicas mACS se prepararon completamente.

Una prueba tentativa del efecto terapéutico de mACS mostró que puede tener ventajas competitivas sobre la EA convencional en la cicatrización de heridas corneales en ojos de ratón ex vivo . La EA utilizada en este estudio fue preparada de acuerdo con los estudios publicados y la práctica clínica en nuestro hospital. Por lo tanto, la eficacia de mACS en enfermedades de la superficie ocular podría evaluarse en futuras investigaciones a través de estudios in vivo en animales y ensayos clínicos.

Introducción

Los efectos terapéuticos del suero autólogo (EA) en las enfermedades del ojo seco fueron reportados por primera vez en la década de 1980 por Fox et al.1. Se cree que tanto la propiedad lubricante como los componentes bioquímicos epiteliotrópicos esenciales en la EA, imitando las lágrimas naturales, benefician la proliferación de células epiteliales corneales. En las últimas décadas, se han realizado varios estudios sobre esta base. Los componentes tróficos incluyen factor de crecimiento epidérmico (EGF), vitamina A, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y otras citocinas. Curiosamente, el suero es rico en TGF-β y vitamina A, que se cree que desempeñan un papel fundamental en la proliferación epidérmica 2,3,4,5. Además, al tratar a pacientes con enfermedades de la superficie ocular, varios estudios han demostrado algunas ventajas de las gotas oftálmicas AS en los resultados informados por los pacientes, otros parámetros objetivos del ojo seco 6,7 y hallazgos microscópicos como la densidad celular8. Los estudios de metanálisis revelaron que podría haber algunos beneficios en la mejora de los síndromes del paciente con el tratamiento con gotas oftálmicas para la EA, pero aún faltan resultados y observaciones a largo plazo 9,10.

A diferencia de la EA, el plasma rico en plaquetas (PRP) se deriva de la adición de un anticoagulante durante la preparación, con una centrifugación diferencial adicional y la activación química de las plaquetas. En comparación con la EA, numerosos productos químicos y factores de crecimiento, como TGF-β, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y EGF, están presentes en PRP. También se ha aplicado a las enfermedades de la superficie ocular con beneficios clínicos en el alivio de los síntomas11.

El vínculo cruzado entre los defectos epiteliales y la inflamación es complejo. En particular, la inmunofisiopatología es otro tema importante en las enfermedades de la superficie ocular. Se cree que las citoquinas proinflamatorias, como IL-1β e IFN-γ, son mediadores fundamentales en cascadas inflamatorias12. Se abren así nuevas vías de tratamiento basadas en la comprensión del mecanismo inmune. Las estrategias para detener este proceso inflamatorio, incluyendo la producción de antagonistas del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) y otras citoquinas antiinflamatorias, también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades de la superficie ocular13,14,15.

Desde 1998, Orthokine, un suero condicionado autólogo (SCA) comercializado, ha sido utilizado clínicamente en pacientes ortopédicos que sufren de osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR) y trastornos de la columna vertebral13. En comparación con AS y PRP, el tratamiento con perlas de vidrio recubiertas químicamente y la incubación hipóxica para activar monocitos son las características específicas de ACS16. Teóricamente, se pueden secretar más factores antiinflamatorios al agregar estrés de supervivencia a las células, lo que resulta en una mayor concentración de componentes inmunomoduladores esenciales, incluida la IL-1Ra. Los beneficios terapéuticos mejorados del SCA en la OA, en comparación con la EA, también han sido reportados17. Las enfermedades de la superficie ocular comparten antecedentes inmunes similares con las enfermedades inflamatorias ortopédicas en algunos aspectos. Por lo tanto, sobre la base de los resultados exitosos de la terapia derivada de la sangre humana en el campo ortopédico, el SCA podría tener ventajas sobre los tratamientos convencionales en la práctica clínica por sus propiedades epiteliotrópicas e inmunomoduladoras. Aunque el SCA ha sido ampliamente utilizado en enfermedades inflamatorias ortopédicas, sus aplicaciones clínicas en oftalmología aún necesitan ser exploradas, lo que puede verse obstaculizado por su alto costo, falta de apoyo de la literatura y falta de estandarización del proceso de preparación, lo que resulta en un rendimiento diverso.

En este artículo de video, se demostró un método novedoso, rentable y conveniente para generar el ACS modificado (mACS), o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), produciendo una solución de gotas para los ojos con un valor práctico comparable al ACS comercializado. Se mantuvieron las ideas clave de agregar anticoagulantes y activar las células sanguíneas para secretar citoquinas antiinflamatorias mediante incubación estresada, pero a diferencia de los métodos inducidos químicamente, como los basados en perlas de vidrio recubiertas de CrSO4 y kits comerciales, el estado de estrés crítico es inducido físicamente por la incubación hipóxica en este método. Además, se agregó glicerol para proporcionar beneficios adicionales, incluido un aumento en la estabilidad de la membrana de las células sanguíneas, el mantenimiento de una presión adecuada del líquido extracelular osmótico18 y una fuente adecuada de nutrientes en condiciones hipóxicas que evitan el estrés excesivo de las células.

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Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales al inicio de la sección de protocolo. Todos los protocolos y procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Fundación Médica Chang Gung. Todos los voluntarios fueron informados de la naturaleza de este estudio y firmaron un formulario de consentimiento informado antes de su inclusión. Los consumibles necesarios para todo el procedimiento experimental se presentan en la Figura 1 y la Figura 2, así como en la Tabla de materiales.

1. Preparación de los materiales necesarios para producir gotas oftálmicas mACS

  1. Prepare 250 ml de solución de glicerol al 10% y mantenga listo un equipo de infusión de alas de mariposa de 21 G, una jeringa de 3 ml sin la aguja y seis tubos de vacutainer de 10 ml que contengan heparina 158 unidades USP listas (Figura 1).
  2. Conecte la aguja de recolección de sangre de 21 G a la jeringa de 3 ml y extraiga 3 ml de solución de glicerol al 10% en la jeringa preparada.
    NOTA: Todos los materiales deben esterilizarse antes de insertar la aguja.
  3. Distribuir la solución de glicerol al 10% en los tubos de vacutainer en secuencia, con aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada uno (Figura 3A).
    NOTA: Debido a la presión negativa en el tubo de ensayo, la aguja debe salir inmediatamente después de entrar para distribuir uniformemente 3 ml de solución de glicerol a los seis tubos de ensayo.
  4. Esterilice la piel del paciente con hisopos de algodón estériles con alcohol al 75%. Perforar la vena superficial de las extremidades superiores del paciente con la aguja de recolección de sangre de 18 G. Extraiga 60-70 ml de sangre venosa de la vena superficial en total.

2. Preparación para las gotas oftálmicas mACS

  1. Inyectar secuencialmente 10 ml de la sangre venosa extraída en cada uno de los seis tubos vacutainer (Figura 3B).
    NOTA: Este paso se basa en la presión negativa del vacío para llenar los tubos. Para evitar la alteración de las células sanguíneas y la hemólisis, no aplique ninguna presión positiva.
  2. Colocar los seis tubos vacutainer en la incubadora con una temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C).
    NOTA: El estado hipóxico se mantiene y estabiliza por la presión negativa restante en un tubo sellado que recibió glicerol.
  3. Retirar los tubos de la incubadora después de 4 h y centrifugarlos a 3.500 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
  4. En este punto, prepare los materiales para la extracción de mACS, incluidos los frascos de gotas oculares esterilizados, una jeringa de 3 ml con la aguja, un filtro de 0,22 μm, una aguja de 18 G y un par de guantes estériles (Figura 2).
    NOTA: La mesa de operaciones debe limpiarse con alcohol al 75% para garantizar un ambiente aséptico. El sobrenadante, después de la centrifugación, ya es un producto semiacabado de mACS.
  5. Coloque los seis tubos en el bastidor de tubos y abra las tapas después de completar la centrifugación (Figura 3D).
    NOTA: No se requiere esterilidad en este paso.
  6. Póngase guantes estériles y extraiga el mACS uno por uno usando una jeringa de 3 ml con una aguja de 18 G.
    NOTA: Tenga cuidado de no extraer la capa inferior de células sanguíneas durante este paso (Figura 3E).
  7. Extraiga la aguja, conéctela al filtro de 0,22 μm y conecte la aguja de recolección de sangre de 23 G, 1,5 pulgadas con la jeringa original de 3 ml a la salida a continuación (Figura 3F).
  8. Empuje suavemente la aguja a través del filtro de 0,22 μm en los frascos estériles preparados para gotas para los ojos (Figura 3G).
  9. Repita los pasos anteriores hasta que todos los mACS se hayan filtrado y almacenado en frascos de gotas para los ojos (Figura 3H).
  10. Conservar las colirios mACS a 4 °C para su uso inmediato; conservar a -20 °C para su conservación a largo plazo.
    NOTA: No los conserve durante más de 2 semanas a 4 °C o durante más de 3 meses a -20 °C 9,19.

3. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal murino

NOTA: El siguiente modelo animal ex vivo se basó en la experiencia previa de Hung et al. sobre lesiones mecánicas del epitelio corneal20. Los siguientes pasos deben realizarse bajo el microscopio para crear una herida epitelial corneal bien circunscrita y consistente.

  1. Anestesiar a los ratones C57BL/6 con 3% -4% de isoflurano. Aplique el punzón de biopsia de piel sobre la córnea central murina, dejando un círculo poco profundo en el epitelio como un margen uniforme de la herida.
    NOTA: Sea suave para evitar la ruptura del globo ocular.
  2. Debridar el epitelio corneal dentro del área confirmada hasta la capa de Bowman, con un removedor de anillo de óxido corneal equipado con una rebaba de 0,5 mm.
  3. Para establecer el modelo animal ex vivo de la herida corneal mecánica, cosechar el globo ocular y preparar bien el cultivo.
    1. Eutanasia a los ratones primero; Luego, presione suavemente los bordes orbitales superior e inferior de los ratones, introduzca la punta de los fórceps sobre el espacio retrobulbar y saque el globo ocular y sosténgalo por los fórceps.
    2. Cortar el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar perfectamente el globo ocular.
    3. Prepare un plato de 96 pocillos con cera derretida en su interior. Cree rápidamente un orificio redondo usando las puntas de las pinzas y luego espere la solidificación.
  4. Prepare los medios a probar: 0.5% mACS, 0.5% AS para comparación, solución salina normal como control negativo y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
    NOTA: mACS se obtiene utilizando el protocolo mencionado anteriormente.
  5. Para el cultivo ex vivo , coloque el globo ocular cosechado en la placa preparada de 96 pocillos. Agregue 200 μL de cada medio en la placa de 96 pocillos.
  6. Colocar la placa de cultivo de 96 pocillos en la incubadora a 37 °C con un 5% deCO2. Asegúrese de que los medios de cultivo se cambien cada 24 h.
  7. Para confirmar el efecto secuencial de cicatrización de heridas, controle el área de la herida epitelial bajo el microscopio cada 8 h mediante tinción con fluoresceína.
    1. Disuelva la fluoresceína en el papel fluoresceína con solución salina normal.
    2. Deje caer el tinte fluoresceína sobre la córnea central murina, luego obsérvelo y documéntelo bajo un microscopio. Un resultado típico se muestra en la Figura 4.
      NOTA: Una gota (aproximadamente 0,05 ml) de colorante fluoresceína es suficiente para la observación.

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Resultados

La Figura 1 y la Figura 2 muestran los materiales necesarios para el experimento, y la Figura 3 muestra los pasos secuenciales y los productos intermedios exitosos durante la preparación de mACS. Primero, se agregaron 0.5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo estéril de 10 ml (Figura 3A). Luego, se obtuvieron 60-70 mL de sangre venosa del paciente, y se inyectaron 10 mL de sangre en c...

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Discusión

En este estudio, se describe un protocolo para la preparación de mACS y se muestra además el beneficio de las gotas oftálmicas mACS en la cicatrización de heridas de modelos animales. La modificación crucial de este protocolo mACS es la adición de aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo, lo que crea condiciones hipóxicas adecuadas durante la incubación de 4 h a 37 °C. Esta configuración proporciona al AS el estrés adecuado y hace que las células secreten los factores de crecimiento n...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ya-Lan Chien y Chia-Ying Lee por su excelente asistencia técnica, y a la empresa OnLine English por la edición lingüística. Este estudio fue financiado en parte por el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3L1491).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  placa de cultivo de 96 pocillosMerck KGaA, AlemaniaCLS3997
Espéculo de tapa BarraquerkatenaK1-535515 mm
Portaagujas BarraquerKatenaK6-3310sin cerradura 
Punzón de vacío Barron 8.0 mmkatenaK20-2108para cortar papel de filtro
BD 10.0 mL tubos vacutainer que contienen heparina 158 unidades USPBecton,Dickinson and Company, US367880Al menos 6 tubos, necesarios para recolectar sangre para experimentos posteriores y para evitar la aglutinación de sangre
BD 21 G equipo de infusión con alas de mariposaBecton,Dickinson and Company, US367281Para una distribución uniforme de la solución de glicerol
C57BL/6 ratones Centro Nacionalde Animales de Laboratorio RMRC11005para el modelo de ratón
Castroviejo pinzas de 0,12 mmkatena Centrífuga K5-2500
Eppendorf, Alemania58110004283.500 x g durante 10 min
Cheng Yi 10,0 mL frasco gotero esterilizadoCheng Yi Chemical, TaiwánCP405141Debe ser estéril y como contenedor de almacenamiento para el producto final
Removedor de anillos de óxido corneal con rebaba de 0,5 mmAlgerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TXCHI-675para el desbridamiento del epitelio corneal
Medio esencial mínimo modificado de DulbeccoMerck KGaA, AlemaniaD6429
Papel de filtro Toyo Roshi Kaisha, Ltd.1.11
Tiras oftálmicas de fluoresceína sódica U.S.POPTITECHOPTFL100 tinción para el defecto epitelial de la córnea 
IncubadoraFirstek, TaiwánS300S37 ° C para 4 h
Guantes estériles Kanam KanamLatex Industries, IndiaEN455Para funcionamiento aséptico
Merck 0.22 µ m filtroMerck KGaA, AlemaniaPR05359Al menos 2 filtros para la filtración de mACS
Nang Kuang 250 mL solución de glicerol al 10%Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwán19496Para ofrecer un efecto adecuado de estabilización de la membrana y presión osmótica extracelular para las células sanguíneas
Solución salina normalTAIWAN BIOTECH CO., LTD.100-120-1101
Punzón de biopsia de piel 2mmSTIEFEL22650
Microscopio estereoscópicoCarl Zeiss Meditec, Dublín, CAMicroscopioSV11
Terumo Aguja de 18 GTerumo, Taiwán JeringaSMACF0120-18BXde 3,0 mL con aguja de 18 g para extraer el sobrenadante después de la centrifugación
Jeringa Terumo de 20,0 mLTerumo, TaiwánMDSS20ESPodría usarse para recolectar suero después de la centrifugación inicial y usarlo para la centrifugación secundaria.
Jeringa Terumo de 3,0 mL con la aguja de 23 GTerumo, TaiwánMDSS03S2325jeringa de 3,0 mL se utiliza para extraer el sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, conecte el filtro y la aguja de 23 g para inyectar en los frascos de gotas para los ojos.
Tijeras de tenotomía Westcott medianaskatenaK4-3004
para cirugía

Referencias

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