Este artículo describe un protocolo para simplificar el proceso y hacer que la preparación de suero condicionado autólogo (SCA) sea menos costosa. No se necesitan jeringas especiales ni perlas de vidrio recubiertas superficialmente. Además, el SCA modificado (mACS) tiene ventajas competitivas sobre el suero autólogo convencional en la cicatrización de heridas corneales de ojos murinos ex vivo.
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Artículo de método
Producción de suero condicionado autólogo modificado y evaluación ex vivo de su potencial curativo en el epitelio corneal murino
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las terapias tópicas derivadas de la sangre humana han sido una bendición para los médicos en las últimas décadas. El suero autólogo (EA) y el plasma rico en plaquetas (PRP) están enriquecidos en factores de crecimiento epiteliotrópicos que son esenciales en la cicatrización de heridas corneales. A diferencia de AS, PRP se basa en un sistema de centrifugación diferencial, produciendo más factores de crecimiento derivados de plaquetas. El suero autólogo condicionado (SCA) no solo preserva la preparación de AS y PRP, sino que también se centra en las propiedades inmunomoduladoras, que son importantes en las enfermedades inflamatorias.
La falta de protocolos estandarizados y los altos costos de preparación son limitaciones para la aplicación clínica de SCA. Este experimento en video demuestra un procedimiento operativo estándar para preparar gotas oftálmicas modificadas de suero autólogo condicionado (mACS). Primero, se agregó glicerol en jeringas de heparina como estabilizador de células sanguíneas durante la incubación hipóxica. Para activar las células sanguíneas, se inició una incubación de 4 h a 37 °C. Luego, las muestras de sangre se centrifugaron a 3.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm, las gotas oftálmicas mACS se prepararon completamente.
Una prueba tentativa del efecto terapéutico de mACS mostró que puede tener ventajas competitivas sobre la EA convencional en la cicatrización de heridas corneales en ojos de ratón ex vivo . La EA utilizada en este estudio fue preparada de acuerdo con los estudios publicados y la práctica clínica en nuestro hospital. Por lo tanto, la eficacia de mACS en enfermedades de la superficie ocular podría evaluarse en futuras investigaciones a través de estudios in vivo en animales y ensayos clínicos.
Introducción
Los efectos terapéuticos del suero autólogo (EA) en las enfermedades del ojo seco fueron reportados por primera vez en la década de 1980 por Fox et al.1. Se cree que tanto la propiedad lubricante como los componentes bioquímicos epiteliotrópicos esenciales en la EA, imitando las lágrimas naturales, benefician la proliferación de células epiteliales corneales. En las últimas décadas, se han realizado varios estudios sobre esta base. Los componentes tróficos incluyen factor de crecimiento epidérmico (EGF), vitamina A, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y otras citocinas. Curiosamente, el suero es rico en TGF-β y vitamina A, que se cree....
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Protocolo
La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales al inicio de la sección de protocolo. Todos los protocolos y procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Fundación Médica Chang Gung. Todos los voluntarios fueron informados de la naturaleza de este estudio y firmaron un formulario de consentimiento informado antes de su inclusión. Los consumibles necesarios para todo el procedimiento experimental se presentan en la Figura 1 y la Figura 2, así como en la Tabla de material....
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Resultados
La Figura 1 y la Figura 2 muestran los materiales necesarios para el experimento, y la Figura 3 muestra los pasos secuenciales y los productos intermedios exitosos durante la preparación de mACS. Primero, se agregaron 0.5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo estéril de 10 ml (Figura 3A). Luego, se obtuvieron 60-70 mL de sangre venosa del paciente, y se inyectaron 10 mL de sangre en c.......
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Discusión
En este estudio, se describe un protocolo para la preparación de mACS y se muestra además el beneficio de las gotas oftálmicas mACS en la cicatrización de heridas de modelos animales. La modificación crucial de este protocolo mACS es la adición de aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo, lo que crea condiciones hipóxicas adecuadas durante la incubación de 4 h a 37 °C. Esta configuración proporciona al AS el estrés adecuado y hace que las células secreten los factores de crecimiento n.......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Ya-Lan Chien y Chia-Ying Lee por su excelente asistencia técnica, y a la empresa OnLine English por la edición lingüística. Este estudio fue financiado en parte por el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3L1491).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| placa de cultivo de 96 pocillos | Merck KGaA, Alemania | CLS3997 | |
| Espéculo de tapa Barraquer | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Portaagujas Barraquer | Katena | K6-3310 | sin cerradura |
| Punzón de vacío Barron 8.0 mm | katena | K20-2108 | para cortar papel de filtro |
| BD 10.0 mL tubos vacutainer que contienen heparina 158 unidades USP | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | Al menos 6 tubos, necesarios para recolectar sangre para experimentos posteriores y para evitar la aglutinación de sangre |
| BD 21 G equipo de infusión con alas de mariposa | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | Para una distribución uniforme de la solución de glicerol |
| C57BL/6 ratones | Centro Nacional | de Animales de Laboratorio RMRC11005 | para el modelo de ratón |
| Castroviejo pinzas de 0,12 mm | katena | Centrífuga K5-2500 | |
| Eppendorf, Alemania | 5811000428 | 3.500 x g durante 10 min | |
| Cheng Yi 10,0 mL frasco gotero esterilizado | Cheng Yi Chemical, Taiwán | CP405141 | Debe ser estéril y como contenedor de almacenamiento para el producto final |
| Removedor de anillos de óxido corneal con rebaba de 0,5 mm | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | para el desbridamiento del epitelio corneal |
| Medio esencial mínimo modificado de Dulbecco | Merck KGaA, Alemania | D6429 | |
| Papel de filtro | Toyo Roshi Kaisha, Ltd. | 1.11 | |
| Tiras oftálmicas de fluoresceína sódica U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 tinción para el defecto epitelial de la córnea | |
| Incubadora | Firstek, Taiwán | S300S | 37 ° C para 4 h |
| Guantes estériles Kanam Kanam | Latex Industries, India | EN455 | Para funcionamiento aséptico |
| Merck 0.22 µ m filtro | Merck KGaA, Alemania | PR05359 | Al menos 2 filtros para la filtración de mACS |
| Nang Kuang 250 mL solución de glicerol al 10% | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwán | 19496 | Para ofrecer un efecto adecuado de estabilización de la membrana y presión osmótica extracelular para las células sanguíneas |
| Solución salina normal | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Punzón de biopsia de piel 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Microscopio estereoscópico | Carl Zeiss Meditec, Dublín, CA | Microscopio | SV11 |
| Terumo Aguja de 18 G | Terumo, Taiwán Jeringa | SMACF0120-18BX | de 3,0 mL con aguja de 18 g para extraer el sobrenadante después de la centrifugación |
| Jeringa Terumo de 20,0 mL | Terumo, Taiwán | MDSS20ES | Podría usarse para recolectar suero después de la centrifugación inicial y usarlo para la centrifugación secundaria. |
| Jeringa Terumo de 3,0 mL con la aguja de 23 G | Terumo, Taiwán | MDSS03S2325 | jeringa de 3,0 mL se utiliza para extraer el sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, conecte el filtro y la aguja de 23 g para inyectar en los frascos de gotas para los ojos. |
| Tijeras de tenotomía Westcott medianas | katena | K4-3004 |
Referencias
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al.
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Reimpresiones y permisos
