Inducción de estenosis uretral seguida de uretroplastia de injerto de mucosa bucal en un modelo de rata

Summary

En el presente protocolo, se desarrolló una inducción de estenosis uretral en ratas Wistar, seguida de una reconstrucción uretral con un injerto de mucosa bucal. Se realizó un uretrograma retrógrado y una evaluación Doppler láser, validando la reconstrucción uretral (después de la formación de estenosis) y la colocación del injerto.

Abstract

La reconstrucción uretral es un área importante de especialización para los urólogos. La mucosa bucal se considera la mejor opción cuando es necesario un injerto uretral, aunque en algunos casos es inadecuado o necesita ser optimizado para reparar una estenosis determinada. Por lo tanto, el desarrollo de procedimientos innovadores y la evaluación de su supuesto éxito en modelos experimentales es crucial para adaptarse a la necesidad clínica. Con este objetivo, este estudio describe un protocolo en el que la estenosis uretral fue inducida por electrocauterización en ratas Wistar. La reconstrucción uretral se realizó 1 semana después con un injerto de mucosa bucal, extraído del labio inferior, y colocado en forma de incrustación ventral. Un uretrograma retrógrado mostró una mejoría significativa en el diámetro uretral después de la uretroplastia en comparación con el valor respectivo después de la inducción de estenosis. Además, la colocación del injerto se evaluó mediante análisis de perfusión sanguínea mediante láser Doppler. Como era de esperar, un área azul oscuro correspondió al injerto de mucosa bucal no vascularizada. Este procedimiento puede simular con éxito el proceso fisiopatológico normal de la lesión uretral y la modulación tisular, así como la reconstrucción uretral mediante un injerto de mucosa bucal de forma reproducible, y servir de base para futuras investigaciones basadas en ingeniería tisular o injertos uretrales.

Introduction

La reconstrucción uretral es un reto importante para los cirujanos urológicos en el manejo de la lesión uretral en el contexto de estenosis, traumatismos o defectos congénitos¹. Con intención curativa, la uretroplastia es el tratamiento de elección para la mayoría de los pacientes, con defectos uretrales largos (>2 cm) y anteriores que requieren algún tipo de uretroplastia de sustitución². Muchos tejidos se han utilizado como sustitutos uretrales, incluidos los injertos de piel de espesor completo o dividido de áreas genitales o extragenitales, la mucosa de la pared de la vejiga o la mucosa bucal generalizada². Los injertos de mucosa bucal tienen varias ventajas, como provenir de un ambiente húmedo y sin pelo, ser fáciles de cosechar, ser resistentes a las infecciones, un epitelio grueso, una probabilidad reducida de formación de pseudodivertículos y una lámina delgada, lo que permite la imbibición e inosculación tempranas³. A diferencia de los colgajos, los injertos no tienen riego sanguíneo, dependiendo del lecho vascular del receptor para sobrevivir⁴.

Los modelos animales de injertos o colgajos se han utilizado ampliamente para desarrollar o refinar técnicas quirúrgicas, estudiar y comprender la fisiología de los tejidos, los mecanismos subyacentes y las causas del fracaso, y evaluar estrategias de tratamiento innovadoras ^5,6. Aunque los animales más grandes facilitan la ejecución técnica, los roedores, es decir, las ratas y los ratones, son más fáciles de manejar y mantener, resistentes a las enfermedades, más rentables y, lo que es más importante, cuentan con las herramientas para investigar los mecanismos moleculares, cruciales para probar terapias innovadoras ^5,6. Se han descrito varios modelos de colgajos e injertos en ratas utilizando diferentes tejidos, a saber, piel, hueso, músculo⁶, vasos⁵ e incluso órganos sólidos⁷. Sin embargo, hay escasa investigación en modelos murinos sobre injertos para reconstrucción uretral o ingeniería de tejidos.

Sin embargo, los avances en la ciencia traslacional dependen de modelos animales que imitan la enfermedad. Hasta el momento, no se ha abordado el ambiente fisiopatológico local, ya que la reconstrucción uretral se realiza inmediatamente después de su estenosis. El objetivo de este estudio es realizar una reconstrucción uretral mediante un injerto de mucosa bucal en un ambiente fisiopatológico local. Con este objetivo, se indujo la estenosis uretral 1 semana antes de su reconstrucción. Este modelo experimental, realizado en ratas, permite probar terapias innovadoras e investigar sus mecanismos moleculares y ventajas clínicas en el futuro.

Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE. Los procedimientos fueron aprobados por el Organismo de Bienestar Animal institucional, autorizado por DGAV, la autoridad portuguesa competente para la protección animal (número de licencia 0421/000/000/2021). Para el presente estudio se utilizaron ratas Wistar Han IGS macho (Crl:WI(Han) (400-500 g) a las 12-14 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de soluciones

1. Solución anestésica
   1. Llene una jeringa de 3 ml con 2,3 ml de medetomidina (1 mg/ml; 0,715 mg/kg de peso corporal) y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Llene una jeringa de 3 ml con 1,55 ml de fentanilo (0,05 mg/ml; 0,02 mg/kg de peso corporal) y transfiérala al mismo tubo de centrífuga de 15 ml.
   3. Llene una jeringa de 10 ml con 6,15 ml de midazolam (5 mg/ml; 9,5 mg/kg de peso corporal) y transfiérala al mismo tubo de centrífuga de 15 ml, haciendo así una solución anestésica de 10 ml.
   4. Etiquete el tubo y guárdelo a 4 °C en la oscuridad.
      NOTA: Esta combinación de anestésicos (medetomidina, fentanilo y midazolam) proporciona una ventana quirúrgica anestésica de hasta 3 horas. La administración de atipamezol y flumazenil puede revertir el efecto.
2. Solución antisedante
   1. Llene una jeringa de 1 ml con 0,7 ml de atipamezol (5 mg/ml; 3,72 mg/kg de peso corporal) y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Llene una jeringa de 10 ml con 9,3 ml de flumazenil (0,1 mg/ml; 1,56 mg/kg de peso corporal) y transfiérala al mismo tubo de centrífuga de 15 ml, haciendo así una solución antisedante de 10 ml.
   3. Etiquete el tubo y guárdelo a 4 °C en la oscuridad.
3. Soluciones de analgesia postoperatoria
   1. Llene una jeringa de 1 ml con 0,5 ml de carprofeno (50 mg/ml; 5 mg/kg de peso corporal) y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Añadir 9,5 mL de solución de NaCl (0,9%), obteniendo una solución de carprofeno de 10 mL.
   3. Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de buprenorfina (0,3 mg/ml; 0,01-0,05 mg/kg de peso corporal) y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   4. Añadir 9 mL de solución de NaCl (0,9%), obteniendo una solución de buprenorfina de 10 mL.
   5. Etiquete los tubos y guárdelos a 4 °C en la oscuridad.
4. Antibiótico perioperatorio
   1. Llene una jeringa de 2,5 ml con 2,5 ml de enrofloxacino (25 mg/ml; 10 mg/kg de peso corporal) y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Añadir 7,5 mL de solución de NaCl (0,9%), obteniendo una solución de enrofloxacino de 10 mL.
   3. Etiquete el tubo y guárdelo a 4 °C en la oscuridad.
      NOTA: Los detalles de todos los reactivos para preparar las soluciones anteriores se enumeran en la Tabla de Materiales.

2. Inducción quirúrgica de estenosis uretral

NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se realizaron con un microscopio estereoscópico (10x) (ver Tabla de Materiales).

1. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas antes de usarlas: hoja de bisturí (número 11), pinzas puntiagudas, tijeras de resorte, pinzas quirúrgicas, portaagujas oftálmicas, tijeras quirúrgicas y un portaagujas. Use bolas de algodón estériles para limpiar el campo quirúrgico.
2. Cargue la jeringa con la solución anestésica antes de sostener a la rata.
3. Sujete al animal con un tubo o una toalla y eleve la cola para exponer el abdomen.
4. Mantener al animal inmovilizado y realizar una inyección intraperitoneal de la solución anestésica (preparada en el paso 1.1).
5. Pruebe los reflejos de retirada del pedal de la rata para evaluar la anestesia.
6. Aplique gel protector para los ojos en ambos ojos del animal. Realizar una inyección subcutánea de la solución antibiótica (preparada en el paso 1.1), a 10 mg/kg de peso corporal.
7. Coloque a la rata en la posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla térmica y use un microscopio de disección con un aumento de 10x o 20x para realizar el procedimiento quirúrgico.
8. Limpie el pene y la piel abdominal circundante con povidona yodada (100 mg/ml).
9. Retraiga manualmente el prepucio y coloque una sutura de soporte superficial (sutura 7.0; ver Tabla de Materiales) en la cara dorsal del glande del pene para aplicar tracción al pene, dejando el soporte de la aguja en su lugar para mantener el pene retraído.
10. Coloque un catéter venoso de 22 G en la uretra para su cateterismo con un gel lubricante.
11. Con una hoja de bisturí quirúrgico (número 11), realice una incisión ventral longitudinal de 1 cm en la piel del pene.
12. Con las pinzas puntiagudas y las tijeras de resorte, diseccione las capas de tejido del pene hasta exponer la uretra a nivel de la diáfisis media.
13. Con un dispositivo de electrocauterización (ver Tabla de Materiales), aplique una corriente de 10 W, durante 1 s, en los aspectos laterales de la uretra (en un lugar a cada lado), ventralmente a nivel del eje medio del pene.
14. Cierre la incisión con una sutura corrida absorbible 6.0 (ver Tabla de Materiales).
15. Retire el catéter uretral. Retire la sutura de tracción del pene.
16. Realizar la inyección subcutánea de analgesia: Carprofeno a 5 mg/kg de peso corporal, y buprenorfina a 0,03 mg/kg de peso corporal.
17. Cargue la jeringa con la solución antisedante (preparada en el paso 1.2) y, con el animal en decúbito ventral, coloque la piel suelta para administrar una inyección subcutánea de la solución antisedante.

3. Procedimiento quirúrgico de uretroplastia con injerto de mucosa bucal

NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se realizaron con un microscopio estereoscópico (10x) (ver Tabla de Materiales).

1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos necesarios para esta intervención: pinzas puntiagudas, tijeras de resorte, portaagujas oftálmico, tijeras quirúrgicas, porta agujas, tres pinzas para mosquitos y una hoja de bisturí (número 11). Use esponjas pequeñas para limpiar el campo quirúrgico.
2. Administrar el anestésico, el antibiótico, la inmovilización y colocar al animal como se ha descrito anteriormente (pasos 2.2-2.8).
3. Limpie la mucosa bucal del labio inferior, el pene y la piel abdominal circundante con povidona yodada (100 mg/ml).
4. Colocar tres suturas de estancia (7.0 suturas) en el labio inferior, a ambos lados y en el medio, y dejar un mosquito en cada una para retraer el labio inferior y exponer la mucosa interna.
5. Con unas tijeras elásticas y unas pinzas puntiagudas, extraer un injerto de 4 mm de diámetro de la mucosa bucal interna del labio inferior y colocarlo en un recipiente pequeño con solución salina estéril (NaCl al 0,9%).
6. Aplicar compresión en la zona donante con una esponja para hemostasia.
7. Retire las suturas de estancia del labio inferior colocadas anteriormente.
8. Exponga el pene como se describió anteriormente (paso 2.9).
9. Coloque un catéter venoso de 22 G en la uretra para su cateterismo con un gel lubricante.
10. Con unas tijeras de resorte, realice una incisión circunferencial subcoronal y enguanta el pene hasta la base.
11. Con las pinzas puntiagudas y las tijeras de resorte, disecciona las capas restantes y expone la uretra.
12. Utilizando una hoja de bisturí quirúrgico (número 11) y unas tijeras de resorte, realizar una incisión ventral longitudinal, comenzando 3 mm distal al surco coronal en una extensión de 4 mm, espatulando la uretra a nivel de la estenosis previamente inducida (paso 2).
13. Colocar dos suturas de tirante de material 7.0, una a cada lado de la espatulación, y dejar un mosquito en cada una para retraer la uretra.
14. Colocar dos suturas 7.0 no absorbibles, una en cada extremo de la espatulación.
15. Coloque el injerto de mucosa bucal en forma de incrustación ventral con el lado de la mucosa mirando hacia la luz uretral.
16. Pasar una de las suturas por el extremo del injerto y realizar una media elipse con una sutura corrida.
17. Repita los pasos 3.15 y 3.16 con la otra sutura en el otro lado del injerto.
18. Retire el catéter uretral. Vuelva a colocar la piel del pene.
19. Cierre la incisión circunferencial subcoronal con una sutura interrumpida absorbible 6.0.
20. Retire la sutura de tracción del pene.
21. Administrar la analgesia seguida de la solución antisedante, como se describe en los pasos 2.16-2.17.

4. Seguimiento postoperatorio

1. Observe a las ratas de tres a cuatro veces cada hora, confirmando su recuperación de la anestesia. Controle la respiración y evalúe los reflejos pedales y oculares.
2. Inyectar analgesia por vía subcutánea cada 12 h durante 48 h.
   NOTA: El carprofeno se administró a 1 mL/500 mg de peso corporal, y la buprenorfina a 0,5 mL/500 mg de peso corporal (ver Tabla de Materiales).
3. Proporcionar alimentos blandos durante 48 h después de cada procedimiento y agua ad libitum.
4. Monitoree a las ratas diariamente después de la cirugía y registre su estado de salud y la apariencia del sitio de la cirugía. Los signos evaluados incluyen la expresión facial, la vocalización, el estado de actividad, cualquier signo de dolor, la ingestión de alimentos y bebidas, la micción y el sangrado.

5. Evaluación de la perfusión sanguínea

NOTA: El flujo sanguíneo se mide inmediatamente antes de la inducción de la estenosis, inmediatamente antes de la uretroplastia e inmediatamente después de la uretroplastia.

1. Realizar imágenes de perfusión Doppler con láser.
   1. Anestesiar a las ratas con la solución anestésica (paso 1.1).
   2. Coloque a la rata en decúbito supino sobre una almohadilla térmica a 37 °C con tracción del pene, como se describe en el paso 2.9.
   3. Ponga en marcha el generador de imágenes de perfusión láser Doppler (ver Tabla de Materiales) para obtener datos. Preestablezca el área de interés que leerá el rayo láser.
   4. Aplique la solución antisedante (paso 1.2) para revertir la anestesia.
   5. Con el software de análisis de imágenes, dibuje la región de interés (ROI) alrededor del área del pene y registre los valores de flujo a lo largo del tiempo.

6. Evaluación radiográfica

NOTA: La confirmación de la inducción de la estenosis y la resolución de la estenosis después de la uretroplastia se confirman con un uretrograma retrógrado. Esta evaluación se realiza 1 semana después de la inducción de la estenosis (antes de la uretroplastia) y 2 semanas después de la uretroplastia.

1. Realizar una uretrograma retrógrada utilizando un sistema de angiografía monoplana (ver Tabla de Materiales).
   1. Anestesiar a las ratas con la solución anestésica.
   2. Coloque al animal en el colchón de angiografía en un decúbito oblicuo derecho, con tracción del pene, como se describe en el paso 2.9.
   3. Enfoca el haz cónico en el área pélvica del animal, incluido el pene.
   4. Colocar un catéter venoso de 22 G avanzado 2 mm en la uretra distal.
   5. Comience a instilar 1 mL de material de contraste radiográfico de yodo (proporción 1:1 de solución de yopromida de 623 mg/ml y NaCl al 0,9%) en la uretra.
   6. Simultáneamente, realizar radiografía simple para identificar el contraste radiográfico que completa la luz uretral y evaluar el diámetro uretral.
   7. Al finalizar la toma de imágenes, revierta la anestesia con la solución antisedante.

7. Eutanasia

NOTA: La eutanasia se realiza 3 semanas después de la uretroplastia (4 semanas después de la inducción de la estenosis), inmediatamente después de la última evaluación de perfusión.

1. Llene una jeringa de 2,5 ml con 2 ml/kg de pentobarbital sódico (400 mg/ml).
2. Realizar una inyección intraperitoneal de la solución para la eutanasia del animal.

Representative Results

Un total de 12 ratas Wistar macho, con un peso de 400-500 g y 12-14 semanas de edad, se utilizaron para la inducción de la estenosis uretral. Se realizó un uretrograma retrógrado (RUG1) 1 semana después⁸, confirmando el éxito de la técnica. El diámetro uretral se midió en milímetros a nivel de la inducción de la estenosis. Tras esto, se realizó una uretroplastia con un injerto de mucosa bucal en la cara ventral de la uretra de rata. Las mismas ratas fueron sometidas a un segundo uretrograma retrógrado (RUG2) 14 días después de la uretroplastia, y el diámetro uretral se midió en milímetros a nivel de la colocación del injerto. Los diámetros medios de RUG1 y RUG2 fueron de 1,04 mm y 1,52 mm, respectivamente, mostrando una mejoría significativa (p < 0,0001) en la permeabilidad uretral (Figura 1), confirmando así el éxito de la intervención quirúrgica y la buena consistencia entre las mediciones.

También se evaluó la perfusión local mediante láser Doppler inmediatamente antes y después de la uretroplastia como método no invasivo para monitorizar el ambiente microcirculatorio tisular. La perfusión tisular se muestra en imágenes codificadas por colores, donde la perfusión baja o nula es de color azul oscuro y los niveles de perfusión más altos son de color rojo. Los valores medios de flujo se obtienen utilizando el software de procesamiento de imágenes Moor LDI V5.3 (ver Tabla de Materiales).

Teniendo en cuenta la variabilidad de la población de ratas, se utilizaron 35 ratas Wistar macho. El flujo sanguíneo medio antes e inmediatamente después de la uretroplastia fue de 603,4 y 137,6 unidades arbitrarias (U.A.), respectivamente. Como era de esperar, el área que muestra una reducción significativa (p < 0,0001) en el flujo sanguíneo local (en azul) corresponde al injerto no vascularizado (Figura 2).

Se encontró buena tolerancia al procedimiento anestésico en todos los animales estudiados; Sin embargo, resultados previos obtenidos en el laboratorio (datos no mostrados) revelaron que el tiempo de anestesia podría ser crítico para permitir la recuperación total del animal, preferentemente no superior a 45 min. En el postoperatorio, las ratas también estaban libres de complicaciones importantes.

Figura 1: Análisis de uretrograma retrógrado (RUG). (A) Imágenes representativas de un uretrograma retrógrado antes (RUG1) y 14 días después de la uretroplastia (RUG2). (B) La evaluación cuantitativa del diámetro expresado en milímetros demostró una mejora significativa 14 días después de la uretroplastia. Abreviaturas: RUG1 = Uretrograma retrógrado antes de la uretroplastia; RUG2 = Uretrograma retrógrado 14 días después de la uretroplastia. Los cambios entre los grupos se evaluaron mediante una prueba t pareada de dos colas (n = 12). Barra de escala: 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis Doppler láser. (A) Imágenes representativas del flujo Doppler láser antes e inmediatamente después de la uretroplastia. (B) La evaluación cuantitativa del flujo sanguíneo demostró una disminución significativa de la perfusión sanguínea después de la uretroplastia. Los cambios entre los grupos se evaluaron mediante una prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejado de dos colas (n = 35). Barra de escala: 0,5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La uretroplastia con injertos de mucosa bucal es una piedra angular importante en la reconstrucción uretral. Sin embargo, se deben desarrollar procedimientos innovadores para optimizar los ya descritos y establecer otros nuevos, como los materiales de ingeniería tisular y los injertos biológicos, para reducir las complicaciones y la morbilidad. Se han publicado varios procedimientos para establecer modelos preclínicos y definir técnicas quirúrgicas. Souza et ^al.1 realizaron un estudio que incluyó a 12 conejos neozelandeses. Se realizó una incisión cutánea longitudinal ventral y se movilizó la uretra desde la túnica albugínea, seguida de la extirpación de un segmento dorsal de la uretra, creando un defecto. Simultáneamente, se extrajo un injerto de mucosa bucal de la mejilla y se colocó como incrustación dorsal con una sutura reabsorbible 7-0. En el presente estudio, se utilizaron ratas Wistar macho. Debido a su menor tamaño, son técnicamente más exigentes, aunque más fáciles de manejar. Para imitar la fisiopatología de las estenosis uretrales y la fisiología del injerto se necesita, en este modelo, previamente se indujo una enfermedad similar a la estenosis uretral, en lugar de un defecto uretral realizado al mismo tiempo quirúrgico que la uretroplastia. Al igual que Souza et al., también se utilizaron suturas corridas para cerrar la uretra con el injerto¹. Sin embargo, se utilizó la sutura no reabsorbible porque permite la identificación de la circunferencia del injerto en estudios posteriores, como los histológicos. Martín-Cano et ^al.9 desarrollaron un modelo utilizando ratas Wistar. Se realizó una incisión circunferencial subcoronal, seguida de degloving peneano, lo que permitió una buena exposición uretral. El injerto se extrajo del labio inferior, la uretra se abrió a través de una incisión longitudinal en la línea media ventral y el injerto se colocó en forma de incrustación ventral con suturas continuas no absorbibles. Durante el procedimiento, se colocó un catéter uretral para mantener la uretra permeable. Esta técnica descrita en este trabajo utiliza el mismo enfoque de degloving peneano, que permite una buena exposición de la uretra y la colocación de un catéter para mantener la uretra permeable durante el procedimiento. Sin embargo, Martín-Cano et al. no realizaron ninguna lesión uretral previa en el procedimiento, lo que podría haber influido en la toma natural del injerto, ya que los tejidos estaban más sanos.

De hecho, la lesión uretral simple y la cicatrización han sido evaluadas por otros, como Hofer et ^al.10, quienes desarrollaron un modelo de rata con ratas Wistar que consistía en una incisión circunferencial subcoronal, degloving del pene y una incisión longitudinal de la línea media ventral para lesionar la uretra, seguida de un cierre con una sutura corrida. La conclusión fue que, en fases de inflamación, proliferación, maduración y remodelación análogas a la cicatrización dérmica, se produce la cicatrización de la uretra. Esto no se limita al sitio de la lesión, sino que también se aplica a la gran mayoría del tejido periuretral y al cuerpo esponjoso. Tavucku et ^al.11también describieron un modelo de lesión uretral con ratas Sprague-Dawley, realizando una incisión cutánea de la línea media ventral penoescrotal para exponer la uretra y luego aplicando corriente de electrocauterización para inducir lesión uretral. Sus datos mostraron un aumento de la proporción de colágeno tipo I a colágeno tipo III, un fuerte indicador de fibrosis. Siguiendo este razonamiento, un tejido lesionado tiene más fibrosis que uno sano, y se espera que las tomas de injerto no sean iguales en ambos tejidos. Suponiendo que las uretroplastias se realizan en tejidos lesionados, una de las principales ventajas de este modelo es que imita mejor el proceso fisiopatológico normal. Otra gran ventaja es la realización de un uretrograma retrógrado para confirmar la inducción de estenosis y posteriormente confirmar el éxito de la uretroplastia en función del diámetro uretral. De hecho, todos los animales tuvieron un diámetro uretral mejorado después de la uretroplastia, lo que demuestra el éxito del procedimiento. Souza et ^al.1también realizaron uretrograma retrógrado, pero solo al final del estudio. En este estudio y en Tavukcu et ^al.11, se realizaron ambos uretrogramas, concluyendo la efectividad del procedimiento mediante el análisis de uretrograma. Además, se realizó una evaluación de perfusión, antes y después de la uretroplastia, que confirmó un área total no vascularizada (azul) correspondiente al injerto de mucosa bucal.

Sin embargo, existen varias limitaciones relacionadas con este procedimiento, como el tamaño de la uretra de las ratas, lo que resulta en una técnica quirúrgica exigente, la duración de la cirugía y la ausencia de anestesia volátil. Sin embargo, es importante tener en cuenta que, aunque los animales más grandes facilitan la ejecución técnica, hay menos herramientas moleculares disponibles en comparación con los roedores, lo que puede ser una limitación para investigar los mecanismos moleculares detrás de las terapias innovadoras. Otra limitación es el uso de un solo método para inducir estenosis uretral, que puede deberse a muchas otras causas, como traumatismos, infecciones o defectos congénitos, que pueden dar lugar a diferentes fenotipos fisiopatológicos. Sin embargo, se utilizó la electrocauterización ya que permite un abordaje simple, fácil y reproducible con resultados consistentes.

Hasta donde sabemos, este es el primer procedimiento en ratas que: (1) imita un entorno fisiopatológico local previo al injerto mediante la inducción de una estenosis uretral 1 semana antes de la colocación del injerto de mucosa bucal; (2) confirma la estenosis uretral y su resolución mediante uretrograma retrógrado; (3) confirma la ubicación del injerto mediante láser Doppler; y (4) permite un modelo experimental para optimizar el uso de injertos y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas basadas, por ejemplo, en materiales de ingeniería tisular, en los que se podrían investigar mecanismos moleculares, con un impacto en la ciencia traslacional para adaptarse a la necesidad clínica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole	OrionPharma		ANTISEDAN (atipamezole) is indicated for the reversal of the sedative and analgesic effects.
Buprenorphine	RichterPharma		Buprenorphine is a derivative of the opioid alkaloid thebaine that is a more potent (25-40 times) and longer lasting analgesic than morphine.
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Stereo Microscope	Carl Zeiss Microscopy, Germany		OPMI 1 FC from ZEISS symbolizes quality, precision and reliability. The manual system is easy to use and delivers high fidelity images with the legendary ZEISS optics.
Carprofen	Zoetis		Carprofen is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) of the propionic acid class.
Catheter 22 G. x 1''	B Braun	Introcan Safety	IV Catheter of fluorinated ethylene propylene (FEP) with firmer construction for arterial access.
Enrofloxacin	Bayer		Enrofloxacin is a fluoroquinolone antibiotic.
Fentanyl	Braun	3644960	Fentanyl is a powerful synthetic opioid analgesic.
Flumazenil	Fresenius Kabi		Benzodiazepine antagonist is used for the complete or partial reversal of the sedative effects caused by benzodiazepines.
High temperature cautery	Fiab	F7244	Disposable cautery, sterile, high temperature (1200 °C), 28 mm fine tip.
Instillagel gel	Farco-pharma		Cellulose-based lubricant with local anaesthetic and disinfecting properties.
Iopromide	Bayer		Non-ionic injectable contrast medium, with iodine.
Laser Doppler imaging system (perfusion imager moorLDI2-HIR and dedicated software)	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK	5710	The angiogenesis models uses Laser Doppler imaging to assess blood perfusion in the hind limbs, one of which is ligated surgically. Dedicated measurement and comparison software allows the definition of regions of interest for blood flow assessment on the ischaemic versus non-ischaemic limb to establish a "reperfusion ratio" which can be assessed as often as needed and over a number of days on the same subject.
Lubrithal Eye Gel	Dechra		Eye gel used in animals for prevention of dry eyes during anaesthesia. Lubricating and moisturising action on cornea and conjunctiva.
Male Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) rats	Charles River Laboratories, Spain		Twelve to fourteen-week-old
Metedomidin	Virbac	037/01/07RFVPT	Medetomidine is a synthetic drug used as surgical anesthetic.
Midazolam	Labesfal		Benzodiazepine medication is used for anesthesia and procedural sedation.
Monoplan Angiography System	Philips Medical Systems	Azurion 7 M20	A stationary diagnostic fluoroscopic x-ray system specifically designed to optimize the capability of users to visually and quantitatively evaluate the anatomy and function of blood vessels of the heart, brain and other organs, as well as the lymphatic system.
Mosquito forceps	Henry Schein	102-4346	Hartman-Mosquito Hemostatic Forcep Curved 3-1/2" Stainless Steel
Needle Holder	Henry Schein	100-2570	Needle holder Mayo-Hegar, stainless steel, 14 cm
Ophtalmic Needle Holder	Asico	AE-6143	Needle holder barranquer most delicate without lock
Pentobarbital Sodium	Ecuphar		Pentobarbital Sodium is the sodium salt of pentobarbital used for euthanasia.
Pointed Forceps	Aesculap	BD335R	Microforceps, 0.30 mm tip
Polysorb 6.0	Medtronic (Covidien)	UL-101	Coated Synthetic Absorbable Suture aimed to reduce the inflammatory reaction in tissues, followed by gradual encapsulation of the suture by fibrous connective tissue.
Providone-Iodine	Mylan		Povidone-iodine 10% is an antiseptic drug, used as a disinfectant before and after surgery.
Scalpel Blade nº11	B Braun	BB511	Carbon steel, sterile
Spring Scissor	Henry Schein	600-4826	Surgical scissors 31 castroviejo
Surgical Forceps	Aesculap	BD33R	Microforceps, 0.20mm tip
Surgical Scissor	Aesculap	MA873R	Micro Iris Scissor, curved shrap tips
SurgiPro 7.0	Medtronic (Coviden)	VP-702-X	Non-Absorbable Monofilament Polypropylene Suture indicated for use in general soft tissue ligation.