Summary
Denne protokol beskriver mikroinjektion og in vivo-elektroporation til regionalt begrænset CRISPR-medieret genomredigering i museovidukten.
Abstract
Germline genetisk manipulerede musemodeller (G-GEMM'er) har givet værdifuld indsigt i in vivo genfunktion i udvikling, homeostase og sygdom. Imidlertid er tiden og omkostningerne forbundet med kolonioprettelse og vedligeholdelse høje. Nylige fremskridt inden for CRISPR-medieret genomredigering har gjort det muligt at generere somatiske GEMM'er (S-GEMM'er) ved direkte at målrette mod cellen / vævet / organet af interesse.
Ovidukten eller æggelederen hos mennesker betragtes som oprindelsesvævet for den mest almindelige kræft i æggestokkene, højkvalitets serøse ovariekarcinomer (HGSC'er). HGSC'er initierer i æggelederens område distalt til livmoderen, der ligger ved siden af æggestokken, men ikke det proksimale æggeleder. Imidlertid er traditionelle musemodeller af HGSC målrettet mod hele ovidukten og rekapitulerer således ikke den menneskelige tilstand. Vi præsenterer en metode til mikroinjektion af DNA-, RNA- eller ribonukleoprotein (RNP) opløsning i oviduktlumen og in vivo-elektroporation for at målrette slimhindepitelceller i begrænsede områder langs ovidukten. Der er flere fordele ved denne metode til kræftmodellering, såsom 1) høj tilpasningsevne i målretning af området / væv / organ og elektroporationsområdet, 2) høj fleksibilitet i målrettede celletyper (cellulær plians), når de anvendes i kombination med specifikke promotorer til Cas9-ekspression, 3) høj fleksibilitet i antallet af elektroporerede celler (relativt lav frekvens), 4) der kræves ingen specifik muselinje (immunkompetent sygdomsmodellering), 5) høj fleksibilitet i genmutationskombination og 6) mulighed for at spore elektroporerede celler, når de anvendes i kombination med en Cre-reporterlinje. Således rekapitulerer denne omkostningseffektive metode human kræftinitiering.
Introduction
Æggelederen, kaldet ovidukten hos mus, er en rørformet struktur, der forbinder livmoderen med æggestokken. Det spiller en væsentlig rolle i pattedyrs reproduktion og giver miljøet til intern befrugtning og præimplantationsudvikling 1,2. På trods af dets betydning er der lidt kendt om dets funktion og homeostase, dels på grund af udviklingen af in vitro-befrugtningsteknikker, der omgår ethvert infertilitetsproblem relateret til dette organ3. Det er imidlertid blevet anerkendt, at precancerøse læsioner af højkvalitets serøst ovariekarcinom (HGSC), en aggressiv histotype af kræft i æggestokkene, der tegner sig for omkring 75% af ovariekarcinomer og 85% af relaterede dødsfald4, er begrænset til det distale æggelederepitel 5,6,7,8 . Dette indikerer, at ikke alle celler i vores krop er lige modtagelige for onkogene fornærmelser, men snarere kun unikke / modtagelige celler i hvert væv / organ bliver oprindelsescellen i kræft - kaldet cellulær pliancy9. På denne måde har det vist sig, at epitelcellerne i det distale æggeleder, der ligger ved siden af æggestokken, adskiller sig fra resten af røret10,11. Således rekapitulerer traditionelle musemodeller af HGSC, der er målrettet mod alle celler i ovidukten, ikke den menneskelige tilstand. I en nylig undersøgelse brugte vi en kombination af CRISPR-medieret genomredigering, in vivo oviduktelektroporation og Cre-baseret afstamningssporing til succesfuldt at inducere HGSC ved at mutere fire tumorsuppressorgener i den distale museovidukt12,13. Dette manuskript præsenterer en trin-for-trin protokol, der beskriver denne procedure for mikroinjektion og in vivo elektroporation for at målrette museoviduktens slimhindepitel.
Denne metode har flere fordele. Det kan tilpasses til at målrette mod andre væv / organer, herunder organparenkym14. Selvom andre in vivo-genleveringsmetoder som lentivirale og adenovirale systemer kan bruges til at opnå lignende vævs- / organspecifik målretning, justeres målretningsområdet lettere ved hjælp af forskellige størrelser pincetelektroder til elektroporationsbaseret levering. Afhængigt af koncentrationen af DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP'er), elektroporationsparametre og elektrodernes størrelse kan antallet af elektroporerede celler ændres. Desuden kan specifikke celletyper målrettes, når de anvendes i kombination med promotorer til Cas9-ekspression uden det absolutte behov for Germline genetisk manipulerede musemodeller (G-GEMM'er). Derudover tillader elektroporation i modsætning til virale leveringssystemer multipel plasmidlevering i enkeltceller og mindre begrænsning i insert-DNA-størrelsen15. In vivo-screening af genmutationer kan også udføres relativt let på grund af denne høje fleksibilitet. Endvidere kan elektroporerede celler spores eller spores, når denne metode anvendes i kombination med Cre-reporterlinjer såsom Tdtomato eller Confetti16,17.
Protocol
Dyrene blev anbragt i statiske mikroisolationsbure med filtertoppe, der var placeret i et dedikeret rum, der indeholdt et biosikkerhedsskab af type II. Alt dyrearbejde blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og blev godkendt af McGill University's Faculty of Medicine and Health Sciences Animal Care Committee (AUP #7843).
1. Forberedelse af mikroinjektionsnål
- Træk et glaskapillarrør ind i et skarpt punkt ved hjælp af en mikropipettetrækker med følgende program: P = 500, Varme = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.
- Brug en konisk ultrafin spidstang til at klippe den spidse ende af det udtrukne kapillarrør under et dissekerende mikroskop for at skabe en åbning, som vist i figur 1A, B. Sørg for, at åbningen ikke er for stor, da dette vil beskadige ovidukten og forhindre langsom injektion.
Figur 1: Forberedelse af mikroinjektionsnål. (A,B) Trukket kapillarrør med en spids ende (A), der blev skåret for at skabe en åbning (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forberedelse af bedøvelsesmidlet til intraperitoneal injektion
- Forbered filtreret, fortyndet avertin på operationsdagen. Stamopløsning af Avertin (2,2,2-tribromethanol) fremstilles i en koncentration på 1,6 g/ml i tert-amylalkohol under kraftig omrøring og opbevares mørkt.
- Avertinstamopløsningen fortyndes med 1,25 % v/v isotonisk saltvand til en slutkoncentration på 20 mg/ml inde i en stinkhætte. Vortex det fortyndede avertin og filtrer gennem et 0,22 μm sterilt filter. Opbevares i mørke.
3. Klargøring af operationsområdet
- Operationsområdet skal være et dedikeret sterilt miljø, helst en ren bænk eller et biosikkerhedsskab. Arranger sterilt kirurgisk udstyr, mikroskop, mikromanipulator og elektroporator efter behov. Et eksempel herpå er vist i figur 2.
- Varm varmepuden op, og placer den under et rent, fuldt udstyret bur. Dette bur vil blive brugt til at huse musene efter operationen.
- Hæld sterilt 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i en steril petriskål. Brug en ren saks til at skære absorberende papir i firkanter med omtrentlige dimensioner på 1 cm x 1 cm. Slip disse stykker absorberende papir i 1x PBS for at lægge dem i blød.
4. Klargøring af injektionsvæsken og kanylen
- Forbered injektionsopløsningen på operationsdagen. DNA/RNA/RNP'erne blandes med filtreret trypanblåt til en slutkoncentration på mindst 200 ng/μL hver og 5 %. Opbevares ved stuetemperatur før injektion.
BEMÆRK: Brug en 1 ml sprøjte til at optage 100% trypanblå og filtrer gennem et 0,22 μm sterilt filter før brug. - Fastgør den trukne kapillarnål, herefter kaldet en mikroinjektionsnål, til klemmemonteringsmikromanipulatoren stabiliseret af en magnetisk holder (opsætning vist i figur 2B).
- Der pipetteres 2 μl af injektionsopløsningen på en steril petriskål. Mens du observerer under mikroskopet, optages langsomt 1-2 μL af denne opløsning i mikroinjektionsnålen ved hjælp af den lufttrykssprøjte, der er fastgjort til mikromanipulatoren. Undgå bobler/optagelse af bobler i mikroinjektionskanylen.
Figur 2: Forberedelse af operationsområdet . (A) Opsætning af operationsområde inde i en ren bænk. (B) Dissektionsmikroskop og mikromanipulatoropsætning til en højrehåndet person. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Eksponering af den kvindelige reproduktive kanal
- Bedøv en 6-8 uger gammel hunmus ved at administrere filtreret, fortyndet avertin (bedøvelsesmiddel) intraperitonealt i en dosis på 0,25-0,5 mg / g. Efter dette administreres carprofen (præventivt smertestillende middel) subkutant i en dosis på 5 mg/kg.
BEMÆRK: Andre alternativer, der kan bruges som bedøvelsesmiddel, er isofluran eller ketamin/xylazin. - Anbring absorberende papir på en ren, opvarmet pude/skive. Placer derefter den bedøvede mus på dette opvarmede absorberende papir med den dorsale side opad. Påfør øjensmøremiddel på hvert øje for at forhindre udtørring under operationen.
BEMÆRK: Kontroller, at varmepuden/disken er let varm at røre ved ved ved at teste med håndryggen. - Test for dyb bedøvelsesstop ved at klemme tåen på den bedøvede mus med et par tang. Fjern rygpels omkring det potentielle snitsted (placering vist i figur 3A) og tør den bare hud med antiseptisk middel.
- Brug et par lige stump tang til at klemme den bare hud og skabe et 1 cm langt snit langs kroppens midterlinje ved hjælp af en steril skarp stump saks. Rengør området omkring snittet med antiseptisk middel.
- Klem og hold den ene side af det afskårne sted op ved hjælp af et par sterile Adson-tang. Brug derefter et par sterile buede serrated tang til forsigtigt at adskille huden fra kropsvæggen, begyndende ved midterlinjesnittet og bevæge sig sideværts.
- Find fedtpuden under nyrerne. Brug et par sterile lige stumpe tang til at klemme kropsvæggen direkte over fedtpuden. Opret et lille snit i kropsvæggen ved hjælp af en steril skarpspids dissekerende saks, og pas på at undgå blodkar.
- Mens du stadig klemmer kropsvæggen med lige stump tang, skal du indsætte et par sterile stump buede tang i snittet og udvide snittet skabt i kropsvæggen.
- Tag fat i den synlige fedtpude med den stumpe buede tang og træk den ud af hullet for at udsætte æggestokken, ovidukten og livmoderen.
- For at holde reproduktionskanalen eksponeret skal du klemme fedtpuden med en steril bulldogklemme, som vist i figur 3B.
6. In vivo oviduktinjektion og elektroporation
- Placer forsigtigt det opvarmede absorberende papir og bedøvede mus med reproduktionskanalen udsat på scenen af et dissekerende mikroskop, således at kanalen kan observeres. Et eksempel på udsigten, som den er observeret under mikroskopet, er vist i figur 3B.
- Juster mikromanipulatoren, så injektionsnålen med opløsning også kan observeres under mikroskopet.
- Brug et par sterile koniske ultrafine spidstang til at holde oviduktområdet, der skal injiceres, stabilt. Det område, der skal injiceres, skal være i overensstemmelse med mikroinjektionsnålens retning.
BEMÆRK: Brug bulldogklemmen, der forankrer fedtpuden og reproduktionskanalen, til forsigtigt at dreje / flytte kanalen til en optimal position, hvis det er nødvendigt. - Juster mikromanipulatoren til at punktere ovidukten med mikroinjektionsnålen, mens du samtidig fører ovidukten på nålen ved hjælp af de koniske ultrafine spidspincet. Flyt forsigtigt mikroinjektionsnålen for at bekræfte, at den er indsat i ovidukten.
BEMÆRK: Indsæt mikroinjektionsnålen i et lige segment i stedet for i et vendepunkt for den oprullede ovidukt for at forhindre flere punkteringer og lækage af injektionsopløsningen. - Injicer langsomt op til 1 μL opløsning i ovidukten, mens du observerer bevægelsen af den blå opløsning og udvidelsen af oviduktlumen under mikroskopet. Pas på ikke at indføre bobler i lumen. Repræsentative billeder af ovidukter injiceret med 100% trypanblå er vist i figur 3C,D.
- Fjern nålen fra ovidukten. Dæk det område, der skal målrettes mod, med et stykke absorberende papir gennemvædet med sterilt 1x PBS (fra trin 3.3).
- Tag fat i det gennemblødte papir og det område/område, der skal målrettes med en elektrodepincet (1 mm, 3 mm eller 5 mm, afhængigt af størrelsen på det område, der skal målrettes), og træk væk fra kroppen, før du elektroporerer ved hjælp af disse indstillinger på pulsgeneratoren/elektroporatoren: 30 V, tre impulser, 1 s interval, 50 ms pulslængde, unipolær.
BEMÆRK: Afstanden mellem elektroderne skal indstilles således, at elektroderne kan klemme fast på målområdet uden at deformere ovidukten. Den anbefalede afstand er ca. 1 mm. - Efter elektroporation fjernes det absorberende papir, og musen (med det opvarmede absorberende papir nedenunder) anbringes tilbage på en varmepude. Løsn bulldogklemmen og skub forsigtigt den udsatte reproduktive kanal tilbage under kropsvæggen. Gentag afsnit 5 for at udsætte reproduktionskanalen på den anden side.
BEMÆRK: Elektroporation er vellykket uanset musens brunststadium, så længe lumen er fyldt med opløsningen. - Dæk den eksponerede kanal med absorberende papir gennemvædet med sterilt 1x PBS for at forhindre, at det tørrer ud, og forbered derefter mikroinjektionskanylen til den anden injektion ved at gentage trin 4.2 og 4.3.
BEMÆRK: Udskift mikroinjektionsnålen efter behov. Undgå udtørring af det eksponerede væv ved at anvende steril 1x PBS, når det er nødvendigt. - Gentag ovenstående trin for at injicere og elektroporate ovidukten på den modsatte side.
BEMÆRK: Påfør øjensmøremidlet igen efter behov under og efter operationen. - Efter at begge ovidukter er blevet elektroporeret og placeret tilbage under kropsvæggen, sutur eller hæfteklammer det dorsale snitsted. Til suturering skal du bruge en hemostat til at gribe nålen på de silkeflettede suturer (3/8 cirkel; måler: 5-0; nålestørrelse: 18 mm; gevindlængde: 75 cm). Klem og hold den ene side af det afskårne sted op ved hjælp af et par sterile buede takkede tang, og brug derefter hemostat til at manipulere suturen for at lukke såret.
- Flyt musen ind i et rent bur, der placeres oven på en opvarmet pude/disk (fra trin 3.2), og overvåg, indtil musen er aktiv.
- Carprofen administreres subkutant hver 24. time i de næste 3 dage og overvåges i løbet af de næste 10 dage.
Figur 3: Kvindelig eksponering for reproduktive kanaler og mikroinjektion . (A) Placering af midterlinjesnit (vist som en gul linje) på den dorsale side af en Rosa-LSLtdTomato-mus. B) Eksponering for kvinders reproduktive organer. Fedtpuden blev fastspændt ved hjælp af en steril bulldogklemme for at forankre kanalen og holde den udsat. (C,D) Repræsentative billeder af in vivo oviduktinjektion. En mikroinjektionsnål blev indsat i den distale ampulla (mærket AMP), og filtreret 100% trypanblåt blev injiceret i oviduktlumen, mens kanalen blev eksponeret (C). Repræsentativt billede af en dissekeret ovidukt, der viser, at injiceret trypanblå opløsning fordeler sig gennem det distale og proksimale oviduktlumen (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Figur 1 og figur 2 viser henholdsvis mikroinjektionsnålens forberedelse og operationsområdets opsætning for in vivo mikroinjektion og elektroporation af museovidukten. Under operationen blev den kvindelige reproduktive kanal eksponeret gennem snit foretaget i dorsal hud (figur 3A) og kropsvæg af en bedøvet Rosa-LSLtdTomato (Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 17 mus. En bulldogklemme blev fastspændt på fedtpuden over kanalen for at holde den udsat og forankret (figur 3B). Injektionsopløsning indeholdende PCS2 CreNLS-plasmider18 ved en koncentration på 400 ng/μl blev injiceret i ampulla (mærket AMP) i den oprullede ovidukt og fik lov til at sprede sig gennem oviduktlumen (figur 3C,D). Selvom PCS2 CreNLS-plasmider blev brugt til at generere repræsentative resultater i dette manuskript, kan den beskrevne metode anvendes med let udskiftelige DNA/RNA/RNP'er i injektionsopløsningen til CRISPR/Cas-medieret genredigering i museovidukten. Derefter blev 1 mm eller 3 mm pincetelektroder placeret, således at den distale ovidukt var mellem elektroderne til elektroporationsbaseret levering.
Ovidukter blev høstet 4 dage efter operationen og strakt ud ved at fjerne mesosalpinx for at visualisere elektroporationsspecificitet. Ved hjælp af enten 1 mm eller 3 mm pincetelektroder blev målområdet, mærket med TdTomato, begrænset til det distale oviduktepitel (figur 4A, D). Størrelsen af dette målområde blev yderligere kontrolleret ved hjælp af elektroder af forskellig størrelse. Ved hjælp af 3 mm pincetelektroder målrettede vi mod et meget større område af AMP (figur 4B, C) sammenlignet med kun at målrette mod den distale spids, INF (figur 4E, F), ved hjælp af 1 mm pincet-type elektroder. Disse høstede ovidukter blev fikseret, behandlet med en saccharosegradient og snittet ved hjælp af en kryostat til detaljerede analyser. Sektioner blev modfarvet med Hoescht 33342 og Phalloidin for at plette henholdsvis kernerne og cytoskelettet, derefter blev de afbildet ved hjælp af et punktscanningskonfokalmikroskop. I målområdet blev elektroporerede celler, markeret med TdTomato, tilfældigt fordelt mellem ikke-elektroporerede (TdTomato-ve) celler (figur 4G). Derudover var elektroporerede celler begrænset til slimhindepitelet og blev ikke fundet i det underliggende stromale eller muskellag (figur 4G, H). Endelig, for at bekræfte CRISPR-Cas-medieret genredigering, kan TdTomato+ve-celler isoleres ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til DNA-isolering og MiSeq-sekventering12.
Figur 4: Validering af vellykket in vivo-injektion og elektroporation af oviduktepitelceller, 4 dage efter operationen. (A-C) Elektroporation ved hjælp af 3 mm størrelse pincet-type elektroder. Ovidukten blev oprullet ved at fjerne mesosalpinx for bedre visualisering af elektroporationsspecificitet (A). Elektroporationsområdet, identificeret ved TdTomato-ekspression, var begrænset til den distale ovidukt, mærket AMP (B,C). (D-F) Elektroporation ved hjælp af 1 mm størrelse pincet-type elektroder. Ovidukten blev oprullet ved at fjerne mesosalpinx for bedre visualisering af elektroporationsspecificitet (D). Elektroporationsområdet var begrænset til infundibulum (mærket INF), den distale spids af ovidukten (E, F). (G,H) Tværsnit af den distale ovidukt 4 dage efter elektroporation med PCS2 CreNLS plasmider. Elektroporerede celler mærket med TdTomato (G) var begrænset til epitelmonolaget (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Afgørende trin i denne detaljerede protokol er mikroinjektion af DNA / RNA / RNP-opløsning i oviduktlumen og kontrol af elektroporationsstyrken og arealet. Lækage af DNA/RNA/RNP-opløsning under mikroinjektion kan forårsage transfektion af uønskede områder/celler. For ensartet og effektiv elektroporation foretrækkes det at fylde oviduktens lumen med opløsningen (figur 3C, D). Dette skyldes, at elektroporationsområdet hovedsageligt styres af elektrodestørrelse og placering. Svag elektroporation reducerer antallet af elektroporerede celler, og hård elektroporation kan forårsage elektroporation af uønskede celler eller forstyrre vævsstrukturen. Antallet af elektroporerede celler kan varieres ved at justere DNA/RNA/RNP-opløsningskoncentrationen eller elektroporationsparametrene. Da højspænding/varmeproduktion under elektroporation imidlertid kan beskadige vævet, bør disse parametre testes før brug på levende/bedøvede mus. Endelig anbefales det på grund af den krævende karakter af denne procedure at øve kanaleksponering og mikroinjektion på døde mus, inden denne operation udføres på levende / bedøvede mus.
Det erkendes, at flere gener er involveret i kræftinitiering, og derfor kræver rekapitulering af denne begivenhed multiallelisk modifikation af flere gener. Derudover er det også kendt, at ikke alle celler er lige modtagelige for onkogene mutationer9. Kræftmodellering kræver derfor specifikke Cre-muselinjer for at opnå stram kontrol med onkogene fornærmelser. Deres tilgængelighed og specificitet forårsager imidlertid forskellige udfordringer, herunder virkninger i ikkemålvæv og dødelighed19. Desuden medfører traditionelle G-GEMM'er høje omkostninger til vedligeholdelse og kræver tid til generering af muselinjer. Udviklingen af CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi og forbedring af genlevering til specifikke somatiske celler har gjort det muligt for os at overvinde disse problemer. I denne protokol præsenterer vi en DNA/RNA/RNP-leveringsmetode til somatisk genommanipulation, der kan bruges til kræftmodellering uden det absolutte behov for specifikke muselinjer12. Ved at injicere DNA/RNA/RNP-opløsninger i lumen og anvende forskellige størrelser pincetelektroder til elektroporationsbaseret levering målrettes begrænsede områder af museoviduktens slimhindepitel (figur 4A-F). Dette er især nyttigt til modellering af initieringen af HGSC'er, der stammer fra den distale ende af æggelederen.
Den præsenterede mikroinjektions- og in vivo-elektroporationsmetode er meget alsidig til målretning af væv / organer med et lumen. Orgelparenkym kan også målrettes ved hjælp af denne metode14. Virale leveringsmetoder, som lentivirale og adenovirale systemer, kan også bruges til lignende formål. Fordelene ved elektroporation i forhold til virale leveringsmetoder er imidlertid: 1) multipel plasmidlevering i enkeltceller, 2) ingen begrænsning af indsatsstørrelsen15 og 3) nem kontrol af området og leveringstidspunktet. Derudover kan målretningsspecificitet forbedres ved at bruge afstamningsspecifikke promotorer. Dette er undertiden vanskeligt i virale systemer på grund af grænsen for viral emballage.
Som det er karakteren af elektroporation, er elektroporerede epitelceller tilfældigt blandet med sunde, uredigerede celler (figur 4G). Denne mosaik i genetisk modificerede og umodificerede celler kan imidlertid være en fordel for at studere kræftinitiering, da den rekapitulerer den sporadiske karakter af tidlig kræftinitiering inden for et immunkompetent mikromiljø. Frekvensen af elektroporerede celler kan justeres ved at variere DNA/RNA/RNP-opløsningskoncentrationerne og/eller elektroporationsparametrene. Ved hjælp af CRISPR-Cas-medieret genredigering i kombination med den præsenterede protokol er det let at screene flere gener og generere heterogene mønstre af mutationer / allelkombinationer i målrettede gener; dette er især nyttigt ved modellering af kræftformer, der præsenterer et betydeligt antal genomiske ændringer som HGSC'er20,21. Ved at sekventere målrettede gener under kræftprogression er det desuden muligt at følge in vivo klonal udvikling af tumorer og metastaser i immunkompetente mus12.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Katie Teng og Dr. Matthew J. Ford for at levere plasmider, der bruges til at generere repræsentative resultater og protokoloptimering. K.H. blev støttet af Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS) ph.d.-stipendium, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Center for Forskning i Reproduktion og Udvikling (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin og Alexander McFee kandidatstuderende.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | - | - | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | - | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | - | - | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | - | - | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
References
- Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).
- Li, S., Winuthayanon, W. Oviduct: roles in fertilization and early embryo development. The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).
- Briceag, I., et al. Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility. Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature Communications. 8 (1), 1093 (2017).
- Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers. Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).
- Soong, T. R., et al. Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas. The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis. Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Teng, K., et al. Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).
- Ford, M. J., Yamanaka, Y. Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation. Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).
- Maresch, R., et al. Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice. Nature Communications. 7, 10770 (2016).
- Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens. Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
