Summary
该协议描述了显微注射和 体内 电穿孔，用于小鼠输卵管中区域限制的CRISPR介导的基因组编辑。
Abstract
种系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）为 体内基因在 发育、稳态和疾病中的功能提供了有价值的见解。然而，与菌落创建和维护相关的时间和成本很高。CRISPR介导的基因组编辑的最新进展允许通过直接靶向感兴趣的细胞/组织/器官来产生体细胞GEMM（S-GEMMs）。
输卵管或人类输卵管被认为是最常见的卵巢癌、高级别浆液性卵巢癌 （HGSC） 的起源组织。HGSC始于子宫远端的输卵管区域，位于卵巢附近，但不是输卵管近端。然而，传统的HGSC小鼠模型针对整个输卵管，因此不能概括人类的状况。我们提出了一种将DNA，RNA或核糖核蛋白（RNP）溶液显微注射到输卵管腔和 体内 电穿孔的方法，以靶向沿输卵管限制区域的粘膜上皮细胞。这种方法在癌症建模中有几个优点，例如1）靶向电穿孔区域/组织/器官和区域具有高适应性，2）与Cas9表达的特异性启动子结合使用时，靶向细胞类型（细胞柔韧性）具有高灵活性，3）电穿孔细胞数量的高灵活性（相对较低的频率）， 4）不需要特定的小鼠系（免疫功能疾病建模），5）基因突变组合的高度灵活性，以及6）与Cre报告基因系结合使用时跟踪电穿孔细胞的可能性。因此，这种具有成本效益的方法概括了人类癌症的发生。
Introduction
输卵管，在小鼠中称为输卵管，是一种连接子宫和卵巢的管状结构。它在哺乳动物繁殖中起着至关重要的作用，为内部受精和植入前发育提供了环境1,2。尽管它很重要，但对其功能和稳态知之甚少，部分原因是体外受精技术的发展规避了与该器官有关的任何不孕症问题3。然而，已经认识到高级别浆液性卵巢癌 （HGSC） 的癌前病变，这是一种侵袭性卵巢癌组织型，约占卵巢癌的 75%和相关死亡的 85%4，仅限于远端输卵管上皮 5,6,7,8 .这表明并非我们体内的所有细胞都同样容易受到致癌损伤的影响，而是只有每个组织/器官中的独特/易感细胞才能成为癌症的起源细胞 - 称为细胞柔韧性9。沿着这些思路，已经表明，位于卵巢附近的远端输卵管的上皮细胞与输卵管的其余部分不同10,11。因此，针对输卵管中所有细胞的传统HGSC小鼠模型并不能概括人类的状况。在最近的一项研究中，我们结合使用CRISPR介导的基因组编辑，体内输卵管电穿孔和基于Cre的谱系追踪，通过突变远端小鼠输卵管中的四个肿瘤抑制基因来成功诱导HGSC12,13。本手稿提供了一个分步方案，描述了这种显微注射和体内电穿孔程序，以靶向小鼠输卵管粘膜上皮。
这种方法有几个优点。它可以适应于靶向其他组织/器官，包括器官实质14。虽然其他体内基因递送方法（如慢病毒和腺病毒系统）可用于实现类似的组织/器官特异性靶向，但使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送更容易调整靶向区域。根据DNA/RNA/核糖核蛋白（RNP）的浓度、电穿孔参数和电极的大小，可以改变电穿孔细胞的数量。此外，当与Cas9表达的促进剂结合使用时，可以靶向特定的细胞类型，而无需绝对需要种系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）。此外，与病毒递送系统不同，电穿孔允许将多个质粒递送到单个细胞中，并且对插入片段DNA大小15的限制较小。由于这种高度的灵活性，基因突变的体内筛选也可以相对容易地进行。此外，当该方法与Cre报告细胞系（例如Tdtomato或Confetti16,17）结合使用时，可以跟踪或追踪电穿孔细胞。
Protocol
将动物饲养在带有过滤器顶部的静态微隔离笼中，该笼位于包含II型生物安全柜的专用房间中。所有动物工作均按照机构指南进行，并得到麦吉尔大学医学与健康科学学院动物护理委员会（AUP #7843）的批准。
1.显微注射针头制备
- 使用以下程序使用微量移液器拉动玻璃毛细管到尖点：P = 500，热量= 576，PULL = 50，VEL = 80，DEL = 70。
- 使用一对锥形超细尖端镊子，在解剖显微镜下剪断拉动的毛细管的尖端以创建一个开口，如图1A，B所示。确保开口不要太大，因为这会损坏输卵管并防止缓慢注射。
图1：显微注射针头制备。 （A，B）拉动的毛细管，带有尖端（A），被剪断以形成开口（B）。 请点击此处查看此图的大图。
2.准备腹腔注射麻醉剂
- 在手术当天准备过滤，稀释的阿弗汀。阿弗汀（2,2,2-三溴乙醇）储备溶液通过剧烈搅拌以1.6g/mL的叔戊醇浓度制备并避光保存。
- 在通风橱内用 1.25% v/v 等渗盐水稀释阿弗汀储备溶液至终浓度为 20 mg/mL。涡旋稀释的阿弗丁并通过0.22μm无菌过滤器过滤。保持黑暗。
3. 准备手术区域
- 手术区域应为专用无菌环境，最好是干净的工作台或生物安全柜。根据需要安排无菌手术设备、显微镜、显微操纵器和电穿孔器。 图 2 中显示了这方面的一个示例。
- 加热加热垫/圆盘并将其放在干净、设备齐全的笼子下面。该笼子将用于容纳手术后的小鼠。
- 将无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 倒入无菌培养皿中。用一把干净的剪刀将吸水纸切成正方形，尺寸约为 1 厘米 x 1 厘米。将这些吸收性纸放入 1x PBS 中浸泡它们。
4.制备注射液和针头
- 在手术当天准备注射溶液。将 DNA/RNA/RNP 与过滤的台盼蓝混合，每个台盼蓝的最低最终浓度分别为 200 ng/μL和 5%。注射前在室温下储存。
注意：使用1 mL注射器吸收100%台盼蓝，并在使用前通过0.22 μm无菌过滤器过滤。 - 将拉动的毛细管针（以下称为显微注射针）连接到由磁性安装座稳定的夹具安装显微操纵器（ 设置如图2B所示）。
- 将 2 μL 注射溶液移液到无菌培养皿上。在显微镜下观察时，使用连接到显微操纵器的气压注射器缓慢地将该溶液吸收1-2μL到显微注射针中。避免气泡/将气泡吸收到显微注射针中。
图2：手术区域准备 。 （A）洁净工作台内的手术区域设置。（B）右撇子的解剖显微镜和显微操纵器设置。 请点击此处查看此图的大图。
5.暴露女性生殖道
- 通过腹膜内以0.25-0.5mg / g的剂量施用过滤的稀释的阿弗汀（麻醉剂）来麻醉6-8周龄的雌性小鼠。在此之后，以5mg / kg的剂量皮下注射卡洛芬（先发制人的镇痛药）。
注意：其他可用作麻醉剂的替代品是异氟醚或氯胺酮/甲苯噻嗪。 - 将吸水纸放在干净的加热垫/光盘上。然后，将麻醉的小鼠放在这种加热的吸收纸上，背面朝上。在每只眼睛上涂抹眼睛润滑剂，以防止手术过程中干燥。
注：用手背测试确认加热垫/圆盘摸起来略微发热。 - 通过用一对镊子夹住麻醉小鼠的脚趾来测试深度麻醉停止。去除预期切口部位周围的背毛（ 位置如图3A所示），并用防腐剂擦拭裸露的皮肤。
- 用一对直钝钳捏住裸露的皮肤，并使用一把无菌锋利的钝剪刀沿着身体中线做一个 1 厘米长的切口。用防腐剂清洁切口周围的区域。
- 使用一对无菌 Adson 镊子捏住并支撑切割部位的一侧。然后，使用一对无菌弯曲的锯齿状镊子，轻轻地将皮肤与体壁分开，从中线切口开始并横向移动。
- 找到肾脏下方的脂肪垫。使用一对无菌直钝钳，将体壁直接捏在脂肪垫上方。使用一把无菌尖锐的解剖剪刀在体壁上创建一个小切口，注意避开血管。
- 在仍然用直钝钳夹住体壁的同时，将一对无菌钝弯曲镊子插入切口并扩大在体壁上产生的切口。
- 用钝弯曲的镊子抓住可见的脂肪垫，将其从孔中拉出，露出卵巢、输卵管和子宫。
- 为了保持生殖道暴露，用无菌斗牛犬夹夹住脂肪垫，如图 3B所示。
6. 体内 输卵管注射和电穿孔
- 小心地将加热的吸收纸和麻醉小鼠与生殖道暴露在解剖显微镜的载物台上，以便可以观察到束。在显微镜下观察到的视图示例如图 3B所示。
- 调整显微操纵器，以便在显微镜下观察带有溶液的注射针。
- 使用一对无菌锥形超细尖端镊子，保持要注射的输卵管区域稳定。要注射的区域必须与显微注射针的方向一致。
注意：如果需要，使用固定脂肪垫和生殖道的斗牛犬夹将尿道轻轻转动/移动到最佳位置。 - 调整显微操纵器以用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖端镊子将输卵管喂入针头上。轻轻移动显微注射针，确认它已插入输卵管。
注意：将显微注射针插入直线段而不是盘绕输卵管的转折点，以防止多次穿刺和注射溶液泄漏。 - 缓慢地将多达 1 μL 的溶液注入输卵管中，同时在显微镜下观察蓝色溶液的运动和输卵管腔的扩张。注意不要将任何气泡引入腔内。注射100%台盼蓝的输卵管的代表性图像如图3C，D所示。
- 从输卵管中取出针头。用一张预先浸泡在无菌1x PBS中的吸收纸覆盖目标区域（来自步骤3.3）。
- 用一把电极镊子（1 mm、3 mm 或 5 mm，取决于要瞄准的区域的大小）抓住预先浸泡的纸张和要瞄准的区域/区域，然后从身体上拉开，然后使用脉冲发生器/电穿孔器上的这些设置进行电穿孔：30 V，三个脉冲，1 秒间隔， 50 ms 脉冲长度，单极性。
注意：电极之间的距离应设置为电极可以夹在目标区域而不会使输卵管变形。建议的距离约为 1 毫米。 - 电穿孔后，取出吸水纸并将鼠标（下面有加热的吸水纸）放回加热垫上。松开斗牛犬夹，小心地将暴露的生殖道推回体壁下。重复第 5 节以暴露另一侧的生殖道。
注意：只要管腔充满溶液，无论小鼠发情期如何，电穿孔都是成功的。 - 用预先浸泡在无菌1x PBS中的吸收纸覆盖暴露的束以防止其变干，然后通过重复步骤4.2和4.3准备显微注射针进行第二次注射。
注意：根据需要更换显微注射针头。在需要时使用无菌 1x PBS 防止暴露的组织干燥。 - 重复上述步骤，在另一侧注射并电穿孔输卵管。
注意：在手术期间和手术后根据需要重新涂抹眼睛润滑剂。 - 在两个输卵管被电穿孔并放回体壁下后，缝合或钉住背侧切口部位。缝合时，使用止血器抓住丝编织缝合线的针头（3/8圆;规格：5-0;针尺寸：18毫米;线长：75厘米）。使用一对无菌弯曲锯齿状镊子捏住并支撑切割部位的一侧，然后使用止血器操纵缝合线以缝合伤口。
- 将鼠标移动到放置在加热垫/圆盘顶部的干净笼子中（从步骤 3.2 开始）并监视直到鼠标处于活动状态。
- 在接下来的 3 天内每 24 小时皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬，并在接下来的 10 天内监测。
图3：女性生殖道暴露和显微注射。 （A）Rosa-LSLtdTomato小鼠背侧中线切口（显示为黄线）的位置。（B） 女性生殖道暴露。使用无菌斗牛犬夹夹住脂肪垫以锚定道并保持暴露。（中，四）体内输卵管注射的代表性图像。将显微注射针插入远端壶腹（标记为AMP），并在暴露道时将过滤的100%台盼蓝注射到输卵管腔中（C）。解剖输卵管的代表性图像，表明注射台盼蓝溶液分布在整个远端和近端输卵管腔 （D）。请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
图1和图2分别描述了用于小鼠输卵管的体内显微注射和电穿孔的显微注射针头制备和手术区域设置。在手术过程中，通过麻醉的Rosa-LSLtdTomato（Gt（ROSA）26Sortm14（CAG-tdTomato）Hze / J）17小鼠的背侧皮肤（图3A）和体壁上的切口暴露女性生殖道。将斗牛犬夹夹在道上方的脂肪垫上，以保持其暴露和锚定（图3B）。将含有400ng/μL浓度的PCS2 CreNLS质粒18的注射溶液注入卷曲输卵管的壶腹（标记为AMP）中，并使其分散在整个输卵管腔中（图3C，D）。尽管PCS2 CreNLS质粒在本手稿中用于产生代表性结果，但所述方法可以与注射溶液中易于互换的DNA/RNA/RNP一起使用，用于小鼠输卵管中CRISPR/Cas介导的基因编辑。然后，定位1 mm或3 mm镊子型电极，使得远端输卵管位于电极之间，以进行基于电穿孔的输送。
手术后4天收获输卵管，并通过去除输卵管中层来伸展，以观察电穿孔特异性。使用1 mm或3 mm镊子型电极，用TdTomato标记的目标区域仅限于远端输卵管上皮（图4A，D）。通过使用不同尺寸的电极进一步控制该目标区域的大小。使用3 mm镊子型电极，我们靶向AMP的更大区域（图4B，C），而使用1 mm镊子型电极仅靶向最远端的尖端INF（图4E，F）。这些收获的输卵管被固定，用蔗糖梯度处理，并使用低温恒温器切片以进行详细分析。切片用Hoescht 33342和鬼笔环肽复染，分别对细胞核和细胞骨架进行染色，然后使用点扫描共聚焦显微镜对切片进行成像。在目标区域中，由TdTomato标记的电穿孔细胞随机分布在非电穿孔（TdTomato-ve）细胞中（图4G）。此外，电穿孔细胞仅限于粘膜上皮，在下面的基质或肌肉层中没有发现（图4G，H）。最后，为了确认CRISPR-Cas介导的基因编辑，可以通过荧光激活细胞分选（FACS）分离TdTomato + ve细胞进行DNA分离和MiSeq测序12。
图 4：手术后 4 天产卵管上皮细胞体内注射和电穿孔成功的验证。 （A-C） 使用3毫米大小的镊子型电极进行电穿孔。通过去除输卵管来解开输卵管，以便更好地观察电穿孔特异性（A）。通过TdTomato表达识别的电穿孔区域仅限于远端输卵管，标记为AMP（B，C）。（D-F）使用1毫米大小的镊子型电极进行电穿孔。通过去除输卵管来解开输卵管，以更好地观察电穿孔特异性（D）。电穿孔区域仅限于漏斗区（标记为INF），即输卵管（E，F）的最远端。（G，H）用PCS2 CreNLS质粒电穿孔4天后远端输卵管的横截面。用TdTomato（G）标记的电穿孔细胞仅限于上皮单层（H）。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
该详细方案中的关键步骤是将DNA/RNA/RNP溶液显微注射到输卵管腔中，并控制电穿孔强度和面积。显微注射过程中的DNA/RNA/RNP溶液泄漏可能导致转染不需要的区域/细胞。为了一致和有效地电穿孔，最好用溶液填充输卵管腔（图3C，D）。这是因为电穿孔的面积主要由电极尺寸和位置控制。弱电穿孔会减少电穿孔细胞的数量，而苛刻的电穿孔可能会导致不需要的细胞电穿孔或破坏组织结构。电穿孔细胞的数量可以通过调整DNA/RNA/RNP溶液浓度或电穿孔参数来改变。然而，由于电穿孔过程中的高电压/热量产生可能会损坏组织，因此在活/麻醉小鼠使用之前应测试这些参数。最后，由于该程序的要求很高，建议在对活/麻醉小鼠进行此手术之前，对死小鼠进行道暴露和显微注射。
人们认识到，癌症的发生涉及多个基因，因此，概括这一事件需要对几个基因进行多等位基因修饰。此外，众所周知，并非所有细胞都同样容易受到致癌突变的影响9。因此，癌症建模需要特定的Cre小鼠系来实现对致癌损伤的严格控制。然而，它们的可用性和特异性带来了各种挑战，包括对非靶向组织的影响和致死性19。此外，传统的G-GEMM会产生高昂的维护成本，并且需要时间来生成鼠标系。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展和特定体细胞基因递送的改进使我们能够克服这些问题。在该协议中，我们提出了一种用于体细胞基因组操作的DNA / RNA / RNP递送方法，可用于癌症建模，而无需绝对需要特定的小鼠系12。通过将 DNA/RNA/RNP 溶液注射到管腔并使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送，靶向小鼠输卵管粘膜上皮的限制区域（图 4A-F）。这在模拟源自输卵管远端的 HGSC 的起始时特别有用。
所提出的显微注射和 体内 电穿孔方法对于靶向具有管腔的组织/器官具有高度通用性。使用这种方法也可以靶向器官实质14。病毒递送方法，如慢病毒和腺病毒系统，也可用于类似目的。然而，与病毒递送方法相比，电穿孔的优势在于：1）将多个质粒递送到单个细胞中，2）对插入片段尺寸15没有限制，以及3）易于控制递送区域和时间。此外，通过使用谱系特异性启动子可以提高靶向特异性。由于病毒包装的限制，这在病毒系统中有时很困难。
正如电穿孔的性质一样，电穿孔的上皮细胞随机散布着健康的、未经编辑的细胞（图4G）。然而，转基因和未修饰细胞中的这种嵌合体可能有利于研究癌症的发生，因为它概括了免疫功能正常的微环境中早期癌症起始的零星性质。电穿孔细胞的频率可以通过改变DNA/RNA/RNP溶液浓度和/或电穿孔参数来调节。将CRISPR-Cas介导的基因编辑与所提出的方案结合使用，可以轻松筛选多个基因并在靶基因中生成突变/等位基因组合的异质模式;这在模拟具有大量基因组改变的癌症（如HGSCS20,21）时特别有用。此外，通过在癌症进展期间对靶向基因进行测序，可以跟踪免疫功能小鼠中肿瘤和转移的体内克隆进化12。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Katie Teng和Matthew J. Ford博士提供的质粒，用于产生具有代表性的结果和方案优化。K.H.得到了魁北克-桑特研究基金会（FRQS）博士资助，Donnor基金会，Delta Kappa Gamma世界奖学金，生殖与发展研究中心（CRRD），Hugh E. Burke，Rolande&Marcel Gosselin和Alexander McFee研究生奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | - | - | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | - | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | - | - | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | - | - | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
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