Summary
Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.
Abstract
Kiembaan genetisch gemanipuleerde muismodellen (G-GEMM's) hebben waardevol inzicht gegeven in in vivo genfunctie in ontwikkeling, homeostase en ziekte. De tijd en kosten die gepaard gaan met het creëren en onderhouden van kolonies zijn echter hoog. Recente ontwikkelingen in CRISPR-gemedieerde genoombewerking hebben het mogelijk gemaakt om somatische GEMM's (S-GEMM's) te genereren door zich rechtstreeks te richten op de cel / weefsel / orgaan van belang.
De eileider, of eileider bij de mens, wordt beschouwd als het weefsel van oorsprong van de meest voorkomende eierstokkanker, hooggradige sereuze ovariumcarcinomen (HGSCs). HGSCs initiëren in het gebied van de eileider distaal van de baarmoeder, gelegen naast de eierstok, maar niet de proximale eileider. Traditionele muismodellen van HGSC richten zich echter op de hele eileider en recapituleren dus niet de menselijke conditie. We presenteren een methode van DNA, RNA of ribonucleoproteïne (RNP) oplossing micro-injectie in het eileiderlumen en in vivo elektroporatie om mucosale epitheelcellen in beperkte gebieden langs de eileider te richten. Er zijn verschillende voordelen van deze methode voor kankermodellering, zoals 1) hoog aanpassingsvermogen bij het richten op het gebied / weefsel / orgaan en het gebied van elektroporatie, 2) hoge flexibiliteit in gerichte celtypen (cellulaire buigzaamheid) bij gebruik in combinatie met specifieke promotors voor Cas9-expressie, 3) hoge flexibiliteit in het aantal geëlektroporeerde cellen (relatief lage frequentie), 4) er is geen specifieke muislijn vereist (immunocompetente ziektemodellering), 5) hoge flexibiliteit in genmutatiecombinatie en 6) mogelijkheid om geëlektroporeerde cellen te volgen bij gebruik in combinatie met een Cre-reporterlijn. Deze kosteneffectieve methode vat dus de initiatie van menselijke kanker samen.
Introduction
De eileider, bij muizen de eileider genoemd, is een buisvormige structuur die de baarmoeder met de eierstok verbindt. Het speelt een essentiële rol bij de voortplanting van zoogdierenen biedt de omgeving voor interne bevruchting en pre-implantatieontwikkeling 1,2. Ondanks het belang ervan is er weinig bekend over de functie en homeostase, deels als gevolg van de ontwikkeling van in-vitrofertilisatietechnieken die elk onvruchtbaarheidsprobleem met betrekking tot dit orgaan omzeilen3. Er is echter erkend dat precancereuze laesies van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSC), een agressief histotype van eierstokkanker dat goed is voor ongeveer 75% van de ovariumcarcinomen en 85% van de gerelateerde sterfgevallen4, beperkt zijn tot het distale eileiderepitheel 5,6,7,8 . Dit geeft aan dat niet alle cellen in ons lichaam even gevoelig zijn voor oncogene beledigingen, maar eerder dat alleen unieke / gevoelige cellen in elk weefsel / orgaan de cel van oorsprong worden bij kanker - cellulaire buigzaamheid9 genoemd. Langs deze lijnen is aangetoond dat de epitheelcellen van de distale eileider, gelegen naast de eierstok, verschillen van de rest van de buis10,11. Traditionele muismodellen van HGSC, die zich richten op alle cellen in de eileider, geven dus geen samenvatting van de menselijke conditie. In een recente studie gebruikten we een combinatie van CRISPR-gemedieerde genoombewerking, in vivo oviductelektroporatie en Cre-gebaseerde afstammingstracering om HGSC met succes te induceren door vier tumorsuppressorgenen in de distale muiseileider12,13 te muteren. Dit manuscript presenteert een stap-voor-stap protocol dat deze procedure van micro-injectie en in vivo elektroporatie beschrijft om het mucosale epitheel van de muisleider te richten.
Deze methode heeft verschillende voordelen. Het kan worden aangepast om zich te richten op andere weefsels / organen, waaronder orgaanparenchym14. Hoewel andere in vivo genafgiftebenaderingen zoals lentivirale en adenovirale systemen kunnen worden gebruikt om vergelijkbare weefsel- / orgaanspecifieke targeting te bereiken, kan het gebied van targeting gemakkelijker worden aangepast met behulp van verschillende maten van pincet-type elektroden voor op elektroporatie gebaseerde toediening. Afhankelijk van de concentratie van DNA/RNA/ribonucleoproteïnen (RNP's), elektroporatieparameters en de grootte van elektroden, kan het aantal geëlektroperde cellen worden gewijzigd. Verder kunnen specifieke celtypen worden gericht wanneer ze worden gebruikt in combinatie met promotors voor Cas9-expressie, zonder de absolute noodzaak van kiembaan genetisch gemanipuleerde muismodellen (G-GEMM's). Bovendien zorgt elektroporatie, in tegenstelling tot virale toedieningssystemen, voor meerdere plasmideafgifte in afzonderlijke cellen en minder beperking in de insert DNA-grootte15. In vivo screening van genmutaties kan ook relatief eenvoudig worden uitgevoerd vanwege deze hoge flexibiliteit. Verder kunnen geëlektroperde cellen worden gevolgd of getraceerd wanneer deze methode wordt gebruikt in combinatie met Cre-reporterlijnen zoals Tdtomato of Confetti16,17.
Protocol
Dieren werden gehuisvest in statische micro-isolatiekooien met filtertoppen, gelegen in een speciale ruimte met een type II bioveiligheidskast. Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en werd goedgekeurd door de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Animal Care Committee van McGill University (AUP # 7843).
1. Microinjectie naald voorbereiding
- Trek een glazen capillaire buis in een scherpe punt met behulp van een micropipettrekker met het volgende programma: P = 500, Warmte = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.
- Knip met behulp van een taps toelopende ultrafijne tiptang het puntige uiteinde van de getrokken capillaire buis onder een ontleedmicroscoop om een opening te maken, zoals weergegeven in figuur 1A, B. Zorg ervoor dat de opening niet te groot is, omdat dit de eileider beschadigt en langzame injectie voorkomt.
Figuur 1: Voorbereiding van microinjectienaalden. (A,B) Getrokken capillaire buis met een puntig uiteinde (A) dat werd geknipt om een opening te creëren (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Het anestheticum voorbereiden op intraperitoneale injectie
- Bereid gefilterde, verdunde avertine op de dag van de operatie. Avertine (2,2,2-tribromoethanol) stamoplossing wordt bereid in een concentratie van 1,6 g/ml in tert-amylalcohol door krachtig roeren en bewaard in het donker.
- Verdun de avertine-stockoplossing met 1,25% v/v isotone zoutoplossing tot een eindconcentratie van 20 mg/ml in een zuurkast. Vortex de verdunde avertine en filtreer door een steriel filter van 0,22 μm. Blijf in het donker.
3. Het operatiegebied voorbereiden
- Het operatiegebied moet een speciale steriele omgeving zijn, bij voorkeur een schone bank of bioveiligheidskast. Regel de steriele chirurgische apparatuur, microscoop, micromanipulator en elektroporator indien nodig. Een voorbeeld hiervan is te zien in figuur 2.
- Verwarm het verwarmingskussen/de schijf en plaats deze onder een schone, volledig uitgeruste kooi. Deze kooi zal worden gebruikt om de muizen na de operatie te huisvesten.
- Giet steriel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een steriele petrischaal. Gebruik een schone schaar om absorberend papier in vierkanten te knippen, met geschatte afmetingen van 1 cm x 1 cm. Laat deze stukjes absorberend papier in de 1x PBS vallen om ze te laten weken.
4. De oplossing en naald voorbereiden voor injectie
- Bereid de injectie-oplossing op de dag van de operatie. Meng de DNA/RNA/RNP's met gefilterd trypanblauw tot een minimale eindconcentratie van respectievelijk 200 ng/μL en 5%. Bewaren bij kamertemperatuur vóór injectie.
OPMERKING: Gebruik een spuit van 1 ml om 100% trypan blauw op te nemen en filter voor gebruik door een steriel filter van 0,22 μm. - Bevestig de getrokken capillaire naald, voortaan een microinjectienaald genoemd, aan de micromanipulator voor klembevestiging, gestabiliseerd door een magnetische houder (opstelling weergegeven in figuur 2B).
- Pipetteer 2 μL van de injectieoplossing op een steriele petrischaal. Neem tijdens het observeren onder de microscoop langzaam 1-2 μL van deze oplossing op in de microinjectienaald met behulp van de spuit onder luchtdruk die aan de micromanipulator is bevestigd. Vermijd bubbels/het opnemen van bubbels in de microinjectienaald.
Figuur 2: Voorbereiding van het operatiegebied . (A) Opstelling van de operatieruimte in een schone bank. (B) Dissectiemicroscoop en micromanipulator opstelling voor een rechtshandige persoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Blootstelling van het vrouwelijke voortplantingskanaal
- Verdoof een 6-8 weken oude vrouwelijke muis door gefilterde, verdunde avertine (anestheticum) intraperitoneaal toe te dienen in een dosis van 0,25-0,5 mg / g. Dien hierna carprofen (preventief analgeticum) subcutaan toe in een dosis van 5 mg/kg.
OPMERKING: Andere alternatieven die als verdovingsmiddel kunnen worden gebruikt, zijn isofluraan of ketamine / xylazine. - Plaats absorberend papier op een schone, verwarmde pad/schijf. Plaats vervolgens de verdoofde muis op dit verwarmde absorberende papier met de dorsale kant naar boven gericht. Breng oogglijmiddel aan op elk oog om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen.
OPMERKING: Controleer of het verwarmingskussen/de schijf enigszins warm aanvoelt door te testen met de rug van de hand. - Test op diepe verdovingsstilstand door de teen van de verdoofde muis met een tang te knijpen. Verwijder de dorsale vacht rond de potentiële incisieplaats (locatie weergegeven in figuur 3A) en veeg de blote huid af met een antisepticum.
- Gebruik een rechte stompe tang om de blote huid te knijpen en maak een 1 cm lange incisie langs de middellijn van het lichaam met behulp van een steriele scherpe stompe schaar. Reinig het gebied rond de incisie met antisepticum.
- Knijp en houd een kant van de snijplaats omhoog met een steriele Adson-tang. Scheid vervolgens met behulp van een steriele gebogen gekartelde tang de huid voorzichtig van de lichaamswand, beginnend bij de middellijnincisie en lateraal bewegend.
- Lokaliseer het vetkussen onder de nier. Gebruik een steriele rechte stompe tang en knijp de lichaamswand direct boven het vetkussen. Maak een kleine incisie in de lichaamswand met behulp van een steriele scherppuntige ontleedschaar en zorg ervoor dat bloedvaten worden vermeden.
- Terwijl u nog steeds de lichaamswand knijpt met een rechte stompe tang, steekt u een paar steriele stompe gebogen tangen in de incisie en verbreedt u de incisie die in de lichaamswand is gemaakt.
- Pak het zichtbare vetkussen met de stompe gebogen tang en trek het uit het gat om de eierstok, eileider en baarmoeder bloot te leggen.
- Om het voortplantingskanaal bloot te houden, klemt u het vetkussen vast met een steriele bulldogklem, zoals weergegeven in figuur 3B.
6. In vivo eileiderinjectie en elektroporatie
- Plaats het verwarmde absorberende papier en de verdoofde muis voorzichtig met het voortplantingskanaal blootgesteld op het stadium van een ontleedmicroscoop, zodat het kanaal kan worden waargenomen. Een voorbeeld van het beeld zoals waargenomen onder de microscoop is weergegeven in figuur 3B.
- Stel de micromanipulator zo in dat de injectienaald met oplossing ook onder de microscoop kan worden waargenomen.
- Houd met behulp van een steriele taps toelopende ultrafijne tiptang het gebied van de eileider dat moet worden geïnjecteerd stabiel. Het te injecteren gebied moet in overeenstemming zijn met de richting van de micro-injectienaald.
OPMERKING: Gebruik de bulldogklem die het vetkussen en het voortplantingskanaal verankert om het kanaal voorzichtig te draaien / verplaatsen naar een optimale positie, indien nodig. - Stel de micromanipulator in om de eileider te doorboren met de micro-injectienaald, terwijl u tegelijkertijd de eileider op de naald voert met behulp van de taps toelopende ultrafijne tiptang. Beweeg de microinjectienaald voorzichtig om te bevestigen dat deze in de eileider is ingebracht.
OPMERKING: Steek de microinjectienaald in een recht segment in plaats van in een keerpunt van de opgerolde eileider om meerdere puncties en lekkage van de injectieoplossing te voorkomen. - Injecteer langzaam tot 1 μL oplossing in de eileider, terwijl u de beweging van de blauwe oplossing en de uitzetting van het eileiderlumen onder de microscoop observeert. Zorg ervoor dat u geen bubbels in het lumen introduceert. Representatieve beelden van eileiders geïnjecteerd met 100% trypan blauw zijn weergegeven in figuur 3C,D.
- Verwijder de naald uit de eileider. Bedek het te richten gebied met een stuk absorberend papier dat is voorgeweekt in steriel 1x PBS (vanaf stap 3.3).
- Pak het voorgekookte papier en het te richten gebied/gebied vast met een elektrodepincet (1 mm, 3 mm of 5 mm, afhankelijk van de grootte van het te richten gebied) en trek weg van het lichaam, voordat u elektropoleert met behulp van deze instellingen op de pulsgenerator / elektroporator: 30 V, drie pulsen, 1 s interval, 50 ms pulslengte, unipolair.
OPMERKING: De afstand tussen de elektroden moet zo worden ingesteld dat de elektroden op het beoogde gebied kunnen klemmen zonder de eileider te vervormen. De aanbevolen afstand is ongeveer 1 mm. - Verwijder na elektroporatie het absorberende papier en plaats de muis (met het verwarmde absorberende papier eronder) terug op een warmtekussen. Maak de bulldogklem los en duw het blootgestelde voortplantingskanaal voorzichtig terug onder de lichaamswand. Herhaal rubriek 5 om het voortplantingskanaal aan de andere kant bloot te leggen.
OPMERKING: Elektroporatie is succesvol, ongeacht het oestrusstadium van de muis, zolang het lumen is gevuld met de oplossing. - Bedek het blootgestelde kanaal met absorberend papier dat is voorgeweekt in steriel 1x PBS om uitdroging te voorkomen en bereid de micro-injectienaald vervolgens voor op de tweede injectie door stap 4.2 en 4.3 te herhalen.
OPMERKING: Vervang de micro-injectienaald indien nodig. Voorkom uitdroging van het blootgestelde weefsel door indien nodig steriele 1x PBS aan te brengen. - Herhaal de bovenstaande stappen om de eileider aan de andere kant te injecteren en te elektropoleren.
OPMERKING: Breng het oogsmeermiddel indien nodig opnieuw aan tijdens en na de operatie. - Nadat beide eileiders zijn geëlektropoeerd en terug onder de lichaamswand zijn geplaatst, hecht of niett de dorsale incisieplaats. Gebruik voor het hechten een hemostat om de naald van de zijden gevlochten hechtingen vast te pakken (3/8 cirkel; dikte: 5-0; naaldmaat: 18 mm; draadlengte: 75 cm). Knijp en houd een kant van de snijplaats omhoog met behulp van een steriele gebogen gekartelde tang en gebruik vervolgens de hemostat om de hechting te manipuleren om de wond te sluiten.
- Beweeg de muis naar een schone kooi die bovenop een verwarmde pad/schijf wordt geplaatst (vanaf stap 3.2) en controleer totdat de muis actief is.
- Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe om de volgende 3 dagen en controleer gedurende de volgende 10 dagen.
Figuur 3: Blootstelling van vrouwelijke voortplantingsorganen en micro-injectie . (A) Locatie van de middellijnincisie (weergegeven als een gele lijn) aan de dorsale zijde van een Rosa-LSLtdTomato-muis. B) Blootstelling van vrouwelijke voortplantingsorganen. Het vetkussen werd vastgeklemd met behulp van een steriele bulldogklem om het kanaal te verankeren en bloot te houden. (C,D) Representatieve beelden van in vivo eileiderinjectie. Een micro-injectienaald werd ingebracht in de distale ampulla (gelabeld AMP) en gefilterd 100% trypan blauw werd geïnjecteerd in het eileiderlumen terwijl het kanaal werd blootgesteld (C). Representatief beeld van een ontlede eileider, waaruit blijkt dat geïnjecteerde trypanblauwe oplossing zich verspreidt over het distale en proximale eileiderlumen (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Figuur 1 en figuur 2 tonen respectievelijk de microinjectienaaldvoorbereiding en de opstelling van het operatiegebied voor in vivo microinjectie en elektroporatie van de eileider van de muis. Tijdens de operatie werd het vrouwelijke voortplantingskanaal blootgesteld via incisies in de dorsale huid (figuur 3A) en de lichaamswand van een verdoofde Rosa-LSLtdTomato (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 muis. Een bulldogklem werd op het vetkussen boven het traktaat geklemd om het bloot en verankerd te houden (figuur 3B). Injectieoplossing met PCS2 CreNLS-plasmiden18 met een concentratie van 400 ng/μl werd geïnjecteerd in de ampulla (gelabeld AMP) van de opgerolde eileider en liet zich verspreiden door het eileiderlumen (figuur 3C,D). Hoewel PCS2 CreNLS-plasmiden werden gebruikt om representatieve resultaten in dit manuscript te genereren, kan de beschreven methode worden gebruikt met gemakkelijk uitwisselbare DNA / RNA / RNP's in de injectieoplossing voor CRISPR / Cas-gemedieerde genbewerking in de eileider van de muis. Vervolgens werden elektroden van het pincettype van 1 mm of 3 mm geplaatst, zodat de distale eileider zich tussen de elektroden bevond voor levering op basis van elektroporatie.
Eileiders werden 4 dagen na de operatie geoogst en uitgerekt door de mesosalpinx te verwijderen om de specificiteit van elektroporatie te visualiseren. Met behulp van elektroden van het pincet van het type 1 mm of 3 mm werd het beoogde gebied, gelabeld met TdTomato, beperkt tot het distale eileiderepitheel (figuur 4A, D). De grootte van dit doelgebied werd verder gecontroleerd door elektroden van verschillende groottes te gebruiken. Met behulp van 3 mm pincet-type elektroden richtten we ons op een veel groter gebied van de AMP (figuur 4B, C), in vergelijking met alleen de distale punt, de INF (figuur 4E, F), met behulp van 1 mm pincet-type elektroden. Deze geoogste eileiders werden gefixeerd, behandeld met een sucrosegradiënt en gesegmenteerd met behulp van een cryostaat voor gedetailleerde analyses. Secties werden gecounterd met Hoescht 33342 en Phalloidin om respectievelijk de kernen en het cytoskelet te kleuren, waarna ze werden afgebeeld met behulp van een puntscannende confocale microscoop. In het doelgebied werden geëlektroporeerde cellen, gemarkeerd door TdTomato, willekeurig verdeeld over niet-geëlektroporeerde (TdTomato-ve) cellen (figuur 4G). Bovendien waren geëlektroporeerde cellen beperkt tot het slijmvliesepitheel en niet gevonden in de onderliggende stromale of spierlaag (figuur 4G, H). Ten slotte, om CRISPR-Cas-gemedieerde genbewerking te bevestigen, kunnen TdTomato +ve cellen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor DNA-isolatie en MiSeq-sequencing12.
Figuur 4: Validatie van succesvolle in vivo injectie en elektroporatie van eileiderepitheelcellen, 4 dagen na de operatie. (A-C) Elektroporatie met behulp van 3 mm grote pincet-elektroden. De eileider werd losgemaakt door de mesosalpinx te verwijderen voor een betere visualisatie van elektroporatiespecificiteit (A). Elektroporatiegebied, geïdentificeerd door TdTomato-expressie, was beperkt tot de distale eileider, gelabeld AMP (B,C). (D-F) Elektroporatie met behulp van 1 mm grote pincet-type elektroden. De eileider werd losgemaakt door de mesosalpinx te verwijderen voor een betere visualisatie van elektroporatiespecificiteit (D). Het elektroporatiegebied was beperkt tot het infundibulum (aangeduid als INF), de distale punt van de eileider (E,F). (G,H) Transversale doorsnede van de distale eileider 4 dagen na elektroporatie met PCS2 CreNLS plasmiden. Geëlektroporeerde cellen gelabeld met TdTomato (G) waren beperkt tot de epitheliale monolaag (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Cruciale stappen in dit gedetailleerde protocol zijn de micro-injectie van DNA / RNA / RNP-oplossing in het eileiderlumen en controle van de elektroporatiesterkte en het gebied. DNA/RNA/RNP-oplossingslekkage tijdens micro-injectie kan transfectie van ongewenste gebieden/cellen veroorzaken. Voor consistente en efficiënte elektroporatie verdient het de voorkeur om het eileiderlumen met de oplossing te vullen (figuur 3C, D). Dit komt omdat het gebied van elektroporatie voornamelijk wordt geregeld door de grootte en plaatsing van de elektrode. Zwakke elektroporatie vermindert het aantal geëlektroporeerde cellen en harde elektroporatie kan de elektroporatie van ongewenste cellen veroorzaken of de weefselstructuur verstoren. Het aantal geëlektroporeerde cellen kan worden gevarieerd door de DNA/RNA/RNP-oplossingsconcentratie of elektroporatieparameters aan te passen. Aangezien hoge spanningen/warmteproductie tijdens elektroporatie het weefsel echter kunnen beschadigen, moeten deze parameters worden getest voordat ze worden gebruikt op levende/verdoofde muizen. Ten slotte, vanwege de veeleisende aard van deze procedure, wordt het aanbevolen om blootstelling aan het kanaal en micro-injectie op dode muizen te oefenen voordat deze operatie op levende / verdoofde muizen wordt uitgevoerd.
Het wordt erkend dat meerdere genen betrokken zijn bij het initiëren van kanker, dus het samenvatten van deze gebeurtenis vereist multi-allelische modificatie van verschillende genen. Daarnaast is ook bekend dat niet alle cellen even gevoelig zijn voor oncogene mutaties9. Kankermodellering vereist daarom specifieke Cre-muislijnen om een strakke controle op oncogene beledigingen te bereiken. Hun beschikbaarheid en specificiteit veroorzaakt echter verschillende uitdagingen, waaronder effecten in niet-gerichte weefsels en letaliteit19. Verder brengen traditionele G-GEMM's hoge onderhoudskosten met zich mee en hebben ze tijd nodig voor het genereren van muislijnen. De ontwikkeling van CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie en de verbetering van de genafgifte in specifieke somatische cellen heeft ons in staat gesteld deze problemen te overwinnen. In dit protocol presenteren we een DNA/RNA/RNP-toedieningsmethode voor somatische genoommanipulatie die kan worden gebruikt voor kankermodellering, zonder de absolute noodzaak van specifieke muislijnen12. Door DNA/RNA/RNP-oplossingen in het lumen te injecteren en verschillende maten pincet-elektroden te gebruiken voor op elektroporatie gebaseerde toediening, worden beperkte delen van het muis-eileiderslijmvliesepitheel gericht (figuur 4A-F). Dit is vooral handig bij het modelleren van de initiatie van HGSCs die afkomstig zijn van het distale uiteinde van de eileider.
De gepresenteerde micro-injectie en in vivo elektroporatiemethode is zeer veelzijdig voor het richten van weefsels / organen met een lumen. Orgaanparenchym is ook targetable met behulp van deze methode14. Virale toedieningsbenaderingen, zoals lentivirale en adenovirale systemen, kunnen ook voor vergelijkbare doeleinden worden gebruikt. De voordelen van elektroporatie ten opzichte van virale toedieningsbenaderingen zijn echter: 1) meervoudige plasmideafgifte in enkele cellen, 2) geen beperking op de insertgrootte15 en 3) eenvoudige controle van het gebied en de timing van de levering. Bovendien kan de targetingspecificiteit worden verbeterd door gebruik te maken van afstammingsspecifieke promotors. Dit is soms moeilijk in virale systemen vanwege de limiet op virale verpakkingen.
Zoals de aard van elektroporatie is, worden geëlektroporeerde epitheelcellen willekeurig afgewisseld met gezonde, onbewerkte cellen (figuur 4G). Dit mozaïcisme in genetisch gemodificeerde en niet-gemodificeerde cellen kan echter voordelig zijn om kankerinitiatie te bestuderen, omdat het de sporadische aard van vroege kankerinitiatie binnen een immunocompetente micro-omgeving samenvat. De frequentie van geëlektroporeerde cellen kan worden aangepast door de DNA/RNA/RNP-oplossingsconcentraties en/of elektroporatieparameters te variëren. Met behulp van CRISPR-Cas-gemedieerde genbewerking in combinatie met het gepresenteerde protocol is het eenvoudig om meerdere genen te screenen en heterogene patronen van mutaties/allelische combinaties in gerichte genen te genereren; dit is vooral nuttig bij het modelleren van kankers die zich presenteren met een aanzienlijk aantal genomische veranderingen zoals HGSCs20,21. Verder is het door het sequencen van gerichte genen tijdens kankerprogressie mogelijk om de in vivo klonale evolutie van tumoren en metastasen in immunocompetente muizen te volgen12.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Katie Teng en Dr. Matthew J. Ford voor het leveren van plasmiden die worden gebruikt om representatieve resultaten en protocoloptimalisatie te genereren. K.H. werd ondersteund door Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS) doctoraatsbeurs, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande &; Marcel Gosselin en Alexander McFee afgestudeerde studentships.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | - | - | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | - | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | - | - | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | - | - | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
References
- Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).
- Li, S., Winuthayanon, W. Oviduct: roles in fertilization and early embryo development. The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).
- Briceag, I., et al. Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility. Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature Communications. 8 (1), 1093 (2017).
- Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers. Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).
- Soong, T. R., et al. Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas. The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis. Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Teng, K., et al. Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).
- Ford, M. J., Yamanaka, Y. Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation. Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).
- Maresch, R., et al. Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice. Nature Communications. 7, 10770 (2016).
- Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens. Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
