En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

Resumen

Se presenta paso a paso las instrucciones para la generación de quimeras neonatal, así como la disección y preparación de la timo para la ex vivo de imágenes de 2-fotones microscopía.

Resumen

Microscopía de dos fotones (TPM) permite a la imagen de fondo en el timo y documentar los eventos que son importantes para el desarrollo de los timocitos. Para seguir la migración de personas entre una multitud de timocitos, generamos quimeras neonatal, donde se obtienen menos de uno por ciento de los timocitos de un donante que es transgénico para una proteína fluorescente doquier expresar. Para generar estas quimeras hematopoyéticas parcial, los beneficiarios neonatal son inyectados con médula ósea de 3-7 días de edad. Después de 4-6 semanas, el ratón es sacrificado y el timo se seccionó en forma cuidadosa y bissected conservando la arquitectura del tejido que se va a examinar. El timo está pegado a un cubreobjetos en preparación para la ex vivo de imágenes de TPM. Durante la exploración del timo se mantiene en DMEM sin rojo fenol que es perfundido con un 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y se calienta a 37 ° C. Con este enfoque, podemos estudiar los eventos necesarios para la generación de un repertorio de células T diferentes.

Protocolo

Transferencia adoptiva

Inyectar los recién nacidos con 50 100 ul de la médula ósea con una jeringa de insulina 4.2 veces durante los primeros 3-7 días de vida, con un final de donantes-a-host proporción de 1:1. Aspirar a un sitio de la inyección por debajo del esternón y las costillas, pero por encima de los intestinos y el estómago. Inserte la aguja lo suficiente como para penetrar en el peritoneo, cuidado de no perforar la membrana. No es raro que algunos de la médula ósea que se pierde durante la inyección. Usted puede reducir la pérdida al aflojar el control sobre el cachorro a medida que se inyecta con el fin de permitir que la piel se expanda y, a continua....

Discusión

Imágenes de dos fotones en el timo que nos permite examinar en la vida, órganos intactos las interacciones y las migraciones que subyacen a los eventos de selección en el timo.

....