Summary
Protokollen oppsummerer beste praksis for å minimere mikrobiell biobyrde i et renromsmiljø og inkluderer strategier som miljøovervåking, prosessovervåking og testing av produktsterilitet. Det er relevant for produksjons- og testanlegg som kreves for å oppfylle gjeldende standarder for god vevspraksis og gjeldende standarder for god produksjonspraksis.
Abstract
Et godt validert og helhetlig program som inkorporerer robuste påklednings-, rengjørings-, miljøovervåkings- og personellovervåkingstiltak er avgjørende for å minimere den mikrobielle biobyrden i produksjonssuiter for cellulær terapi og tilhørende testlaboratorier for å sikre at anleggene opererer i en tilstand av kontroll. Å sikre produktsikkerhet via kvalitetskontrolltiltak, for eksempel sterilitetstesting, er et regulatorisk krav for både minimalt manipulerte (§ 361) og mer enn minimalt manipulerte (§ 351) humane celler, vev og cellulære og vevsbaserte produkter (HCT / Ps). I denne videoen gir vi en trinnvis veiledning for hvordan du utvikler og innlemmer de beste aseptiske praksisene for drift i et renromsmiljø, inkludert påkledning, rengjøring, iscenesettelse av materialer, miljøovervåking, prosessovervåking og produktsterilitetstesting ved bruk av direkte inokulering, levert av United States Pharmacopeia (USP<71>) og National Institutes of Health (NIH) Alternative Sterility Testing Method. Denne protokollen er ment som en referanseveiledning for virksomheter som forventes å møte gjeldende god vevspraksis (cGTP) og gjeldende god produksjonspraksis (cGMP).
Introduction
Implementering av et sterkt mikrobielt overvåkingsprogram gjennom miljøovervåking (EM), prosessovervåking og produktsterilitetstesting er et regulatorisk krav for gjeldende god vevspraksis (cGTP) og gjeldende god produksjonspraksis (cGMP) i cellulære terapilaboratorier1. I tillegg forventer United States Food and Drug Administration (FDA) at laboratoriet som utfører kvalitetskontroll (QC) testing av produktet, også skal benytte fasiliteter og kontroller som kan sammenlignes med de som brukes til aseptiske fyllingsoperasjoner2.
Denne protokollen har fire hoveddeler: 1) Aseptisk praksis, inkludert personalkapping, rengjøring og iscenesettelse av materialer; 2) EM, inkludert levedyktige luft- og overflatekulturer og ikke-levedyktig partikkelluftovervåking; 3) prosessovervåking, inkludert sedimenteringsplater og hansker fingertuppprøvetaking; og 4) produktsterilitetstesting via den kompendiale United States Pharmacopeia (USP) <71> metode3 eller NIH Alternative Sterility Testing Method4. Når de brukes sammen, kan disse tiltakene være en effektiv metode for å sikre at et anlegg forblir i en tilstand av kontroll.
Teknikkene beskrevet her er ikke nye; Imidlertid mangler gjeldende standarder fra regulatorer og profesjonelle organisasjoner detaljer, noe som har ført til fravær av mikrobiell overvåking eller implementering av ikke-standardisert praksis, spesielt i akademiske sentre hvor produksjon på stedet og produktsterilitetstesting dukker opp i en rask hastighet 1,5,6 . Denne protokollen kan brukes som en veiledning for å lage et mikrobielt overvåkings- og kontrollprogram som oppfyller regulatoriske krav når det brukes i forbindelse med sluttbrukervalidering og risikovurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aseptisk praksis
- Personalkjole for et renromsrom
MERK: Denne prosedyren er basert på første kjole i et uklassifisert rom, etterfulgt av oppføring i et International Organization for Standardization (ISO) 8-område og deretter et ISO7-område. Denne prosedyren er relevant for laboratorier som forsøker å konvertere eksisterende plass til en renromsfunksjon. Ideelt sett ville all innledende kjole forekomme i et ISO8-klassifisert rom (ikke i et uklassifisert rom).- Fest løst hår. Vask hendene, og bytt til skrubb (langermede skrubbebukser og skrubbebukser i full lengde er å foretrekke). Samle og bytt til renromssko med skodeksler på.
- Desinfiser hendene ved hjelp av et alkoholbasert håndrensemiddel først og deretter igjen mellom hvert av følgende trinn: iført ikke-sterile hansker og deretter et skjeggdeksel (for en hvilken som helst mengde synlig ansiktshår), hvis aktuelt. Ta på deg en ikke-steril bouffant, og dekk underarmene med ikke-sterile ermer hvis langermede skrubbtopper ikke har blitt brukt.
- Fjern skodekslene, og gå på den klebrig matten foran ISO8-døren til forrommet med hver fot etter at skodekselet er fjernet. Forsikre deg om at hele foten har kontakt med den klebrig matten før du går inn. Kast skodekslene, og dekontaminer hanskene og dørhåndtaket med 70% steril isopropylalkohol (sIPA). Gå inn i ISO8-forrommet.
- Samle en steril hette, steril ansiktsmaske, sterile kjeledresser, sterile støveltrekk og vernebriller. Dekontaminer hanskene med 70% sIPA. Ta på deg vernebriller, og sett materialene på en ren overflate, i henhold til trinn 1.5.
- Ta på deg et nytt par ikke-sterile skotrekk over de dedikerte renromsskoene, og gå på den klebrig matten foran det sekundære forrommet. Pass på at hele foten kommer i kontakt med den klebrig matten. Dekontaminer hanskene med 70% sIPA. Samle de iscenesatte kjoleforsyningene, og gå inn i det sekundære ISO7-forrommet, som forblir på den skitne siden av demarkasjonslinjen.
- Ta på deg den sterile hetten og den sterile kjeledressen, berør bare innsiden av kjolematerialet og sørg for at hettens hals er gjemt inne i kjeledressen for å skape en fullstendig forsegling. Ta på deg de sekundære sterile støveldekslene. Dekontaminer hanskene med 70% sIPA mellom hvert påkledningstrinn.
- Kontroller at kjolen er tatt på på riktig måte, dekontaminer hanskene med 70% sIPA, og gå inn i ISO7-rommet.
NOTAT: Kontroller regelmessig kjolematerialet for integritet. Hvis det er kompromittert, gå ut av renrommet umiddelbart og kapp på nytt.
- Påkledning for et biologisk sikkerhetsskap (BSC)
- Kjole i henhold til trinn 1.1 ovenfor med disse tilleggspraksisene.
- Samle sterile hansker og sterile ermer. Rengjør BSC i henhold til trinn 1.4, og iscenesett materialene i henhold til trinn 1.5. Dekontaminer hanskene med 70% sIPA.
- Ta på deg sterile hylser aseptisk over kjeledressen, ved hjelp av tommelløkker hvis de finnes. Ta på sterile hansker over eksisterende hansker, slik at mansjetten på hansken strekker seg over det sterile ermet. Dekontaminer hanskene med 70% sIPA mellom hvert trinn. Gå inn i BSC.
NOTAT: Kontroller regelmessig kjolematerialet for integritet. Hvis det er kompromittert, gå ut av renrommet umiddelbart og kapp på nytt.
- Doffing av kjolematerialene
- Gå ut av BSC, og fjern forsiktig det øverste par hansker og sterile ermer. Dekontaminer innerhanskene med 70% sIPA.
- Gå inn i det sekundære og deretter primære forrommet, og vent på at døren lukkes helt mellom hvert trinn. Fjern materialene i følgende rekkefølge: ytre sterile støveldeksler, kjeledress, hette og ansiktsmaske.
- Gå ut av det primære forrommet, og fjern den ikke-sterile kjolen.
MERK: Rekkefølgen for fjerning i det uklassifiserte rommet er ikke viktig; Imidlertid bør de indre ikke-sterile skodekslene forbli på renromsskoene for oppbevaring i ikke-klassifiserte rom. - Desinfiser hendene ved hjelp av et alkoholbasert håndrensemiddel, og gå tilbake til gateklær.
- Rengjøring av renromsoverflatene og BSC
- Monter en håndholdt rengjøringsmopp, eller få en ren våtserviett med lite lo. Hvis du bruker en våtserviett med lite lo, bretter du servietten i fire og roterer mellom hver overflate. Mett mopphodet eller våtservietten med lite lo med et godkjent desinfeksjonsmiddel.
- Arbeid fra baksiden til forsiden (eller topp til bunn), rengjør BSC med overlappende kluter i følgende rekkefølge: HEPA diffusorgrillen (toppen av BSC), bakveggen til BSC, begge sideveggene til BSC, rammen og arbeidsflaten. Til slutt, tørk rammen av BSC med 70% sIPA for å fjerne eventuelle gjenværende desinfeksjonsmidler. Se figur 1 for et typisk BSC-rengjøringsmønster.
- Oppsamling av materialer og utstyr i klassifiserte miljøer
- Dekontaminere (dvs. stadium) alle materialer som krever overføring fra et ikke-klassifisert eller lavere klassifisert område til et høyere klassifisert område (f.eks. fra et ISO8- til ISO7-rom) for å minimere overføringen av mikrober. Overføring av materialer mellom områder med samme ISO-klassifiseringsnivå krever ikke oppsamling.
MERK: Hvis materialene har blitt terminalt sterilisert og er i flere poser, fjern den ytre posen / posen og flytt materialet inn i det klassifiserte rommet; Tørking av den indre posen/posen er ikke nødvendig. - Få en våtserviett med lite lo, og brett servietten i fire for å rotere til en ren side når våtservietten blir skitten. Mett våtservietten med 70% sIPA eller et godkjent desinfeksjonsmiddel.
- Tørk av utsiden av materialet/utstyret med overlappende våtservietter. Forsikre deg om at alle områdene på varen er tørket, inkludert innsiden av opptrekkbare pakninger og kroker / innrykk på utstyret og andre uregelmessig formede forsyninger. For utstyr på hjul, sørg for at hele hjulet har blitt tørket under iscenesettelsesprosessen (utstyret må kanskje tippes forsiktig for å la hjulene roteres).
- Dekontaminere (dvs. stadium) alle materialer som krever overføring fra et ikke-klassifisert eller lavere klassifisert område til et høyere klassifisert område (f.eks. fra et ISO8- til ISO7-rom) for å minimere overføringen av mikrober. Overføring av materialer mellom områder med samme ISO-klassifiseringsnivå krever ikke oppsamling.
Figur 1: Eksempel på et BSC-rengjøringsmønster. Arbeid fra baksiden til forsiden (eller topp til bunn), rengjør BSC med overlappende kluter i følgende rekkefølge: HEPA diffusorgrillen (toppen av BSC), bakveggen til BSC, begge sideveggene til BSC, rammen og arbeidsflaten. Til slutt, tørk rammen av BSC med 70% sIPA for å fjerne eventuelle gjenværende desinfeksjonsmidler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Miljøovervåking (EM)
- Levedyktig overflateprøvetaking
- Plasser materialene som trengs for prøvetakingsøkten i henhold til trinn 1.5, og kapp inn i det klassifiserte rommet i henhold til seksjon 1.
MERK: Overflateprøvetaking bør utføres før luftprøvetaking på et angitt sted. Hvis du bruker flere plater til å ta overflateprøver av et område, må du ikke prøve nøyaktig samme sted. Bruk kontaktplater til å prøve flate overflater bare for å sikre full kontakt og for å unngå potensiell skade på agar. - Samle og merk en tryptisk soyaagar med lecithinase og tween (TSALT) plate og en Sabouraud dextrose agar med lecithinase og tween (SABLT) plate for hvert prøvetakingssted. Hold bunnen av platen med en hånd, fjern lokket aseptisk, vær forsiktig så du ikke berører den hevede agaroverflaten.
- Berør den hevede agaren mot overflaten som prøves, sørg for at hele overflaten er i kontakt, og trykk fast på platen. La platen være i kontakt med overflaten i minst 5 s.
- KRITISK: Ikke beveg platen sideveis over overflaten som prøves, da dette kan spre potensiell vekst over overflaten, noe som gjør oppløsningen av individuelle kolonier vanskelig. Ikke bruk overdreven kraft på kontaktplaten under prøvetaking, da agaroverflaten kan sprekke.
- Bytt dekselet aseptisk, pass på at du ikke berører den hevede agaroverflaten. Lås dekselet på plass hvis kontaktplaten har et låsesystem. Rengjør prøvetakingsområdet med 70 % sIPA for å fjerne gjenværende medium fra overflaten. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1. Et representativt bilde som viser vekst av tre kolonidannende enheter (CFUer) med to distinkte kolonimorfologier på en TSALT-overflateprøvetakingsplate er illustrert i figur 2. Figur 3 viser kontaminering av en TSALT-plate med vekst på kanten av platen, som skyldes dårlig aseptisk teknikk under prøvetaking.
- Plasser materialene som trengs for prøvetakingsøkten i henhold til trinn 1.5, og kapp inn i det klassifiserte rommet i henhold til seksjon 1.
- Levedyktig luftprøvetaking
- Plasser materialene som trengs for prøvetakingsøkten i henhold til trinn 1.5, og kapp inn i det klassifiserte rommet i henhold til seksjon 1.
- Samle inn og merk en tryptisk soyaagar (TSA) plate og en Sabouraud dextrose agar (SAB) plate for hvert prøvetakingssted. Forbered luftprøvetakeren ved aseptisk å fjerne prøvetakingshodet ved å gripe bare på ytterkanten for å unngå å forurense hodet.
- Hold prøvetakingshodet i den ene hånden, plasser mediet aseptisk i plateholderen på prøvetakeren. Hvis det er en pinne som er lengre enn de andre, setter du mediet mot den lengre pinnen først, og skyver deretter platen ned i de gjenværende utstikkerne for å feste platen.
- Fjern lokket på platen aseptisk, og legg det på en rengjort overflate ut av veien til prøvetakingen er fullført. Bytt ut og fest prøvetakingshodet aseptisk, og grip bare på ytterkanten for å unngå å forurense hodet. Gjenta trinn 2.2.2-2.2.4 for det gjenværende mediet hvis du bruker en flerhodet luftprøvetaker.
- Plasser luftprøvetakeren på prøvetakingsstedet med prøvetakingshodene vendt i den dominerende retningen av luftstrømbevegelsen. Forsikre deg om at eksosen fra den ikke-levedyktige luftprøvetakeren (hvis prøvetaking samtidig) ikke forstyrrer den levedyktige prøvetakeren. Kontroller at luftprøvetakeren er stilt inn på de validerte innstillingene, og start prøvetakingssyklusen.
- Når prøvetakingssyklusen er fullført, fjerner du prøvetakingshodet aseptisk fra prøvetakeren ved å gripe bare på ytterkanten for å unngå å forurense hodet. Hold prøvetakingshodet i den ene hånden, og sett lokket på agarplaten aseptisk. Fjern platen fra plateholderen. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1.
- Desinfiser prøvetakingshodet og området rundt plateholderen med 70% sIPA. Fest prøvetakingshodet aseptisk, og grip bare ytterkanten. Gjenta trinn 2.2.6 og trinn 2.2.7 for det gjenværende mediet hvis du bruker en flerhodet luftprøvetaker.
MERK: Figur 4 viser en TSA-aktiv luftprøvetakingskultur med vekst forårsaket av et forurenset prøvetakingshode. Omvendt representerer figur 5 en TSA-aktiv luftprøvetakingskultur uten vekst. Luftinnrykk fra prøvetakingshodet kan sees på bildet.
- Ikke-levedyktig prøvetaking
- Utfør en nullkontroll på laserpartikkeltelleren før prøvetakingsaktivitetene for hver bruksdag. Fest isokinetisk hode til prøvetakingsporten på partikkeltelleren enten direkte eller festet til en slangelengde etter behov for prøvetakingsstedet.
- Hvis slangen påføres, bruk en kort lengde, fordi slanger >1 m lange kan forårsake problemer med å telle partikler på ≥1 μm og kan også føre til unødvendige bøyninger i røret. Kontroller at partikkeltelleren er satt til de validerte innstillingene. Det anbefales å stille inn en forsinkelse på ca. 30 s for å tillate utgang fra prøvetakingsområdet for å unngå luftstrømforstyrrelser under prøvetaking.
- Plasser laserpartikkeltellerens isokinetiske hode på prøvetakingsstedet med det isokinetiske hodet vendt inn i den dominerende retningen av luftstrømbevegelsen. Forsikre deg om at eksosen fra den levedyktige luftprøvetakeren (hvis prøvetaking samtidig) ikke forstyrrer prøvetakeren som ikke er levedyktig. For områder der luftstrømmen ikke er ensrettet eller luftstrømsmønsteret er ukjent, må du sørge for at det isokinetiske hodet vender vertikalt oppover.
MERK: Hvis roterende desinfeksjonsmiddel eller 70 % sIPA har blitt aerosolisert i nærheten av luftprøvetakeren, må du vente minst 5 minutter før prøvetakingssyklusen starter. - Start prøvetakingssyklusen, og gå sakte ut av prøvetakingsområdet for å unngå å forstyrre luftstrømmen.
KRITISK: Ikke aerosoliser væsker i nærheten av luftprøvetakeren under en prøvetakingssyklus, da dette vil føre til høye ikke-levedyktige tellinger. - Når prøvetakingen er fullført, hent laserpartikkeltelleren. Registrer gjennomsnittlig partikkelantall for 0,5 μm. Noen anlegg kan også spore og trende 5.0 μm.
- Gjenta trinnene 2.3.3-2.3.6 for neste prøvetakingssted. Hvis du flytter mellom rom eller BSC, tørk utsiden av den ikke-levedyktige partikkelprøvetakeren med 70% sIPA eller et godkjent desinfeksjonsmiddel. Unngå å få desinfeksjonsmiddel inne i isokinetisk hode, da dette kan føre til unøyaktige partikkeltall.
| Kategori | Media | Kulturforhold | Kultur observasjon | Resultater | ||||||
| Miljøovervåking | TSA (levedyktig luft) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dager | Slutt på inkubasjon | QA-gruppen for hvert anlegg bør etablere varslings- og tiltaksgrenser for hver prøvetakingstype og -plassering. Tiltaksgrenser for levedyktige prøver basert på ISO-klassifisering kan veiledes ved hjelp av PIC/S 009-16 (vedlegg) 18 og ISO-14644-1 7. Tiltaksgrenser for ikke-levedyktige luftprøver er vanligvis satt til en prosentandel av ISO-grensen (f.eks. 99%). Varslingsgrenser for levedyktige prøver er vanligvis satt til en prosentandel av tiltaksgrensen eller ISO-grensen (f.eks. 95 %). Se PDA TR-13 og USP<1116> for mer informasjon om etablering av varslings- og tiltaksnivåer og validering av utvalgte kulturforhold 8,9. | ||||||
| SAB (levedyktig luft) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dager | |||||||||
| TSALT (levedyktig overflate) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dager | Representative bilder av EM-plater er vist i figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5. | ||||||||
| SABLT (levedyktig overflate) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dager | |||||||||
| Prosessovervåking | TSA (sedimenteringsplate) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dager | Kun til informasjon. Gir nyttig informasjon i tilfelle en OOS-undersøkelse som svar på en mislykket produktsterilitetstest. | |||||||
| SAB (sedimenteringsplate) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dager | Se figur 6 for et eksempel på en positiv sedimenteringsplate. | ||||||||
| Prøvetaking av hanskede fingertuppene | TSALT | 30 °C-35 °C, luft, i minst 48 timer dager etterfulgt av 20 °C-25 °C i minst 5 dager 19. | Akseptabilitetskriteriene for GFS er <1 CFU / plate (dvs. ingen vekst) i henhold til PIC / S 009-16 (vedlegg) 18. Akseptabilitetskriterier kan endres etter skjønn av anlegget QA. | |||||||
| Testing av produktsterilitet | TSB (USP<71>) | 20 °C – 25 °C, luft, i minst 14 dager | Periodisk gjennom inkubasjonsperioden (dag 3, 5, 7 og 14) | Ingen vekst. | ||||||
| FTM (USP<71>) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 14 dager | |||||||||
| iFA+ (NIH-metoden) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 14 dager | Overvåking automatisk med BacT/ALERT Dual-T-instrumentet. Visuell kontroll av hver flaske på slutten av inkubasjonen for muggkuler anbefales sterkt. | Se figur 8 for et eksempel på synlige muggkuler som ikke ble automatisk oppdaget av BacT / ALERT. | |||||||
| iFN+ (NIH-metoden) | ||||||||||
| SAB (NIH-metoden) | 20 °C – 25 °C i minst 14 dager | Periodisk gjennom inkubasjonsperioden (dag 3, 5, 7 og 14) | ||||||||
Tabell 1: Oppsummering av anbefalte dyrkningsbetingelser og forventede resultater. Kulturbetingelsene som beskrives her er anbefalinger basert på et validert program som brukes ved NIH. Hver sluttbruker er pålagt å validere sitt eget mikrobiologiske testprogram. De mikrobielle kontroll- og teststrategiene kan variere mellom institutter avhengig av variabler, inkludert anleggsdesign, anleggsflora og produktrisikoklassifisering.
Figur 2: Vekst på TSALT-platen. TSALT-overflateprøvetakingsplaten viser tre CFUer av to forskjellige kolonimorfologier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kontaminering av TSALT-platen under oppsamling. TSALT-overflatekulturen viser en enkelt koloni på kanten av platen, noe som indikerer dårlig aseptisk håndtering under prøvetakingsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dyrkning oppnådd ved hjelp av et forurenset luftprøvetakingshode. Eksempel på en TSA-aktiv luftprøvetakingskultur som viser >100 kolonidannende enheter (CFU) av blandede morfologier. Vekstmønsteret indikerer forurensning av prøvetakingshodet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Ingen vekst på en TSA aktiv levedyktig luftplate. TSA aktiv levedyktig luftplate som ikke illustrerer vekst etter inkubasjon. Innrykk fra det aktive luftprøvetakingshodet kan sees på bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Prosessovervåking
- Sedimenteringsplater (passiv luftovervåking)
- Plasser merkede TSA- og SAB-plater i nærheten av arbeidsområdet, men i et område som ikke vil forstyrre testingen. Dokumenter prøvetakingens starttid, og åpne begge platene aseptisk, og plasser lokkene på en ren overflate i BSC vekk fra arbeidsområdet.
- Sedimenteringsplatene kan være åpne i maksimalt 4 timer for å forhindre at agaren tørker ut. Lukk lokkene på platene på slutten av behandlingen. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1. Figur 6 viser en enkelt koloniforurensning på en TSA-luftsedimenteringsplate.
- Hansket fingertuppprøvetaking (GFS)
- Få tak i to merkede TSALT-plater. Fjern aseptisk lokket på en plate og legg det på en ren arbeidsflate vekk fra prøvetakingsområdet.
- Rull forsiktig puten på hver finger og tommel på den ene hånden på overflaten av platen (figur 7). Ta en prøve av den største overflaten på hver finger/tommel i stedet for spissen. Bruk tilstrekkelig kraft til å lage små fordypninger på agar uten å sprekke agaroverflaten.
- Sett lokket aseptisk tilbake på platen, og gjenta trinn 3.2.2 for den andre hånden. Desinfiser hendene med 70% sIPA ved ferdigstillelse av prøvetaking. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1.
Figur 6: Vekst på en TSA-luftsedimenteringsplate. En TSA-luftsedimenteringsplate som illustrerer en enkelt koloni av et forurensende stoff dyrket under passiv luftprosessovervåking i BSC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Hanskeprøvetaking med fingertuppene. Den riktige metoden for å ta hanskede fingertuppprøver med det største overflatearealet (eller puten) av hver finger/tommel er vist til venstre. Feil prosess der bare fingertuppen er samplet, vises til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Sterilitetstesting ved direkte produktinokulering
- Direkte inokulering etter USP<71>
- Få tak i en merket tryptisk soyabuljongflaske (TSB) og en merket væsketioglykolatmedium (FTM) flaske for hver testartikkel som sendes inn. For testøkten, skaff en TSALT og en SABLT for levedyktig overflateprøvetaking, en TSA- og en SAB-plate for sedimentering av plater, og to TSALT-plater for GFS.
- Kjole for arbeid inne i BSC i henhold til trinn 1.2. Rengjør BSC i henhold til trinn 1.4. Fest materialene i BSC i henhold til trinn 1.5. Utfør kontaktprøvetaking av det kritiske arbeidsområdet i henhold til trinn 2.1, tørk overflaten med 70% sIPA etter prøvetaking. Forbered TSA- og SAB-sedimenteringsplatene nær arbeidsområdet i henhold til trinn 3.1.
- Få tak i testartikkelen og tilhørende TSB- og FTM-flasker. Hvis TSB- og FTM-flaskene har en septum, fjern beskyttelseshettene fra hver flaske og tørk septum med en steril alkoholserviett. Hvis TSB- og FTM-flaskene har en skrukork, løsner du korken fra flaskene (men ikke fjern korken).
- Vortex testartikkelen for å sikre en homogen suspensjon. Inokuler flaskene med det validerte volumet av testartikkelen (opptil 10 ml/flaske) ved hjelp av en steril sprøyte og en hypodermisk nål (for septumhetter) eller en pipettor (for skrukork).
- Etter inokulering, tørk septum med en steril alkoholserviett, og sett inn en steril ventilasjonsenhet for å tillate luftutveksling under inkubasjon. For skrueflasker, lukk flasken, men la korken være 1/4 til 1/2 en sving løs for å tillate luftutveksling under inkubering. Gjenta trinn 4.1.3–4.1.5 for hver testartikkel som skal testes i den økten.
- Lukk sedimenteringsplatene for TSA og SAB aseptisk og dokumenter sluttidspunktet for prøvetakingen. Utfør GFS i henhold til trinn 3.2, tørk hanskene med 70% sIPA etter prøvetaking. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1.
- Overfør alle testmaterialene ut av BSC, og rengjør BSC i henhold til trinn 1.4.
- Direkte inokulasjon etter NIH Alternative Sterility Testing Method
- Få en merket i FA +, en merket iFN + og en SAB-plate for hver testartikkel. For testøkten, skaff en TSALT og en SABLT for levedyktig overflateprøvetaking, en TSA- og en SAB-plate for sedimentering av plater, og to TSALT-plater for GFS.
- Kjole for arbeid inne i BSC i henhold til trinn 1.2. Rengjør BSC i henhold til trinn 1.4. Fest materialene i BSC i henhold til trinn 1.5. Utfør kontaktprøvetaking av det kritiske arbeidsområdet i henhold til trinn 2.1, tørk overflaten med 70% sIPA etter prøvetaking. Forbered TSA- og SAB-sedimenteringsplatene nær arbeidsområdet i henhold til trinn 3.1.
- Hent testartikkelen og tilhørende i FA+, iFN+ og SAB-plate. Fjern beskyttelseshettene fra iFA + og iFN + flasker, og tørk septum med en steril alkoholserviett.
- Vortex testartikkelen for å sikre en homogen suspensjon. Inokuler flaskene med det validerte volumet av testartikkelen (opptil 10 ml/flaske) ved hjelp av en steril sprøyte og hypodermisk nål. Tørk septum med en steril alkoholserviett etter inokulering. Inkuber flaskene på BacT/ALERT Dual-T-instrumentet som beskrevet i tabell 1.
- Bruk en pipettor, inokuler SAB-platen med den validerte mengden av testartikkelen (ikke mer enn 500 μL/plate), og strek for isolering ved hjelp av en steril sløyfe. La stå i 10 minutter for å sikre at prøven ikke løper på platelokket når den vendes for inkubering. Plasser hver SAB-plate inokulert med testartikkelen i en plastpose, bind løst og inkuber som beskrevet i tabell 1.
- Lukk sedimenteringsplatene for TSA og SAB aseptisk og dokumenter sluttidspunktet for prøvetakingen. Utfør GFS som beskrevet i trinn 3.2, og tørk av hanskene med 70 % sIPA etter prøvetaking. Pakk platene løst, og rug på kulturene som beskrevet i tabell 1. Visuell inspeksjon av BacT/ALERT-flaskene på slutten av inkubasjonsperioden er avgjørende for å oppdage muggkuler som kan ha gått uoppdaget av instrumentet (figur 8).
- Overfør alle testmaterialene ut av BSC, og rengjør BSC i henhold til trinn 1.4.
Figur 8: Vekst av mugg som ikke ble oppdaget av BacT/ALERT. Eksempel på muggkuler, synlige for det blotte øye, som ikke ble oppdaget automatisk av BacT/ALERT-systemet. Basert på disse funnene anbefaler vi terminal visuell inspeksjon av alle BacT / ALERT-flasker og tilsetning av SAB-platen for soppkultur ved hjelp av NIH Alternative Sterility Testing Method. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forventede resultatene er beskrevet i tabell 1. EM-dataene bør gjennomgås og følges opp med en passende undersøkelse og respons på tiltak, varsling eller ISO-grenseutflukter. Hvis det oppstår en ekskursjon for ikke-levedyktige partikler, bør man fortsette i henhold til ISO 14644-vedlegg A, avsnitt A.5.57. Dersom ekskursjonen kan tilskrives en umiddelbart identifiserbar unormal forekomst, bør de opprinnelige prøvetakingsresultatene dokumenteres, det bør legges til en merknad for å se bort fra de opprinnelige resultatene, og en detaljert beskrivelse av den unormale forekomsten bør gis. En annen prøve kan tas på det aktuelle stedet. Dersom ekskursjonen ikke kan tilskrives en umiddelbart identifiserbar unormal forekomst, må prøvetakingsresultatet dokumenteres. Ta et nytt sett med ikke-levedyktige prøver på det aktuelle stedet umiddelbart etter å ha identifisert OOS-resultatet (out of specification). Dette kan brukes som en del av etterforskningen. I henhold til ISO 14644-vedlegg A, avsnitt A.5.6, undersøke OOS-funnet og utbedre den identifiserte grunnårsaken.
En mislykket produktsterilitetstest vil resultere i turbiditet i USP<71> kultur eller vekst i BacT / ALERT-flasker og / eller SAB-plate (figur 8). Organismen skal identifiseres på artsnivå, og passende følsomhetstesting bør utføres hvis klinisk berettiget. En undersøkelse bør fullføres av testlaboratoriet for å avgjøre om OOS-resultatet er gyldig eller om det var en potensiell laboratoriefeil som kan ha bidratt til OOS. Testing av retensjonsprøven anbefales på det sterkeste. Beslutningen om å holde tilbake eller frigi legemidlet til infusjon skal tas av pasientens kliniske behandlingsteam og av teamet for produksjon, mikrobiologi, infeksjonssykdommer, kvalitetssikring og regulatoriske forhold. For HCT/Ps som allerede kan ha blitt infundert basert på foreløpig testing i prosessen, bør pasienten overvåkes nøye, og en hendelsesrapport skal sendes til riktig tilsynsorgan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske områder i denne protokollen, inkludert vedlikehold av aseptisk teknikk og ensrettet luftstrøm i renrom og BSC. Beste praksis inkluderer å bevege seg sakte og bevisst for å minimere turbulens. Aseptiske manipulasjoner skal utføres fra siden av produktet, ikke ovenfra. Lukket systembehandling og bruk av terminalt steriliserte råvarer anbefales. Å snakke i kritiske områder og lene seg mot vegger eller utstyr bør unngås. På samme måte bør unødvendig berøring av ikke-sterile gjenstander og plukking av falne gjenstander unngås til den sterile behandlingen er fullført. Materialene i BSC skal ordnes for å forhindre blokkering av luftstrømmen og for å opprettholde ensrettet bevegelse fra ren til skitten. Operatørbevegelser inn og ut av BSC bør minimeres. Dokumentasjonen av alle aktiviteter, inkludert partinummer, utløpsdatoer, kalibreringsdatoer, start-/stopptider og testpersonell for alle materialer, utstyr og prosesser i en prøvetakings- eller testøkt, er også kritisk.
EM-prosedyren beskrevet her er avhengig av manuell inkubasjon og kolonitelling. Utformingen av et EM-program er etter sluttbrukerens skjønn. Prøvetakingsstedene og testfrekvensen skal styres av PDA Technical Report 13 8 og begrunnes med en risikovurdering som omfatter laboratoriearbeidsflyten, produktnærhet, anleggskritikalitet, varighet og antall ansatte for hvert arbeidsflyttrinn8. Et typisk EM-program bør inkludere de totale luftpartiklene (0,5 μm ikke-levedyktige partikler), levedyktig luftprøvetaking (1000 L) og levedyktig overflateprøvetaking samlet under dynamiske forhold med en frekvens basert på produktrisiko og historiske trender. Ukentlig prøvetaking anbefales generelt for nye anlegg inntil tilstrekkelige datatrender er etablert. Generell veiledning for EM og kulturforhold er gitt i tabell 1 og i USP<1116>9; Andre har imidlertid evaluert forskjellige kulturforhold, for eksempel medium som var begrenset til TSA / TSALT, og forskjellige inkubasjonstemperaturer, inkludert doble temperaturer10,11. Automatiserte EM-instrumenter som kombinerer inkubasjon med kolonitellingsplateavlesning, brukes ofte i det farmasøytiske markedet som raske metoder 8,12. Det valgte EM-programmet må valideres og er vanligvis avhengig av anleggsfloraen, inkubatorkapasitet, testvolum og personellkapasitet. Videre bør et etablert EM-program ha en aktiv livssyklus, med relevante justeringer gjort på innsamlingsstedene, testfrekvens og / eller varslings- / handlingsgrenser basert på en årlig gjennomgang og en datadrevet risikovurdering8. Store endringer i EM-trender kan utløse revurdering av rengjøringsprogrammet. Desinfeksjonsmidler skal valideres via en desinfiserende effektstudie ved bruk av representative materialoverflater mot anleggsflora for den foreskrevne kontakttiden, som beskrevet i USP<1072>13. Typiske desinfeksjonsmidler kan inkludere vesfen III (kontakttid: 10 min), LpH III (kontakttid: 10 min), og et sporicid middel som Peridox RTU (kontakttid: 5 min). For beste praksis bør desinfeksjonsmidler roteres månedlig, og uttak, mekaniske tilkoblinger og arbeidsflater som er under utstyr i BSC, bør rengjøres rutinemessig.
Minste produktvolum som må testes for sterilitet er definert i USP<71>3 og er basert på det totale sluttproduktvolumet. Dessverre ble USP<71> opprinnelig designet for sterile legemiddelprodukter og er anerkjent for å være uegnet for produkter med kort holdbarhet på grunn av langsom behandlingstid og høyt produkttestvolum14. USP<1071> anerkjenner at alternative raske mikrobielle metoder kan være fordelaktige, og at lavere produkttestvolumer kan være akseptabelt når en risikobasert tilnærming er brukt14. Gitt begrensningene i USP<71> for sterilitetstesting av cellulære terapiprodukter, har alternative metoder som automatiserte BacT / ALERT respirasjonsmetoder blitt brukt i industrien 1,4,6. Imidlertid krever enhver bruk av en alternativ testmetode streng sluttbrukervalidering for å demonstrere ikke-underlegenhet til den kompendielle USP<71>metoden for det produktet 5,15,16. Metodeegnethetstesting for hvert nytt produkt er også nødvendig for å sikre at produktet, ved valgt inokulasjonsvolum og testbetingelser, ikke er hemmende for påvisning av kontaminanter på lavt nivå6. Det er derfor mulig at testvolum og inokulasjonsvolum kan variere mellom produktene avhengig av utfallet av valideringsstudiene. Membranfiltrering, en sekundær metode skissert i USP<71>, kan brukes til å prøve et større prøvevolum i en enkelt test. Validering og metodeegnethetstesting bør inkludere organismer utover de seks kompendielle QC-isolatene. Det bør fokuseres på ofte gjenvunnet anleggsflora og tidligere produktkontaminanter. Spesiell oppmerksomhet bør gis til sopp, da respirasjonsmetoder alene har vist suboptimal ytelse 4,17, og derfor inkluderer NIH Alternative Sterility Testing Method en parret soppkultur på SAB og en terminal visuell inspeksjon av BacT / ALERT-flasker.
En stor begrensning for ethvert mikrobielt kontrollprogram er den retrospektive naturen der resultatene er tilgjengelige. Gullstandardtesting er kulturbasert, noe som er langsomt og kan føre til konstante reaktive tiltak for korrigerende tiltak. Raskere testmetoder krever streng validering, men disse kan fortsatt ikke gi sanntidssikring av mikrobiell overvåking og kontroll. Videre fanger mikrobiologiske kulturer bare en liten delmengde av tid under en produksjons- eller testøkt. Det er derfor avgjørende at aktiv mikrobiell overvåking skjer hyppig og risikobegrunnet for å sikre at trenddataene er veletablerte. Dette vil muliggjøre bruk av hensiktsmessig fastsatte varslingsgrenser for å forutsi potensielle avvik fra mikrobiell kontroll før de oppstår.
Etableringen av et robust cGTP/cGMP-program tar tid og krefter, og kan dessverre ikke bare overføres fra ett anlegg til et annet. USA Food and Drug Administration forventer at alle programmer gjennomgår sluttbruker validering testing til tross for den potensielle tilgjengeligheten av tredjeparts publiserte resultater som viser deres effekt. Derfor kan mikrobielle kontroll- og teststrategier variere mellom institutter, avhengig av variabler, inkludert anleggsdesign, anleggsflora og produktrisikoklassifisering. Strategiene som er skissert i denne protokollen bidrar til å gi et rammeverk for å etablere et robust mikrobielt overvåkings- og kontrollprogram for cGTP / cGMP-laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Intramural Research Program fra National Institutes of Health Clinical Center. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-25°C Incubator | Lab preference | ||
| 30-35°C Incubator | Lab preference | ||
| Alcohol-based hand sanitizer | Lab preference | ||
| BacT/ALERT Dual-T instrument | BioMerieux Industry | ||
| Beard cover | Lab preference | ||
| Biosafety cabinet (BSC) | Lab preference | ||
| Cleanroom shoes | Lab preference | ||
| Fluidthioglycollate medium (FTM) | Hardy Diagnostics | U84 | USP |
| Handheld cleaning mop | Contec | 2665LF | |
| Hypodermic needle | Lab preference | ||
| iFA+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412991 | |
| Isokinetic head | Lab preference | ||
| Laser particle counter | TSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Mirror | Lab preference | ||
| Non-sterile bouffant | Lab preference | ||
| Non-sterile gloves | Lab preference | ||
| Non-sterile shoe covers | Lab preference | ||
| Non-sterile sleeve covers | Lab preference | ||
| Parafilm | Lab preference | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastic bag | Lab preference | ||
| Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, irradiated |
| Sabouraurd Dextrose Agar (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, irradiated |
| Safety glasses | Lab preference | ||
| Scrubs (top and bottom) | Lab preference | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterile alcohol wipe | Lab preference | ||
| Sterile boot covers | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile coveralls | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile face mask | Lab preference | ||
| Sterile gloves | Lab preference | ||
| Sterile hood | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile low-lint wipes | Texwipe | TX3210 | |
| Sterile mop cleaning pads | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterile sleeve covers | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterile spreading rod | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterile syringe | Lab preference | ||
| Tacky mats | Lab preference | ||
| Tryptic Soy Agar (TSA) | Hardy Diagnostics | W570R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT) | Hardy Diagnostics | P520R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Hardy Diagnostics | U46 | USP |
| Tubing | Lab preference | ||
| Vesphene III | Steris | 1S15CX | |
| Viable air sampler | Hardy Diagnostics | BAS22K | |
| Vortex | Lab preference |
References
- Cundell, T., Atkins, J. W., Lau, A. F. Sterility testing for hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Microbiology. , 10.1128/jcm.01654-22 (2023).
- United States Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice. United States Food and Drug Administration. , (2004).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- England, M. R., Stock, F., Gebo, J. E. T., Frank, K. M., Lau, A. F. Comprehensive evaluation of compendial USP<71>, BacT/Alert Dual-T, and Bactec FX for detection of product sterility testing contaminants. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01548 (2019).
- Gebo, J. E. T., East, A. D., Lau, A. F. A side-by-side comparison of clinical versus current good manufacturing practices (cGMP) microbiology laboratory requirements for sterility testing of cellular and gene therapy products. Clinical Microbiology Newsletter. 43 (21), 181-191 (2021).
- Gebo, J. E. T., Lau, A. F. Sterility testing for cellular therapies: What is the role of the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 58 (7), 01492 (2020).
- International Organization for Standardization. ISO 14644-1:2015 Cleanrooms and associated controlled environments - Part 1: Classification of air cleanliness by particle concentration. International Organization for Standardization. , (2015).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 13 Revised 2022 (TR 13) Fundamentals of an Environmental Monitoring Program. Parenteral Drug Association, Inc. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1116> Microbiological Evaluation of Cleanrooms and Other Controlled Environments in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Guinet, R., et al. Multicenter study on incubation conditions for environmental monitoring and aseptic process simulation. PDA journal of pharmaceutical science and technology. 71 (1), 43-49 (2017).
- Gordon, O., Berchtold, M., Staerk, A., Roesti, D. Comparison of different incubation conditions for microbiological environmental monitoring. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 68 (5), 394-406 (2014).
- Anders, H. J., et al. Multisite qualification of an automated incubator and colony counter for environmental and bioburden applications in pharmaceutical microbiology. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1071> Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products: A Risk-Based Approach in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. PUSP<1223> Validation of Alternative Microbiological Methods in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 33, Revised 2013 (TR 33) Evaluation, Validation and Implementation of Alternative and Rapid Microbiological Methods. Parenteral Drug Association, Inc. , (2013).
- Putnam, N. E., Lau, A. F. Comprehensive study identifies a sensitive, low-risk, closed-system model for detection of fungal contaminants in cell and gene therapy products. Journal of Clinical Microbiology. 59 (11), 0135721 (2021).
- Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation. Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes (PE 009-16 (Annexes)). Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<825> Radiopharmaceuticals - Preparation, Compounding, Dispensing, and Repackaging in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
