Summary
Protokollet sammanfattar bästa praxis för att minimera mikrobiell biobelastning i en renrumsmiljö och inkluderar strategier som miljöövervakning, processövervakning och produktsterilitetstestning. Den är relevant för tillverknings- och testanläggningar som måste uppfylla gällande standarder för god vävnadssed och gällande standarder för god tillverkningssed.
Abstract
Ett väl validerat och holistiskt program som innehåller robusta klänningar, rengöring, miljöövervakning och personalövervakningsåtgärder är avgörande för att minimera den mikrobiella biobelastningen i tillverkningssviter för cellterapi och motsvarande testlaboratorier för att säkerställa att anläggningarna fungerar i ett tillstånd av kontroll. Att säkerställa produktsäkerhet genom kvalitetskontrollåtgärder, såsom sterilitetstestning, är ett lagstadgat krav för både minimalt manipulerade (avsnitt 361) och mer än minimalt manipulerade (avsnitt 351) mänskliga celler, vävnader och cellulära och vävnadsbaserade produkter (HCT / P). I den här videon tillhandahåller vi en stegvis guide för hur man utvecklar och införlivar de bästa aseptiska metoderna för drift i renrumsmiljö, inklusive klänning, rengöring, iscensättning av material, miljöövervakning, processövervakning och produktsterilitetstestning med direkt inokulering, som tillhandahålls av United States Pharmacopeia (USP<71>) och National Institutes of Health (NIH) Alternative Sterility Testing Method. Detta protokoll är avsett som en referensguide för anläggningar som förväntas uppfylla nuvarande god vävnadssed (cGTP) och nuvarande god tillverkningssed (cGMP).
Introduction
Implementering av ett starkt mikrobiellt övervakningsprogram genom miljöövervakning (EM), processövervakning och produktsterilitetstestning är ett lagstadgat krav för nuvarande god vävnadspraxis (cGTP) och nuvarande god tillverkningssed (cGMP) i cellterapilaboratorier1. Dessutom förväntar sig United States Food and Drug Administration (FDA) att laboratoriet som utför kvalitetskontrollen (QC) av produkten också bör använda anläggningar och kontroller som är jämförbara med dem som används för aseptisk fyllning2.
Detta protokoll har fyra huvudavsnitt: 1) Aseptiska metoder, inklusive personalrock, rengöring och iscensättning av material; 2) EM, inklusive livskraftiga luft- och ytkulturer och övervakning av icke-livskraftig partikelluft. 3) processövervakning, inklusive sedimenteringsplattor och provtagning av handskar på fingertopparna, och 4) produktsterilitetstestning via kompendial United States Pharmacopeia (USP) <71> metod3 eller NIH Alternative Sterility Testing Method4. När de används tillsammans kan dessa åtgärder vara en effektiv metod för att säkerställa att en anläggning förblir i ett tillstånd av kontroll.
De tekniker som beskrivs här är inte nya; Nuvarande standarder från tillsynsmyndigheter och yrkesorganisationer saknar dock detaljer, vilket har lett till frånvaro av mikrobiell övervakning eller implementering av icke-standardiserade metoder, särskilt i akademiska centra där tillverkning på plats och produktsterilitetstestning växer fram i snabb takt 1,5,6 . Detta protokoll kan användas som en guide för att skapa ett mikrobiellt övervaknings- och kontrollprogram som uppfyller lagstadgade krav när det används tillsammans med slutanvändarvalidering och riskbedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aseptiska metoder
- Personalklänning för ett renrumsutrymme
OBS: Denna procedur är baserad på inledande klänning i ett oklassificerat utrymme, följt av inträde i ett International Organization for Standardization (ISO) 8-område och sedan ett ISO7-område. Denna procedur är relevant för laboratorier som försöker omvandla befintligt utrymme till en renrumsfunktion. Helst skulle all initial klänning ske i ett ISO8-klassificerat utrymme (inte i ett oklassificerat utrymme).- Säkra löst hår. Tvätta händerna och byt till scrubs (långärmade skrubbtoppar och skrubbbyxor i full längd är att föredra). Samla och byt till renrumsskor med skoskydd på.
- Sanera händerna med en alkoholbaserad handdesinfektionsmedel först och sedan igen mellan vart och ett av följande steg: ta på dig icke-sterila handskar och sedan ett skäggskydd (för valfri mängd synligt ansiktshår), om tillämpligt. Don en icke-steril bouffant och täck underarmarna med icke-sterila ärmar om långärmade skrubbtoppar inte har använts.
- Ta bort skoskydden och kliv upp på den klibbiga mattan framför ISO8-förrumsdörren med varje fot efter att skoskyddet har tagits bort. Se till att hela foten kommer i kontakt med den klibbiga mattan före inträde. Kassera skoskydden och sanera handskarna och dörrhandtaget med 70% steril isopropylalkohol (sIPA). Gå in i ISO8-förrummet.
- Samla en steril huva, steril ansiktsmask, sterila overaller, sterila stövelskydd och skyddsglasögon. Dekontaminera handskarna med 70% sIPA. Ta på dig skyddsglasögon och placera materialet på en ren yta enligt steg 1.5.
- Ta på dig ett par nya icke-sterila skoskydd över de dedikerade renrumsskorna och kliv upp på den klibbiga mattan framför det sekundära förrummet. Se till att hela foten kommer i kontakt med den klibbiga mattan. Dekontaminera handskarna med 70% sIPA. Samla ihop de iscensatta klänningstillbehören och gå in i det sekundära ISO7-förrummet, kvar på den smutsiga sidan av avgränsningslinjen.
- Don den sterila huven och den sterila overallen, vidrör endast insidan av klänningsmaterialet och se till att huvens hals är instoppad inuti overallen för att skapa en komplett tätning. Don de sekundära sterila stövelskydden. Dekontaminera handskarna med 70% sIPA mellan varje påtagningssteg.
- Kontrollera att klänningen har tagits på rätt sätt, sanera handskarna med 70% sIPA och gå in i ISO7-utrymmet.
OBS: Kontrollera regelbundet klänningsmaterialet för integritet. Om det äventyras, lämna renrummet omedelbart och klä om det.
- Donning för ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC)
- Klänning enligt steg 1.1 ovan med dessa ytterligare metoder.
- Samla sterila handskar och sterila ärmar. Rengör BSC enligt steg 1.4 och mellanlagra materialen enligt steg 1.5. Dekontaminera handskarna med 70% sIPA.
- Donera aseptiskt sterila ärmar över overallen, med hjälp av tumhällor om sådana finns. Don sterila handskar över befintliga handskar, se till att handskens manschett sträcker sig över den sterila hylsan. Dekontaminera handskarna med 70% sIPA mellan varje steg. Gå in i BSC.
OBS: Kontrollera regelbundet klänningsmaterialet för integritet. Om det äventyras, lämna renrummet omedelbart och klä om det.
- Doffing av klänningsmaterialet
- Lämna BSC och ta försiktigt bort det övre paret handskar och sterila ärmar. Dekontaminera innerhandskarna med 70% sIPA.
- Gå in i det sekundära och sedan primära förrummet och vänta på att dörren stängs helt mellan varje steg. Ta bort materialen i följande ordning: yttre sterila stövelskydd, overall, huva och ansiktsmask.
- Gå ut ur det primära förrummet och ta bort den icke-sterila klänningen.
OBS: Ordningen för borttagning i det oklassificerade utrymmet är inte viktig; De inre icke-sterila skoskydden bör dock finnas kvar på renrumsskorna för förvaring i icke-klassificerade utrymmen. - Sanera händerna med en alkoholbaserad handdesinfektionsmedel och återgå till gatukläder.
- Rengöring av renrumsytorna och BSC
- Montera en handhållen rengöringsmopp eller skaffa en ren våtservett med låg ludd. Om du använder en våtservett med låg ludd viker du servetten i fjärdedelar och roterar mellan varje yta. Mätta mopphuvudet eller våtservetten med låg ludd med ett godkänt desinfektionsmedel.
- Arbeta bakifrån och framifrån (eller uppifrån och ned) och rengör BSC med överlappande våtservetter i följande ordning: HEPA-diffusorgrillen (toppen av BSC), BSC: s bakvägg, båda sidoväggarna på BSC, bågen och arbetsytan. Torka slutligen av skärmen på BSC med 70% sIPA för att avlägsna eventuellt kvarvarande desinfektionsmedel. Se figur 1 för ett typiskt BSC-rengöringsmönster.
- Iscensättning av material och utrustning i klassificerade miljöer
- Dekontaminera (dvs. stega) alla material som kräver överföring från ett icke-klassificerat eller lägre klassificerat område till ett högre klassificerat område (t.ex. från ett ISO8- till ISO7-utrymme) för att minimera överföringen av mikrober. Överföring av material mellan områden med samma ISO-klassificeringsnivå kräver inte mellanlagring.
OBS: Om materialet har steriliserats och ligger i flera påsar, ta bort den yttre påsen / påsen och flytta materialet till det klassificerade utrymmet; Avtorkning av den inre påsen/påsen är inte nödvändig. - Skaffa en våtservett med lågt ludd och vik servetten i fjärdedelar för att rotera till en ren sida när servetten blir smutsig. Mätta servetten med 70% sIPA eller godkänt desinfektionsmedel.
- Torka av utsidan av materialet/utrustningen med överlappande våtservetter. Se till att alla delar av föremålet torkas, inklusive insidan av utdragbara förpackningsförseglingar och skrymslen / indrag på utrustningen och andra oregelbundet formade tillbehör. För utrustning på hjul, se till att hela hjulet har torkats av under mellanlagringsprocessen (utrustningen kan behöva tippas försiktigt för att hjulen ska kunna roteras).
- Dekontaminera (dvs. stega) alla material som kräver överföring från ett icke-klassificerat eller lägre klassificerat område till ett högre klassificerat område (t.ex. från ett ISO8- till ISO7-utrymme) för att minimera överföringen av mikrober. Överföring av material mellan områden med samma ISO-klassificeringsnivå kräver inte mellanlagring.
Figur 1: Exempel på ett BSC-rengöringsmönster. Arbeta bakifrån och framifrån (eller uppifrån och ned) och rengör BSC med överlappande våtservetter i följande ordning: HEPA-diffusorgrillen (toppen av BSC), BSC: s bakvägg, båda sidoväggarna på BSC, bågen och arbetsytan. Torka slutligen av skärmen på BSC med 70% sIPA för att avlägsna eventuellt kvarvarande desinfektionsmedel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Miljöövervakning (EM)
- Livskraftig ytprovtagning
- Iscensätt de material som behövs för provtagningen enligt steg 1.5 och klä in i det klassificerade utrymmet enligt avsnitt 1.
OBS: Ytprovtagningen bör utföras före luftprovtagningen på en angiven plats. Om du använder flera plattor för att ytprovta ett område ska du inte ta prov på exakt samma plats. Använd kontaktplattor endast för att ta prov på plana ytor för att säkerställa full kontakt och för att undvika potentiell skada på agaren. - Samla upp och märk en tryptisk sojaagar med lecitinas och tween (TSALT) platta och en Sabouraud dextrosagar med lecitinas och tween (SABLT) platta för varje provtagningsställe. Håll botten av plattan med ena handen, ta bort locket aseptiskt och var försiktig så att du inte vidrör den upphöjda agarytan.
- Vidrör den upphöjda agaren till ytan som provtas, se till att hela ytan är i kontakt och tryck hårt på plattan. Låt plattan stå i kontakt med ytan i minst 5 sekunder.
- KRITISK: Flytta inte plattan i sidled över ytan som provtas, eftersom detta kan sprida potentiell tillväxt över ytan, vilket gör upplösningen av enskilda kolonier svår. Utöva inte överdriven kraft på kontaktplattan under provtagningen, eftersom agarytan kan spricka.
- Byt ut locket aseptiskt och var försiktig så att du inte vidrör den upphöjda agarytan. Lås locket på plats om kontaktplattan har ett låssystem. Rengör provtagningsområdet med 70% sIPA för att avlägsna eventuellt kvarvarande medium från ytan. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1. En representativ bild som visar tillväxten av tre kolonibildande enheter (CFU) med två distinkta kolonimorfologier på en provtagningsplatta på TSALT-ytan illustreras i figur 2. Figur 3 visar kontaminering av en TSALT-platta med tillväxt på plattans kant, vilket kan tillskrivas dålig aseptisk teknik under provtagningen.
- Iscensätt de material som behövs för provtagningen enligt steg 1.5 och klä in i det klassificerade utrymmet enligt avsnitt 1.
- Livskraftig luftprovtagning
- Iscensätt de material som behövs för provtagningen enligt steg 1.5 och klä in i det klassificerade utrymmet enligt avsnitt 1.
- Samla upp och märk en tryptisk sojaagarplatta (TSA) och en Sabouraud-dextrosagarplatta (SAB) för varje provtagningsställe. Förbered luftprovtagaren genom att aseptiskt ta bort provtagningshuvudet genom att endast ta tag i ytterkanten för att undvika kontaminering av huvudet.
- Håll provtagningshuvudet i ena handen och placera mediet aseptiskt i platthållaren på provtagaren. Om det finns ett stift som är längre än de andra, sätt först in mediet mot det längre stiftet och tryck sedan ner plattan i de återstående stiften för att säkra plattan.
- Ta bort locket på plattan aseptiskt och placera det på en rengjord yta ur vägen tills provtagningen har slutförts. Byt ut och säkra provtagningshuvudet aseptiskt och grip bara tag i ytterkanten för att undvika kontaminering av huvudet. Upprepa steg 2.2.2-2.2.4 för det återstående mediet om du använder en luftprovtagare med flera huvuden.
- Placera luftprovtagaren på provtagningsplatsen med provtagningshuvudena vända i den övervägande riktningen för luftflödesrörelsen. Se till att avgaserna från den icke-viabla luftprovtagaren (om provtagning sker samtidigt) inte stör provtagaren. Se till att luftprovtagaren är inställd på de validerade inställningarna och starta provtagningscykeln.
- När provtagningscykeln har avslutats, avlägsna provtagningshuvudet aseptiskt från provtagaren genom att endast ta tag i ytterkanten för att undvika kontaminering av huvudet. Håll provtagningshuvudet i ena handen och sätt aseptiskt tillbaka locket på agarplattan. Ta bort plattan från platthållaren. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1.
- Desinficera provtagningshuvudet och området runt platthållaren med 70% sIPA. Säkra provtagningshuvudet aseptiskt och grip endast ytterkanten. Upprepa steg 2.2.6 och steg 2.2.7 för det återstående mediet om du använder en flerhövdad luftprovtagare.
OBS: Figur 4 visar en TSA-aktiv luftprovtagningskultur med tillväxt orsakad av ett förorenat provtagningshuvud. Omvänt representerar figur 5 en TSA-aktiv luftprovtagningskultur utan tillväxt. Luftindrag från provtagningshuvudet kan ses på bilden.
- Icke-livskraftig provtagning
- Utför en nollkontroll på laserpartikelräknaren före provtagningsaktiviteterna för varje användningsdag. Fäst det isokinetiska huvudet på provtagningsporten på partikelräknaren, antingen direkt eller fäst vid en slanglängd efter behov för provtagningsplatsen.
- Om slangar appliceras, använd en kort längd, eftersom slangar >1 m långa kan orsaka problem med att räkna upp partiklar på ≥1 μm och kan också leda till onödiga böjningar i röret. Kontrollera att partikelräknaren är inställd på de verifierade inställningarna. Det rekommenderas att ställa in en fördröjning på cirka 30 s för att tillåta utträde ur provtagningsområdet för att undvika avbrott i luftflödet under provtagningen.
- Placera laserpartikelräknarens isokinetiska huvud på provtagningsplatsen med det isokinetiska huvudet vänt mot den dominerande riktningen för luftflödesrörelsen. Se till att avgaserna från provtagaren för livskraftig luft (om provtagning sker samtidigt) inte stör den icke-viabla provtagaren. För områden där luftflödet inte är enkelriktat eller luftflödesmönstret är okänt, se till att det isokinetiska huvudet är vänt vertikalt uppåt.
OBS: Om roterande desinfektionsmedel eller 70% sIPA har aerosoliserats nära luftprovtagaren, vänta minst 5 minuter innan provtagningscykeln påbörjas. - Starta provtagningscykeln och lämna långsamt provtagningsområdet för att undvika att luftflödet störs.
KRITISK: Aerosolisera inte vätskor nära luftprovtagaren under en provtagningscykel, eftersom detta kommer att orsaka höga icke-livskraftiga räkningar. - När provtagningen är klar hämtar du laserpartikelräknaren. Registrera det genomsnittliga partikelantalet för 0,5 μm. Vissa anläggningar kan också spåra och trenda 5,0 μm.
- Upprepa stegen 2.3.3-2.3.6 för nästa provtagningsplats. Om du flyttar mellan rum eller BSC, torka utsidan av den icke-livskraftiga partikelprovtagaren med 70% sIPA eller ett godkänt desinfektionsmedel. Undvik att få desinfektionsmedel inuti det isokinetiska huvudet, eftersom det kan leda till felaktiga partikelantal.
| Kategori | Media | Kulturella förhållanden | Kultur observation | Resultat | ||||||
| Miljöövervakning | TSA (livskraftig luft) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dagar | Slut på inkubation | QA-gruppen för varje anläggning bör fastställa varnings- och åtgärdsgränser för varje provtagningstyp och plats. Åtgärdsgränser för viabla prover baserade på ISO-klassificering kan styras med hjälp av PIC/S 009-16 (bilagorna) 18 och ISO-14644-1 7. Åtgärdsgränser för icke-livskraftiga luftprover fastställs vanligtvis till en procentandel av ISO-gränsen (t.ex. 99 %). Varningsgränser för genomförbara prover är vanligtvis inställda på en procentandel av åtgärdsgränsen eller ISO-gränsen (t.ex. 95%). Se PDA TR-13 och USP<1116> för mer information om upprättande av varnings- och åtgärdsnivåer och validering av utvalda kulturförhållanden 8,9. | ||||||
| SAB (livskraftig luft) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dagar | |||||||||
| TSALT (livskraftig yta) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dagar | Representativa bilder av EM-plattor visas i figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5. | ||||||||
| SABLT (livskraftig yta) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dagar | |||||||||
| Övervakning av processer | TSA (sedimenteringsplatta) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 3 dagar | Endast för information. Ger användbar information i händelse av en OOS-undersökning som svar på ett misslyckat produktsterilitetstest. | |||||||
| SAB (sedimenteringsplatta) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 7 dagar | Se figur 6 för ett exempel på en positiv sedimenteringsplatta. | ||||||||
| Handske fingertoppsprovtagning | TSALT | 30 °C–35 °C, luft, i minst 48 timmar dagar följt av 20 °C–25 °C i minst 5 dagar 19. | Acceptanskriterierna för GFS är <1 CFU/platta (dvs. ingen tillväxt) enligt PIC/S 009-16 (bilagor) 18. Acceptanskriterier kan ändras efter bedömning av facilitet QA. | |||||||
| Test av produktsterilitet | TSB (USP<71>) | 20 °C-25 °C, luft, i minst 14 dagar | Periodiskt under inkubationsperioden (dag 3, 5, 7 och 14) | Ingen tillväxt. | ||||||
| FTM (USP<71>) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 14 dagar | |||||||||
| iFA+ (NIH-metod) | 30 °C-35 °C, luft, i minst 14 dagar | Övervakning automatiskt av BacT/ALERT Dual-T-instrumentet. Visuell kontroll av varje flaska i slutet av inkubationen för mögelbollar rekommenderas starkt. | Se figur 8 för ett exempel på synliga mögelkulor som inte detekterades automatiskt av BacT/ALERT. | |||||||
| iFN+ (NIH-metod) | ||||||||||
| SAB (NIH-metod) | 20 °C-25 °C i minst 14 dagar | Periodiskt under inkubationsperioden (dag 3, 5, 7 och 14) | ||||||||
Tabell 1: Sammanfattning av rekommenderade odlingsförhållanden och förväntade resultat. Kulturförhållandena som beskrivs här är rekommendationer baserade på ett validerat program som används vid NIH. Varje slutanvändare är skyldig att validera sitt eget mikrobiologiska testprogram. De mikrobiella kontroll- och teststrategierna kan skilja sig åt mellan institut beroende på variabler inklusive anläggningsdesign, anläggningsflora och produktriskklassificering.
Figur 2: Tillväxt på TSALT-plattan. Provtagningsplattan på TSALT-ytan som visar tre CFU:er med två distinkta kolonimorfologier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kontaminering av TSALT-plattan under insamling. TSALT-ytkulturen som visar en enda koloni på plattans kant, vilket tyder på dålig aseptisk hantering under provtagningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Odling erhållen med hjälp av ett förorenat luftprovtagningshuvud. Exempel på en TSA-aktiv luftprovtagningskultur som visar >100 kolonibildande enheter (CFU) av blandade morfologier. Tillväxtmönstret indikerar kontaminering av provtagningshuvudet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ingen tillväxt på en TSA aktiv livskraftig luftplatta. TSA aktiv livskraftig luftplatta som illustrerar ingen tillväxt efter inkubation. Indrag från det aktiva luftprovtagarhuvudet kan ses på bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Övervakning av processer
- Sedimenteringsplattor (passiv luftövervakning)
- Placera märkta TSA- och SAB-plattor nära arbetsområdet men i ett område som inte stör testningen. Dokumentera provtagningens starttid och öppna båda plattorna aseptiskt och placera locken på en ren yta i BSC bort från arbetsområdet.
- Sedimenteringsplattorna får vara öppna i högst 4 timmar för att förhindra att agarn torkar ut. Stäng locken på plattorna i slutet av behandlingen. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1. Figur 6 visar en enda koloniförorening på en TSA-luftsedimenteringsplatta.
- Handske fingertoppsprovtagning (GFS)
- Skaffa två märkta TSALT-plattor. Ta bort locket på en platta aseptiskt och placera det på en ren arbetsyta bort från provtagningsområdet.
- Rulla försiktigt dynan på varje finger och tummen på ena handen på plattans yta (figur 7). Ta prov på den största ytan på varje finger/tumme i stället för på spetsen. Använd tillräcklig kraft för att göra små fördjupningar på agarn utan att spricka agarytan.
- Sätt tillbaka locket aseptiskt på plattan och upprepa steg 3.2.2 för den andra handen. Sanera händerna med 70% sIPA vid avslutad provtagning. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1.
Figur 6: Tillväxt på en TSA-luftsedimenteringsplatta. En TSA-luftsedimenteringsplatta som illustrerar en enda koloni av en förorening som odlats under passiv luftprocessövervakning i BSC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Provtagning av fingertoppar med handskar. Den korrekta metoden för att ta prover av fingertopparna med den största ytan (eller dynan) på varje finger/tumme visas till vänster. Den felaktiga processen där endast fingertoppen samplas visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Sterilitetstestning genom direkt inokulering av produkten
- Direkt inokulering efter USP<71>
- Skaffa en märkt tryptisk sojabuljong (TSB) flaska och en märkt flytande tioglykolatmedium (FTM) flaska för varje inlämnad testartikel. För testsessionen, skaffa en TSALT och en SABLT för livskraftig ytprovtagning, en TSA- och en SAB-platta för sedimenteringsplattor och två TSALT-plattor för GFS.
- Klänning för arbete inuti BSC enligt steg 1.2. Rengör BSC enligt steg 1.4. Placera materialen i BSC enligt steg 1.5. Utför kontaktprovtagning av det kritiska arbetsområdet enligt steg 2.1 och torka av ytan med 70% sIPA efter provtagning. Förbered TSA- och SAB-sedimenteringsplattorna nära arbetsområdet enligt steg 3.1.
- Hämta testartikeln och tillhörande TSB- och FTM-flaskor. Om TSB- och FTM-flaskorna har en septum, ta bort skyddslocken från varje flaska och torka av septumet med en steril alkoholtork. Om TSB- och FTM-flaskorna har en skruvtopp, lossa locket från flaskorna (men ta inte bort locket).
- Virvla testartikeln för att säkerställa en homogen suspension. Inokulera flaskorna med testartikelns validerade volym (upp till 10 ml/flaska) med en steril spruta och en injektionsnål (för septumlock) eller en pipettor (för skruvkorkar).
- Efter inokulering, torka septum med en steril alkoholservett och sätt in en steril ventilationsenhet för att möjliggöra luftutbyte under inkubation. För skruvflaskor, stäng flaskan men lämna locket 1/4 till 1/2 ett varv löst för att möjliggöra luftutbyte under inkubation. Upprepa steg 4.1.3-4.1.5 för varje testartikel som ska testas under den sessionen.
- Stäng aseptiskt TSA- och SAB-sedimenteringsplattorna och dokumentera provtagningens sluttid. Utför GFS enligt steg 3.2, torka handskarna med 70% sIPA efter provtagning. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1.
- Överför allt testmaterial från BSC och rengör BSC enligt steg 1.4.
- Direkt inokulering enligt NIH Alternative Sterility Testing Method
- Skaffa en märkt i FA+, en märkt iFN+ och en SAB-platta för varje testartikel. För testsessionen, skaffa en TSALT och en SABLT för livskraftig ytprovtagning, en TSA- och en SAB-platta för sedimenteringsplattor och två TSALT-plattor för GFS.
- Klänning för arbete inuti BSC enligt steg 1.2. Rengör BSC enligt steg 1.4. Placera materialen i BSC enligt steg 1.5. Utför kontaktprovtagning av det kritiska arbetsområdet enligt steg 2.1 och torka av ytan med 70% sIPA efter provtagning. Förbered TSA- och SAB-sedimenteringsplattorna nära arbetsområdet enligt steg 3.1.
- Hämta testartikeln och tillhörande i FA+, iFN+ och SAB-platta. Ta bort skyddslocken från flaskornai FA+ och i FN+ och torkaav septumet med en steril spritservett.
- Virvla testartikeln för att säkerställa en homogen suspension. Inokulera flaskorna med testartikelns validerade volym (upp till 10 ml/flaska) med en steril spruta och injektionsnål. Torka av septum med en steril alkoholtork efter ympning. Inkubera flaskorna på BacT/ALERT Dual-T-instrumentet enligt beskrivningen i tabell 1.
- Inokulera SAB-plattan med den validerade mängden av testartikeln (högst 500 μl/platta) med hjälp av en pipettor, och stryk för isolering med hjälp av en steril slinga. Låt stå i 10 minuter för att säkerställa att provet inte rinner på plattans lock när det vänds upp och ner för inkubation. Placera varje SAB-platta som inokulerats med testartikeln i en plastpåse, bind löst och inkubera enligt beskrivningen i tabell 1.
- Stäng aseptiskt TSA- och SAB-sedimenteringsplattorna och dokumentera provtagningens sluttid. Utför GFS enligt beskrivningen i steg 3.2 och torka av handskarna med 70 % sIPA efter provtagning. Packa plattorna löst och inkubera kulturerna enligt beskrivningen i tabell 1. Visuell inspektion av BacT/ALERT-flaskorna i slutet av inkubationsperioden är avgörande för att upptäcka mögelkulor som kan ha gått oupptäckta av instrumentet (figur 8).
- Överför allt testmaterial från BSC och rengör BSC enligt steg 1.4.
Figur 8: Tillväxt av mögel som inte detekterades av BacT/ALERT. Exempel på mögelkulor, synliga för blotta ögat, som inte detekterades automatiskt av BacT/ALERT-systemet. Baserat på dessa resultat rekommenderar vi terminal visuell inspektion av alla BacT / ALERT-flaskor och tillsats av SAB-plattan för svampodling med NIH Alternative Sterility Testing Method. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De förväntade resultaten beskrivs i tabell 1. EM-data bör granskas och följas upp med en lämplig undersökning och svar på åtgärder, varning eller ISO-gränsavvikelser. Om en utflykt inträffar för icke-livskraftiga partiklar bör man gå vidare enligt ISO 14644-bilaga A, avsnitt A.5.57. Om avvikelsen kan hänföras till en omedelbart identifierbar onormal händelse bör de ursprungliga provtagningsresultaten dokumenteras, en anmärkning bör läggas till för att bortse från de ursprungliga resultaten och en detaljerad beskrivning av den onormala händelsen bör tillhandahållas. Ytterligare ett prov får tas på platsen i fråga. Om avvikelsen inte kan tillskrivas en omedelbart identifierbar onormal händelse, dokumentera provtagningsresultatet. Ta ytterligare en uppsättning icke-viabla prover på platsen i fråga omedelbart efter att ha identifierat resultatet av OOS (out of specification). Detta kan användas som en del av utredningen. Enligt ISO 14644-bilaga A, avsnitt A.5.6, undersök OOS-fyndet och åtgärda den identifierade grundorsaken.
Ett misslyckat produktsterilitetstest kommer att resultera i grumlighet i USP<71> -kulturen eller tillväxt i BacT/ALERT-flaskorna och / eller SAB-plattan (figur 8). Organismen bör identifieras på artnivå och lämpliga känslighetstester bör utföras om det är kliniskt motiverat. En undersökning bör slutföras av testlaboratoriet för att avgöra om OOS-resultatet är giltigt eller om det fanns något potentiellt laboratoriefel som kan ha bidragit till OOS. Testning av retentionsprovet rekommenderas starkt. Beslutet att avstå från eller frisläppa produkten för infusion ska fattas av patientens kliniska vårdteam och av tillverknings-, mikrobiologi-, infektionssjukdomar-, kvalitetssäkrings- och regleringsteamet. För HCT/Ps som redan kan ha infunderats, baserat på preliminära tester under processen, ska patienten övervakas noggrant och en händelserapport ska lämnas till lämplig tillsynsmyndighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska områden i detta protokoll, inklusive underhåll av aseptisk teknik och enkelriktat luftflöde i renrum och BSC. Bästa praxis inkluderar att röra sig långsamt och medvetet för att minimera turbulens. Aseptiska manipuleringar ska utföras från sidan av produkten, inte ovanifrån. Bearbetning av slutna system och användning av terminalt steriliserade råvaror rekommenderas. Att tala i kritiska områden och luta sig mot väggar eller utrustning bör undvikas. På samma sätt bör onödig beröring av icke-sterila föremål och plockning av självdöda föremål undvikas tills den sterila bearbetningen har slutförts. Materialen i BSC bör ordnas för att förhindra blockering av luftflödet och för att upprätthålla enkelriktad rörelse från ren till smutsig. Operatörens rörelser in och ut ur BSC bör minimeras. Dokumentationen av alla aktiviteter inklusive partinummer, utgångsdatum, kalibreringsdatum, start- / stopptider och testpersonal för alla material, utrustning och processer inom en provtagnings- eller testsession är också kritisk.
EM-proceduren som beskrivs här bygger på manuell inkubation och koloniräkning. Utformningen av ett EM-program är enligt slutanvändarens eget gottfinnande. Provtagningsplatserna och testfrekvensen bör vägledas av PDA Technical Report 13 8 och motiveras av en riskbedömning som omfattar laboratoriearbetsflödet, produktnärheten, platsens kriticitet, varaktighet och antalet anställda för varje arbetsflödessteg8. Ett typiskt EM-program bör omfatta de totala luftpartiklarna (0,5 μm icke-livskraftiga partiklar), livskraftig luftprovtagning (1 000 l) och livskraftig ytprovtagning som samlats in under dynamiska förhållanden med en frekvens baserad på produktrisk och historiska trender. Veckovis provtagning rekommenderas i allmänhet för nya anläggningar tills tillräckliga datatrender har fastställts. Allmän vägledning för EM- och kulturförhållanden finns i tabell 1 och i USP<1116>9; andra har dock utvärderat olika odlingsförhållanden, såsom medium som endast var begränsat till TSA / TSALT och olika inkubationstemperaturer, inklusive dubbla temperaturer10,11. Automatiserade EM-instrument som kombinerar inkubation med koloniräkning plattavläsning används ofta på läkemedelsmarknaden som snabba metoder 8,12. Det valda EM-programmet måste valideras och är vanligtvis beroende av anläggningens flora, inkubatorkapacitet, testvolym och personalkapacitet. Dessutom bör ett etablerat EM-program ha en aktiv livscykel, med relevanta justeringar av insamlingsplatser, testfrekvens och / eller varnings- / åtgärdsgränser baserat på en årlig översyn och en datadriven riskbedömning8. Stora förändringar i EM-trender kan utlösa omvärderingen av rengöringsprogrammet. Desinfektionsmedel bör valideras via en effektivitetsstudie av desinfektionsmedel med representativa materialytor mot anläggningens flora under den föreskrivna kontakttiden, som beskrivs i USP<1072>13. Typiska desinfektionsmedel kan inkludera Vesphene III (kontakttid: 10 min), LpH III (kontakttid: 10 min) och ett spordödande medel som Peridox RTU (kontakttid: 5 min). För bästa praxis bör desinfektionsmedel roteras varje månad, och utlopp, mekaniska anslutningar och arbetsytor som finns under utrustning i BSC bör rengöras rutinmässigt.
Den minsta produktvolym som måste testas för sterilitet definieras i USP<71>3 och baseras på den totala slutliga produktvolymen. Tyvärr designades USP<71> ursprungligen för sterila läkemedelsprodukter och är erkänt att vara olämpligt för produkter med kort hållbarhet på grund av den långsamma vändningstiden och den höga produkttestvolymen14. USP<1071> erkänner att alternativa snabba mikrobiella metoder kan vara fördelaktiga och att lägre produkttestvolymer kan vara acceptabla när en riskbaserad metod har tillämpats14. Med tanke på begränsningarna i USP<71> för sterilitetstestning av cellterapiprodukter har alternativa metoder såsom automatiserade BacT/ALERT-andningsmetoder använts inom industrin 1,4,6. All användning av en alternativ testmetod kräver dock rigorös slutanvändarvalidering för att visa non-inferiority till den kompendiella USP<71>metoden för den produkten 5,15,16. Metodlämplighetstestning för varje ny produkt krävs också för att säkerställa att produkten, vid vald inokuleringsvolym och testbetingelse, inte hämmar detektering av lågnivåa föroreningar6. Det är därför möjligt att testvolymen och inokuleringsvolymen kan variera mellan produkterna beroende på resultatet av valideringsstudierna. Membranfiltrering, en sekundär metod som beskrivs i USP<71>, kan användas för att ta prov på en större provvolym i ett enda test. Validering och testning av metodens lämplighet bör omfatta organismer utöver de sex kompendiella QC-isolaten. Fokus bör läggas på ofta återvunnen anläggningsflora och tidigare produktföroreningar. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt svampar, eftersom andningsmetoder ensamma har visat suboptimal prestanda 4,17, varför NIH Alternative Sterility Testing Method inkluderar en parad svampkultur på SAB och en terminal visuell inspektion av BacT / ALERT-flaskorna.
En stor begränsning för alla mikrobiella kontrollprogram är den retrospektiva karaktären i vilken resultaten finns tillgängliga. Guldstandardtestning är kulturbaserad, vilket är långsamt och kan leda till ständiga reaktiva åtgärder för korrigerande åtgärder. Snabbare testmetoder kräver rigorös validering, men dessa kan fortfarande inte ge realtidssäkerhet för mikrobiell övervakning och kontroll. Dessutom fångar mikrobiologiska kulturer endast en liten delmängd av tiden under en produktions- eller testsession. Därför är det viktigt att aktiv mikrobiell övervakning sker ofta riskmotiverat för att säkerställa att trenddata är väletablerade. Detta kommer att göra det möjligt att använda lämpligt fastställda tröskelvärden för att förutsäga potentiella avvikelser från mikrobiell kontroll innan de inträffar.
Upprättandet av ett robust cGTP / cGMP-program tar tid och ansträngning och kan tyvärr inte enkelt överföras från en anläggning till en annan. United States Food and Drug Administration förväntar sig att alla program genomgår valideringstestning för slutanvändare trots den potentiella tillgängligheten av publicerade resultat från tredje part som visar deras effektivitet. Därför kan mikrobiella kontroll- och teststrategier skilja sig åt mellan institut beroende på variabler inklusive anläggningsdesign, anläggningsflora och produktriskklassificering. De strategier som beskrivs i detta protokoll hjälper till att skapa en ram för att upprätta ett robust mikrobiellt övervaknings- och kontrollprogram för cGTP / cGMP-laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det intramurala forskningsprogrammet för National Institutes of Health Clinical Center. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-25°C Incubator | Lab preference | ||
| 30-35°C Incubator | Lab preference | ||
| Alcohol-based hand sanitizer | Lab preference | ||
| BacT/ALERT Dual-T instrument | BioMerieux Industry | ||
| Beard cover | Lab preference | ||
| Biosafety cabinet (BSC) | Lab preference | ||
| Cleanroom shoes | Lab preference | ||
| Fluidthioglycollate medium (FTM) | Hardy Diagnostics | U84 | USP |
| Handheld cleaning mop | Contec | 2665LF | |
| Hypodermic needle | Lab preference | ||
| iFA+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412991 | |
| Isokinetic head | Lab preference | ||
| Laser particle counter | TSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Mirror | Lab preference | ||
| Non-sterile bouffant | Lab preference | ||
| Non-sterile gloves | Lab preference | ||
| Non-sterile shoe covers | Lab preference | ||
| Non-sterile sleeve covers | Lab preference | ||
| Parafilm | Lab preference | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastic bag | Lab preference | ||
| Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, irradiated |
| Sabouraurd Dextrose Agar (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, irradiated |
| Safety glasses | Lab preference | ||
| Scrubs (top and bottom) | Lab preference | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterile alcohol wipe | Lab preference | ||
| Sterile boot covers | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile coveralls | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile face mask | Lab preference | ||
| Sterile gloves | Lab preference | ||
| Sterile hood | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile low-lint wipes | Texwipe | TX3210 | |
| Sterile mop cleaning pads | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterile sleeve covers | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterile spreading rod | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterile syringe | Lab preference | ||
| Tacky mats | Lab preference | ||
| Tryptic Soy Agar (TSA) | Hardy Diagnostics | W570R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT) | Hardy Diagnostics | P520R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Hardy Diagnostics | U46 | USP |
| Tubing | Lab preference | ||
| Vesphene III | Steris | 1S15CX | |
| Viable air sampler | Hardy Diagnostics | BAS22K | |
| Vortex | Lab preference |
References
- Cundell, T., Atkins, J. W., Lau, A. F. Sterility testing for hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Microbiology. , 10.1128/jcm.01654-22 (2023).
- United States Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice. United States Food and Drug Administration. , (2004).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- England, M. R., Stock, F., Gebo, J. E. T., Frank, K. M., Lau, A. F. Comprehensive evaluation of compendial USP<71>, BacT/Alert Dual-T, and Bactec FX for detection of product sterility testing contaminants. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01548 (2019).
- Gebo, J. E. T., East, A. D., Lau, A. F. A side-by-side comparison of clinical versus current good manufacturing practices (cGMP) microbiology laboratory requirements for sterility testing of cellular and gene therapy products. Clinical Microbiology Newsletter. 43 (21), 181-191 (2021).
- Gebo, J. E. T., Lau, A. F. Sterility testing for cellular therapies: What is the role of the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 58 (7), 01492 (2020).
- International Organization for Standardization. ISO 14644-1:2015 Cleanrooms and associated controlled environments - Part 1: Classification of air cleanliness by particle concentration. International Organization for Standardization. , (2015).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 13 Revised 2022 (TR 13) Fundamentals of an Environmental Monitoring Program. Parenteral Drug Association, Inc. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1116> Microbiological Evaluation of Cleanrooms and Other Controlled Environments in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Guinet, R., et al. Multicenter study on incubation conditions for environmental monitoring and aseptic process simulation. PDA journal of pharmaceutical science and technology. 71 (1), 43-49 (2017).
- Gordon, O., Berchtold, M., Staerk, A., Roesti, D. Comparison of different incubation conditions for microbiological environmental monitoring. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 68 (5), 394-406 (2014).
- Anders, H. J., et al. Multisite qualification of an automated incubator and colony counter for environmental and bioburden applications in pharmaceutical microbiology. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary.
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<1071> Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products: A Risk-Based Approach in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. PUSP<1223> Validation of Alternative Microbiological Methods in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
- Parenteral Drug Association. PDA Technical Report No. 33, Revised 2013 (TR 33) Evaluation, Validation and Implementation of Alternative and Rapid Microbiological Methods. Parenteral Drug Association, Inc. , (2013).
- Putnam, N. E., Lau, A. F. Comprehensive study identifies a sensitive, low-risk, closed-system model for detection of fungal contaminants in cell and gene therapy products. Journal of Clinical Microbiology. 59 (11), 0135721 (2021).
- Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation. Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes (PE 009-16 (Annexes)). Pharmaceutical Inspection Convention & Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. , (2022).
- United States Pharmacopeia - National Formulary. USP<825> Radiopharmaceuticals - Preparation, Compounding, Dispensing, and Repackaging in USP43-NF38 2S. United States Pharmacopeia - National Formulary. , (2020).
