Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.
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Artículo de método
Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular
En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio in vitro de la diferenciación de adipocitos blancos, marrones y beige permite la investigación de las funciones autónomas celulares de los adipocitos y sus mecanismos. Las líneas celulares de preadipocitos blancos inmortalizados están disponibles públicamente y se usan ampliamente. Sin embargo, la aparición de adipocitos beige en el tejido adiposo blanco en respuesta a señales externas es difícil de recapitular en toda su extensión utilizando líneas celulares de adipocitos blancos disponibles públicamente. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino se ejecuta comúnmente para obtener preadipocitos primarios y realizar la diferenciación de adipocitos. Sin embargo, la picada y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo a mano pueden dar lugar a variaciones experimentales y son propensas a la contaminación. Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado modificado que utiliza un disociador de tejido para la digestión de colagenasa para lograr un aislamiento más fácil del SVF, con el objetivo de reducir la variación experimental, reducir la contaminación y aumentar la reproducibilidad. Los preadipocitos obtenidos y los adipocitos diferenciados pueden ser utilizados para análisis funcionales y mecanicistas.
Introducción
La biología del tejido adiposo ha estado atrayendo una atención cada vez mayor debido a la creciente prevalencia de obesidad y diabetes tipo 2 a nivel mundial1. Los adipocitos almacenan el exceso de energía en forma de gotas de lípidos, que se liberan al morir de hambre. Además, el tejido adiposo mantiene la homeostasis energética sistémica al servir como órgano endocrino y comunicarse con otros tejidos 2,3. Curiosamente, tanto el exceso de tejido adiposo (obesidad) como la pérdida adiposa (lipodistrofia) están relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tokio y realizados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Tokio.
1. Preparación de la solución enzimática y el medio
- Coloque ambos lados del tejido adiposo blanco inguinal (lado derecho e izquierdo, aproximadamente 150 mg) de un ratón de 7-8 semanas de edad y 2,5 ml de solución enzimática en el tubo C del disociador.
- Reconstituir la enzima D con 3 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sin suero....
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Resultados
Este protocolo produce adipocitos completamente diferenciados y cargados de lípidos 7 días después de inducir la diferenciación de los adipocitos. El grado de diferenciación de los adipocitos puede evaluarse mediante la tinción de triglicéridos y lípidos (Figura 1A), o el análisis de expresión de ARNm mediante qPCR-RT de genes adipocitos, como el regulador maestro de la adipogénesis Pparg y su diana Fabp4 (Figura 1B). Para inducir la diferencia.......
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Discusión
Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de la SVF del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y realizar la diferenciación de adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de colagenasa disminuyó la variación experimental, disminuyó el riesgo de contaminación y aumentó la reproducibilidad. Si bien este procedimiento es un paso crítico dentro del protocolo presentado, el proceso está altamente automatizado y no se necesita optimización. Sin embargo, dependiendo de l.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene un interés financiero en competencia relacionado con este trabajo.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Takahito Wada y Saiko Yoshida (Universidad de Tokio, Tokio, Japón) por su asistencia experimental. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones a Y.H.: beca de investigación del Programa de Jóvenes Investigadores Excelentes de la Universidad de Tokio; Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, número de subvención 19K17976; subvención para el Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fundación Japonesa de Enzimología Aplicada, número de subvención 17F005; beca de la Fundación de Investigación Farmacológica; beca de la Fundación Memorial Mochida par....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de 100 mm | Corning | 430167 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 3513 | |
| Plato de 60 mm | IWAKI | 3010-060 | |
| Kit de disociación de tejido adiposo, ratón y rata | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | Contenido: Enzima D, Enzima R, Enzima A y Tampón A |
| Colador de células 70 µ m | BD falcon | #352350 | |
| Platos recubiertos de colágeno, 100 mm | BD | #356450 | |
| Platos recubiertos de colágeno, 60 mm | BD# | 354401 | |
| colágeno I 6 pocillos | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexametasona | Wako | 041-18861 | |
| Pinza de disección | N/A | N/A | autoclave antes de usar |
| Tijeras de disección, romas/afiladas | N/A | N/A | autoclave antes de usar |
| Tijeras de disección, afiladas/afiladas | N/A | N/A | autoclave antes |
| de usar DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubos | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Disociador con calentadores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Inyección U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indometacina | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutilmetilxantina (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomicina Sulfato | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Añadir gen | #1780 | |
| PBS comprimidos | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell | biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems 4367659 | ||
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Tripsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
Referencias
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
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Reimpresiones y permisos
