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Artículo de método

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

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DOI:

10.3791/65265

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19 de mayo de 2023

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1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Resumen

El estudio in vitro de la diferenciación de adipocitos blancos, marrones y beige permite la investigación de las funciones autónomas celulares de los adipocitos y sus mecanismos. Las líneas celulares de preadipocitos blancos inmortalizados están disponibles públicamente y se usan ampliamente. Sin embargo, la aparición de adipocitos beige en el tejido adiposo blanco en respuesta a señales externas es difícil de recapitular en toda su extensión utilizando líneas celulares de adipocitos blancos disponibles públicamente. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino se ejecuta comúnmente para obtener preadipocitos primarios y realizar la diferenciación de adipocitos. Sin embargo, la picada y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo a mano pueden dar lugar a variaciones experimentales y son propensas a la contaminación. Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado modificado que utiliza un disociador de tejido para la digestión de colagenasa para lograr un aislamiento más fácil del SVF, con el objetivo de reducir la variación experimental, reducir la contaminación y aumentar la reproducibilidad. Los preadipocitos obtenidos y los adipocitos diferenciados pueden ser utilizados para análisis funcionales y mecanicistas.

Introducción

La biología del tejido adiposo ha estado atrayendo una atención cada vez mayor debido a la creciente prevalencia de obesidad y diabetes tipo 2 a nivel mundial1. Los adipocitos almacenan el exceso de energía en forma de gotas de lípidos, que se liberan al morir de hambre. Además, el tejido adiposo mantiene la homeostasis energética sistémica al servir como órgano endocrino y comunicarse con otros tejidos 2,3. Curiosamente, tanto el exceso de tejido adiposo (obesidad) como la pérdida adiposa (lipodistrofia) están relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes1. Los adipocitos se dividen en tres tipos: blanco, marrón y beige1. Los adipocitos blancos almacenan principalmente el exceso de energía como lípidos, mientras que los adipocitos marrones y beige disipan la energía en forma de calor a través de la proteína 1 de desacoplamiento mitocondrial (Ucp1)1,4. En particular, los adipocitos beige (también llamados adipocitos marrones "inducibles") aparecen en el tejido adiposo blanco en respuesta a la estimulación fría o simpática y exhiben patrones de expresión génica que se superponen pero son distintos de los de los adipocitos marrones "clásicos"5. Recientemente, se ha anticipado que los adipocitos marrones y beige son objetivos potenciales de tratamientos contra la obesidad y la diabetes destinados a "mejorar la disipación de energía" en lugar de "suprimir la ingesta de energía"4. De manera favorable, se informa que el alelo de riesgo de la variante de obesidad FTO rs1421085 en humanos, que exhibe la asociación más fuerte con un mayor índice de masa corporal (IMC) entre las variantes comunes 6,7 y exhibe varias interacciones gen-ambiente8,9, regula negativamente la diferenciación y función de los adipocitos beige10. El γ del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPARγ) es conocido como un regulador transcripcional maestro de la adipogénesis y es necesario y suficiente para la diferenciación de los adipocitos11. Los reguladores transcripcionales, como el dominio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 que contiene 16 (PRDM16), el factor 2 de células b tempranas (EBF2) y el factor nuclear I-A (NFIA), son cruciales para la diferenciación y función de los adipocitos marrones y beige 12,13,14,15,16,17,18 . Por otro lado, la programación génica del adipocitos blancos requiere reguladores transcripcionales, como la proteína potenciadora similar a la transducina 3 (TLE3) y la proteína 423 del dedo de zinc (ZFP423)19,20,21.

Los sistemas modelo in vitro permiten realizar estudios moleculares que tienen como objetivo mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes a las funciones y disfunciones de los adipocitos. Aunque existen líneas celulares de preadipocitos inmortalizadas y disponibles públicamente como 3T3-L1 y 3T3-F442A22,23,24, el cultivo de preadipocitos primarios y la diferenciación en adipocitos sería un modelo más adecuado para estudiar la adipogénesis in vivo. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino es un método bien conocido para la obtención de preadipocitos primarios25,26. Sin embargo, la digestión de la colagenasa del tejido adiposo, que se realiza comúnmente utilizando un agitador bacteriano con un bastidor tubular, puede resultar en una variación experimental y es propensa a la contaminación27,28. Aquí, describimos un protocolo alternativo que utiliza un disociador de tejido suave de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) para la digestión de la colagenasa para lograr un aislamiento más fácil de la SVF.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tokio y realizados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Tokio.

1. Preparación de la solución enzimática y el medio

  1. Coloque ambos lados del tejido adiposo blanco inguinal (lado derecho e izquierdo, aproximadamente 150 mg) de un ratón de 7-8 semanas de edad y 2,5 ml de solución enzimática en el tubo C del disociador.
  2. Reconstituir la enzima D con 3 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sin suero bovino fetal (FBS) ni antibióticos, enzima R con 2,7 ml de DMEM/F12 sin FBS ni antibióticos, y enzima A con 1 ml de tampón A.
  3. Prepare 2,5 ml de solución enzimática añadiendo 100 μL de enzima D, 50 μL de enzima R, 12,5 μL de enzima A y 2,35 ml de DMEM/F12 sin FBS ni antibióticos en el tubo C. Coloque el tubo C con solución enzimática en hielo.

2. Aislamiento del tejido adiposo

  1. Eutanasia de ratones machos C57BL/6J de 7-8 semanas de edad (aproximadamente 20 g) por luxación cervical.
  2. En un banco limpio, para aislar el tejido adiposo blanco inguinal, corte la piel con tijeras romas / afiladas en el abdomen y hacia las extremidades inferiores. Aísle el tejido adiposo del interior de los muslos con tijeras afiladas/afiladas. Un lado del tejido adiposo inguinal wieghs ~ 75 mg.
  3. Coloque el tejido adiposo aislado en el tubo C con solución enzimática en hielo y mantenga el tubo dentro del banco limpio para mantener la esterilidad.

3. Picada y digestión del tejido adiposo

  1. En el banco limpio, agregue 2,5 ml de solución enzimática al tubo C.
  2. Picar el tejido adiposo en trozos pequeños cortando con tijeras afiladas / afiladas 50 veces. Cortar el tejido adiposo en ~2 mm2 pedazos.
  3. Cierre herméticamente la tapa del tubo C, gire el tubo boca abajo y conéctelo al manguito del disociador de tejido con la tapa puesta. Luego, digiera la muestra durante ~ 40 min a 37 ° C.
    NOTA: Este estudio utilizó gentleMACS Octo Disociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), y se siguió el programa preinstalado "37C_mr_ATDK_1".

4. Filtración de la suspensión celular

  1. Precalentamiento DMEM/F12 que contiene 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C.
  2. Separe el tubo C del disociador de tejido y detenga la digestión agregando 5 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando suavemente cuatro veces.
  3. Centrifugar a 700 x g durante 10 min a 20 °C.
  4. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
  5. Vuelva a suspender el pellet agregando 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando suavemente cinco veces.
  6. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm de diámetro colocado en un tubo nuevo de 50 ml.
  7. Centrifugar a 250 x g durante 5 min y resuspender el pellet en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

5. Recubrimiento celular

  1. Centrifugar a 500 x g durante 5 min.
  2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet agregando 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando diez veces.
  3. Colocar la suspensión celular en una placa recubierta de colágeno de 10 cm y colocar las placas en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5%CO2) durante 1-2 h.
    NOTA: Los platos recubiertos de colágeno no son absolutamente necesarios. Sin embargo, según la experiencia, los platos recubiertos de colágeno ayudan a la adherencia de los preadipocitos y, por lo tanto, aumentan la supervivencia de las células.
  4. Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 3 ml de PBS por lavado.
  5. Añadir 10 ml de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y devolver los platos a la incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% deCO2).

6. Transmisión de preadipocitos

  1. Al día siguiente, aspire el medio (las células serán adherentes, y por lo tanto el medio puede ser aspirado), lave las células dos veces con 3 ml de PBS por lavado, y agregue 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente 4 días después del aislamiento de SVF), divida las células en cuatro platos recubiertos de colágeno de 10 cm.
    1. Específicamente, aspire el medio, lave las células con PBS (temperatura ambiente [RT]), agregue 1 ml de tripsina al 0,05% precalentada e incube durante 5 minutos en la incubadora de cultivo celular.
    2. Agregue 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina para apagar la actividad de la tripsina. Después del pipeteo, centrifugar a 440 x g durante 5 min.
    3. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células añadiendo 40 ml de DMEM/F12 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina, y colocar las células en cuatro platos recubiertos de colágeno de 10 cm.
  3. Paso de las células de nuevo cuando alcanzan el 80% de confluencia.

7. Preparación del retrovirus que expresa el antígeno T grande SV40 para la inmortalización de preadipocitos (opcional)

  1. Al menos 3 días antes de la inmortalización, placa de platino-E (Plat-E) empaquetando células29 a una densidad de 3.0 x 105 células/ml en 2 mL de DMEM con 10% FBS sin antibióticos. Use un hemacitómetro para contar las células.
  2. Al día siguiente, transfecta 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (agregue el plásmido del gen # 1780) usando Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Después de 24 h, aspirar el medio y agregar 2 mL de DMEM con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
  4. Al día siguiente, cosecha el sobrenadante retroviral. El retrovirus puede utilizarse para la inmortalización inmediatamente o almacenarse a -80 °C.

8. Inmortalización de preadipocitos con antígeno SV40 T grande (opcional)

  1. Paso y expansión de los preadipocitos dos veces después del aislamiento de SVF.
  2. Colocar las células en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5-1,0 x 104 células/ml en 2 ml de DMEM/F12 con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Use un hemacitómetro para contar las células.
  3. Al día siguiente, preparar 250 μL de retrovirus fresco o descongelado que exprese el antígeno T grande SV40 por pocillo de las placas de 6 pocillos. Centrifugar a 440 x g durante 5 min y colocar el sobrenadante en un tubo nuevo.
  4. Agregue 750 μL de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y 1 μL de polifereno por 250 μL de sobrenadante retroviral para producir el virus de trabajo.
  5. Aspirar el medio y añadir 1.000 μL del retrovirus de trabajo a cada pocillo que contenga preadipocitos.
  6. Añadir 1 ml de DMEM/F12 con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina 4 h después.
  7. Al día siguiente, separe los preadipocitos infectados en un plato de 10 cm y seleccione las células infectadas con DMEM / F12 que contiene 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 500 μg / ml de neomicina. Para controlar la selección de antibióticos, prepare un plato de células no infectadas con neomicina.
  8. Continúe pasando las células infectadas con neomicina hasta que todas las células no infectadas en la placa del monitor estén muertas.

9. Diferenciación de adipocitos

  1. Placar las células. Para placas de 12 pocillos, placar las células a una densidad de 4.0 x 104 células/ml en 1 ml de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Cuando los preadipocitos se vuelvan confluentes (48-72 h después de la placa), aspirar el medio y reemplazarlo con medio de diferenciación (ver Tabla 1 para la composición).
  3. En el día 2 de la diferenciación (es decir, 48 h después de inducir la diferenciación), reemplace el medio con medio de mantenimiento (ver Tabla 1 para la composición). Después, cambie el medio de mantenimiento cada 2 días. La diferenciación terminal se logra en el día 7 de diferenciación.
  4. Tinción de rojo aceite
    1. Para la tinción de rojo aceite, aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de PBS por pocillo. Fijar las células añadiendo 1 ml de formaldehído al 4% por pocillo e incubar las células durante 15 min en RT.
    2. Durante la incubación, diluir la solución madre de aceite rojo o al 0,5% (en alcohol isopropílico) al 0,3% conddH2Oy filtrar la solución de trabajo con papel de filtro.
    3. Después de los 15 minutos de incubación, retire el formaldehído, enjuague las células con alcohol isopropílico al 60%, agregue 1 ml de aceite filtrado rojo o solución de trabajo e incube durante 1 h en RT.
    4. Después de la incubación, lave las células con agua corriente. Luego, observe los adipocitos cargados de lípidos bajo un microscopio invertido (aumento: objetivo 20x y ocular 10x).
  5. Análisis de expresión de ARNm
    NOTA: Consulte la Tabla 2 para obtener la lista de cebadores utilizados en este estudio.
    1. Aspirar el medio y añadir 1 mL/pocillo de trizol al pocillo.
    2. Incubar durante 15 minutos en RT, separar las células por pipeteo y recoger las muestras en tubos de 1,5 ml. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C hasta la extracción del ARN.
    3. Descongele la muestra congelada a RT, agregue 200 μL de cloroformo a la muestra y agite vigorosamente durante 15 s.
    4. Incubar la muestra a RT durante 3 min y luego girar a 20.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    5. Retire con cuidado la fase acuosa (superior, incolora) y transfiérala a tubos nuevos. Nunca transfiera la fase proteica (media, blanca) o la fase fenol/cloroformo (inferior, rosa).
    6. Agregue lentamente un volumen igual de 70% de EtOH y mezcle suavemente. No vorágice.
    7. Cargue la muestra (hasta 700 μL) en una columna de espín de ARN asentada en un tubo de recolección. Asegúrese de incluir cualquier precipitado que pueda haberse formado.
    8. Girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el caudal.
    9. Añadir 700 μL de tampón RW1, girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el flujo.
    10. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue 500 μL de RPE tampón.
    11. Girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el caudal.
    12. Añadir 500 μL de RPE tampón, girar a 9.000 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, desechar el flujo.
    13. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y gire (columnas sin tampón) a 9.000 x g durante 1-2 min a 4 °C.
    14. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml y agregue 30 μL de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna.
    15. Incubar la muestra en RT durante 1-2 min. Luego, girar a 9,000 x g durante 1 minuto a 4 ° C para eluyir el ARN.
    16. Compruebe la concentración de ARN con un fluoroespectrómetro.
      NOTA: Se recomienda alinear la concentración aquí.
    17. Realice la transcripción inversa utilizando ~ 200 ng de plantilla de ARN. Utilice un kit comercial de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR-RT) y siga el protocolo del fabricante. Después de la reacción, diluir el ADNc 20 veces a 200 μL.
    18. Agregue 2.0 μL de ADNc, 3.0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0.018 μL de cebador directo qPCR de 100 μM, 0.018 μL de cebador inverso qPCR de 100 μM y 0.96 μL de ddH2O a cada pocillo de una placa de 384 pocillos.
    19. Ejecute una qPCR (etapa de espera: 50 °C durante 2 min y 95 °C durante 2 min; Etapa de PCR: 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min; etapa de curva de fusión: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s). Utilice el método de curva estándar para la cuantificación.

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Resultados

Este protocolo produce adipocitos completamente diferenciados y cargados de lípidos 7 días después de inducir la diferenciación de los adipocitos. El grado de diferenciación de los adipocitos puede evaluarse mediante la tinción de triglicéridos y lípidos (Figura 1A), o el análisis de expresión de ARNm mediante qPCR-RT de genes adipocitos, como el regulador maestro de la adipogénesis Pparg y su diana Fabp4 (Figura 1B). Para inducir la diferencia...

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Discusión

Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de la SVF del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y realizar la diferenciación de adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de colagenasa disminuyó la variación experimental, disminuyó el riesgo de contaminación y aumentó la reproducibilidad. Si bien este procedimiento es un paso crítico dentro del protocolo presentado, el proceso está altamente automatizado y no se necesita optimización. Sin embargo, dependiendo de l...

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Divulgaciones

Ninguno de los autores tiene un interés financiero en competencia relacionado con este trabajo.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Takahito Wada y Saiko Yoshida (Universidad de Tokio, Tokio, Japón) por su asistencia experimental. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones a Y.H.: beca de investigación del Programa de Jóvenes Investigadores Excelentes de la Universidad de Tokio; Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, número de subvención 19K17976; subvención para el Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fundación Japonesa de Enzimología Aplicada, número de subvención 17F005; beca de la Fundación de Investigación Farmacológica; beca de la Fundación Memorial Mochida para la Investigación Médica y Farmacéutica; beca de la Fundación MSD Life Science; subvención de la Daiwa Securities Health Foundation; subvención de la Fundación de Investigación Bioquímica de Tokio; Beca de Investigación en Ciencias de la Vida de la Fundación Takeda Science; y subvención de la Fundación de Investigación Médica SENSHIN.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plato de 100 mmCorning430167
placa de 12 pocillosCorning3513
Plato de 60 mmIWAKI3010-060
Kit de disociación de tejido adiposo, ratón y rataMiltenyi Biotec130-105-808Contenido: Enzima D, Enzima R, Enzima A y Tampón A
Colador de células 70 µ mBD falcon#352350
Platos recubiertos de colágeno, 100 mmBD#356450
Platos recubiertos de colágeno, 60 mmBD#354401
colágeno I 6 pocillosIWAKI4810-010
DexametasonaWako041-18861
Pinza de disecciónN/AN/Aautoclave antes de usar
Tijeras de disección, romas/afiladasN/AN/Aautoclave antes de usar
Tijeras de disección, afiladas/afiladasN/AN/Aautoclave antes
de usar DMEM/F-12, suplemento GlutaMAXGibco10565-042
Suero Fetal Bovino (FBS)N/AN/A
gentleMACS C TubosMilteny Biotec130-093-237
gentleMACSOcto Disociador con calentadoresMiltenyi Biotec130-096-427
Humulin R Inyección U-100Eli Lilly872492
IndometacinaSigmaI7378-5G
Isobutilmetilxantina (IBMX)Sigma17018-1G
Lipofectamina 2000Life Technologies11668-019
Neomicina SulfatoFujifilm146-08871 
Opti-MEMInvitrogen 31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)Añadir gen#1780
PBS comprimidosTakaraT900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cellbiolabRV-101
PolybreneNacalai Tesque12996-81
Power Sybr Green Master MixApplied Biosystems 4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
RosiglitazoneWako180-02653
T3SigmaT2877-100mg
Tripsin-EDTA (0.05%)Gibco25200-056
Microplaca de recubrimiento de

Referencias

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