Summary
Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.
Abstract
Beyaz, kahverengi ve bej adiposit farklılaşmasının in vitro çalışması, adipositlerin hücre-otonom fonksiyonlarının ve mekanizmalarının araştırılmasını sağlar. Ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre hatları halka açıktır ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dış ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda bej adipositlerin ortaya çıkmasının, halka açık beyaz adiposit hücre hatlarını kullanarak tam olarak özetlenmesi zordur. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu genellikle primer preadipositleri elde etmek ve adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için uygulanır. Bununla birlikte, yağ dokusunun elle kıyılması ve kollajenaz sindirimi deneysel varyasyonlara neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, deneysel çeşitliliği azaltmak, kontaminasyonu azaltmak ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla SVF'nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanan modifiye yarı otomatik bir protokol sunuyoruz. Elde edilen preadipositler ve farklılaşmış adipositler fonksiyonel ve mekanik analizler için kullanılabilir.
Introduction
Yağ dokusu biyolojisi, obezite ve tip 2 diyabet prevalansının küresel olarak artması nedeniyle giderek artan bir ilgi çekmektedir1. Adipositler, fazla enerjiyi, açlıktan sonra salınan lipit damlacıkları şeklinde depolar. Ayrıca, yağ dokusu endokrin bir organ görevi görerek ve diğer dokularla iletişim kurarak sistemik enerji homeostazını korur 2,3. İlginçtir ki, hem aşırı yağ dokusu (obezite) hem de yağ kaybı (lipodistrofi) insülin direnci ve diyabet1 ile bağlantılıdır. Adipositler üç türe ayrılır: beyaz, kahverengi ve bej1. Beyaz adipositler esas olarak fazla enerjiyi lipitler olarak depolarken, kahverengi ve bej adipositler enerjiyi mitokondriyal ayrıştırıcı protein-1 (Ucp1) 1,4 yoluyla ısı şeklinde dağıtırlar. Özellikle, bej adipositler ("indüklenebilir" kahverengi adipositler olarak da adlandırılır), soğuk veya sempatik stimülasyona yanıt olarak beyaz yağ dokusunda ortaya çıkar ve "klasik" kahverengi adipositlerinkilerle örtüşen ancak onlardan farklı olan gen ekspresyon kalıpları sergiler5. Son zamanlarda, kahverengi ve bej adipositlerin, "enerji alımını bastırmak" yerine "enerji dağılımını arttırmayı" amaçlayan anti-obezite ve anti-diyabet tedavilerinin potansiyel hedefleri olarak öngörülmektedir4. Destekleyici olarak, insanlarda FTO obezite varyantı rs1421085'in risk alelinin, yaygın varyantlararasında daha yüksek vücut kitle indeksi (VKİ) ile en güçlü ilişkiyi sergileyen 6,7 ve çeşitli gen-çevreetkileşimleri 8,9, bej adiposit farklılaşmasını ve fonksiyonunu olumsuz yönde düzenlediği bildirilmiştir10. Peroksizom proliferatör-aktive reseptör γ (PPARγ), adipogenezin ana transkripsiyonel düzenleyicisi olarak bilinir ve adiposit farklılaşması için gerekli ve yeterlidir11. 16 (PRDM16), erken b hücre faktörü 2 (EBF2) ve nükleer faktör I-A (NFIA) içeren PRD1-BF1-RIZ1 homolog alan gibi transkripsiyonel düzenleyiciler, kahverengi ve bej adiposit farklılaşması ve fonksiyonu 12,13,14,15,16,17,18 için çok önemlidir. Öte yandan, beyaz adiposit gen programlaması, transdüsin benzeri arttırıcı protein 3 (TLE3) ve çinko parmak proteini 423 (ZFP423) 19,20,21 gibi transkripsiyonel düzenleyiciler gerektirir.
İn vitro model sistemler, adipositlerin fonksiyon ve disfonksiyonlarının altında yatan mekanizma(lar)ın daha iyi anlaşılmasını amaçlayan moleküler çalışmaların yapılmasını sağlar. 3T3-L1 ve 3T3-F442A gibi halka açık ve ölümsüzleştirilmiş preadiposit hücre hatları22,23,24 mevcut olmasına rağmen, primer preadipositlerin kültürü ve adipositlere farklılaşması, in vivo adipogenezi incelemek için daha uygun bir model olacaktır. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu, primer preadipositlerin25,26 elde edilmesinde iyi bilinen bir yöntemdir. Bununla birlikte, genellikle tüp raflı bir bakteriyel çalkalayıcı kullanılarak gerçekleştirilen yağ dokusunun kollajenaz sindirimi, deneysel varyasyona neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir27,28. Burada, SVF'nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için nazik bir manyetik aktive hücre sıralama (MACS) doku ayrıştırıcısı kullanan alternatif bir protokolü açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri, Tokyo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Tokyo Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir.
1. Enzim çözeltisinin ve ortamının hazırlanması
- Kasık beyaz yağ dokusunun her iki tarafını (sağ ve sol taraf, yaklaşık 150 mg) 7-8 haftalık bir fareden ve 2.5 mL enzim çözeltisini dissosiyatörün tüp C'sine koyun.
- Fetal sığır serumu (FBS) veya antibiyotik olmadan 3 mL Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM)/F12 ile D enzimini, FBS veya antibiyotik olmadan 2,7 mL DMEM/F12 ile Enzim R'yi ve 1 mL tampon A ile Enzim A'yı yeniden oluşturun.
- C tüpüne FBS veya antibiyotik olmadan 100 μL Enzim D, 50 μL Enzim R, 12.5 μL Enzim A ve FBS veya antibiyotik içermeyen 2.35 mL DMEM / F12 ekleyerek 2.5 mL enzim çözeltisi hazırlayın.
2. Yağ dokusunun izolasyonu
- Servikal çıkık ile 7-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri (yaklaşık 20 g) ötenazi yapın.
- Temiz bir tezgahta, kasık beyaz yağ dokusunu izole etmek için, cildi karın bölgesinde ve alt ekstremitelere doğru künt / keskin makasla kesin. Yağ dokusunu uylukların içinden keskin/keskin makas kullanarak izole edin. Kasık yağ dokusunun bir tarafı ~ 75 mg genişliğindedir.
- İzole yağ dokusunu buz üzerinde enzim çözeltisi ile tüp C'ye koyun ve steriliteyi korumak için tüpü temiz tezgahın içinde tutun.
3. Yağ dokusunun kıyılması ve sindirimi
- Temiz tezgahta, C tüpüne 2.5 mL enzim çözeltisi ekleyin.
- Yağ dokusunu keskin/keskin makasla 50 kez keserek küçük parçalara ayırın. Yağ dokusunu ~ 2 mm2 parçaya bölün.
- C tüpünün kapağını sıkıca kapatın, tüpü baş aşağı çevirin ve kapak açıkken doku ayrıştırıcısının manşonuna takın. Ardından, numuneyi 37 ° C'de ~ 40 dakika sindirin.
NOT: Bu çalışmada Isıtıcılı gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec 130-096-427) kullanılmış ve önceden yüklenmiş "37C_mr_ATDK_1" programı takip edilmiştir.
4. Hücre süspansiyonunun filtrasyonu
- 37 ° C'ye kadar% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren önceden ısıtılmış DMEM / F12.
- C tüpünü doku ayrıştırıcısından ayırın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 5 mL DMEM / F12 ekleyerek ve dört kez hafifçe pipetleyerek sindirimi durdurun.
- 20 °C'de 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj.
- Hücre topağını rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren 10 mL DMEM/F12 ekleyerek ve beş kez hafifçe pipetleyerek pelet süspansiyonunu yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu, yeni bir 50 mL tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm çapında bir hücre süzgeci ile filtreleyin.
- 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın ve peletleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
5. Hücre kaplama
- 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren 10 mL DMEM/F12 ekleyerek ve on kez pipetleyerek peleti yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik kollajen kaplı bir tabağa koyun ve bulaşıkları 1-2 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin.
NOT: Kollajen kaplı tabaklar kesinlikle gerekli değildir. Bununla birlikte, deneyime dayanarak, kollajen kaplı yemekler preadipositlerin yapışmasına yardımcı olur ve böylece hücrelerin hayatta kalmasını arttırır. - Ortamı aspire edin ve hücreleri yıkama başına 3 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren 10 mL DMEM/F12 ekleyin ve bulaşıkları hücre kültürü inkübatörüne (37 °C, %5 CO2) geri koyun.
6. Preadipositlerin geçişi
- Ertesi gün, ortamı aspire edin (hücreler yapışkan olacaktır ve böylece ortam aspire edilebilir), hücreleri yıkama başına 3 mL PBS ile iki kez yıkayın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 10 mL DMEM / F12 ekleyin.
- Hücreler% 80 birleşime ulaştığında (genellikle SVF izolasyonundan 4 gün sonra), hücreleri dört adet 10 cm'lik kollajen kaplı kaba bölün.
- Spesifik olarak, ortamı aspire edin, hücreleri PBS (oda sıcaklığı [RT]) ile yıkayın, 1 mL önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin ekleyin ve hücre kültürü inkübatöründe 5 dakika inkübe edin.
- Tripsin aktivitesini söndürmek için% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 10 mL DMEM / F12 ekleyin. Pipetlemeden sonra, 5 dakika boyunca 440 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatanı aspire edin,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 40 mL DMEM / F12 ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri dört adet 10 cm'lik kollajen kaplı kapta kaplayın.
- Hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıklarında tekrar geçirin.
7. Preadipositlerin ölümsüzleştirilmesi için SV40 büyük T antijenini eksprese eden retrovirüsün hazırlanması (isteğe bağlı)
- Ölümsüzleştirmeden en az 3 gün önce, plaka Platinum-E (Plat-E) ambalaj hücreleri29 3.0 x 10 yoğunlukta5 hücre/mL DMEM içinde 2 mL DMEM içinde% 10 FBS antibiyotiksiz. Hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
- Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre, Lipofectamine 2000 kullanarak 4 μg pBABE-neo largeTcDNA transfekt edin (gen plazmidi # 1780 ekleyin).
- 24 saat sonra, ortamı aspire edin ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile 2 mL DMEM ekleyin.
- Ertesi gün, retroviral süpernatanı hasat edin. Retrovirüs hemen ölümsüzleştirme için kullanılabilir veya -80 ° C'de saklanabilir.
8. SV40 büyük T antijeni ile preadipositlerin ölümsüzleştirilmesi (isteğe bağlı)
- SVF izolasyonundan sonra preadipositlerin iki kez geçişi ve genişletilmesi.
- Hücreleri 6 delikli plakalarda 0.5-1.0 x 10 yoğunlukta4 hücre/mL 2 mL DMEM/F12 ile %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile plakalayın. Hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
- Ertesi gün, 6 delikli plakaların kuyucuğu başına SV40 büyük T antijenini eksprese eden 250 μL taze veya çözülmüş retrovirüs hazırlayın. 5 dakika boyunca 440 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe yerleştirin.
- Çalışma virüsünü yapmak için% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 750 μL DMEM / F12 ve 250 μL retroviral süpernatant başına 1 μL polibren ekleyin.
- Ortamı aspire edin ve preadipositleri içeren her bir kuyucuğa 1.000 μL çalışan retrovirüs ekleyin.
- 4 saat sonra% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile 1 mL DMEM / F12 ekleyin.
- Ertesi gün, enfekte preadipositleri 10 cm'lik bir kaba ayırın ve% 10 FBS,% 1 penisilin-streptomisin ve 500 μg / mL neomisin içeren DMEM / F12 ile enfekte olmuş hücreleri seçin. Antibiyotik seçimini izlemek için, neomisin ile enfekte olmamış hücrelerden oluşan bir tabak hazırlayın.
- Monitör çanağındaki tüm enfekte olmamış hücreler ölene kadar enfekte olmuş hücreleri neomisin ile geçirmeye devam edin.
9. Adiposit farklılaşması
- Hücreleri plakalayın. 12 delikli plakalar için, hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 1 mL DMEM / F12 içinde 4.0 x 104 hücre / mL yoğunlukta plakalayın.
- Preadipositler birleştiğinde (kaplamadan 48-72 saat sonra), ortamı aspire edin ve farklılaşma ortamı ile değiştirin (kompozisyon için Tablo 1'e bakınız).
- Farklılaşmanın 2. gününde (yani, farklılaşmayı indükledikten 48 saat sonra), ortamı bakım ortamı ile değiştirin (kompozisyon için Tablo 1'e bakınız). Daha sonra, bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin. Terminal farklılaşması, farklılaşmanın 7. gününde elde edilir.
- Yağ kırmızısı o boyama
- Yağ kırmızısı o boyama için, ortamı aspire edin ve hücreleri kuyucuk başına 1 mL PBS ile durulayın. Kuyucuk başına 1 mL% 4 formaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin ve hücreleri RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında,% 0.5 yağ kırmızısı o stok çözeltisini (izopropil alkolde)ddH2O kullanarak% 0.3'e seyreltin ve çalışma çözeltisini bir filtre kağıdı kullanarak filtreleyin.
- 15 dakikalık inkübasyondan sonra, formaldehiti çıkarın, hücreleri% 60 izopropil alkol ile durulayın, 1 mL filtrelenmiş yağ kırmızı o çalışma çözeltisi ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, hücreleri akan suyla yıkayın. Daha sonra, lipit yüklü adipositleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin (büyütme: 20x objektif ve 10x göz merceği).
- mRNA ekspresyon analizi
NOT: Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi için Tablo 2'ye bakınız.- Ortamı aspire edin ve kuyuya 1 mL / kuyu trizol ekleyin.
- RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin, pipetleme ile hücreleri ayırın ve numuneleri 1,5 mL tüplerde toplayın. Numuneler RNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklanabilir.
- Dondurulmuş numuneyi RT'ye çözün, numuneye 200 μL kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın.
- Numuneyi RT'de 3 dakika inkübe edin ve ardından 4 ° C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'de döndürün.
- Sulu fazı (üst, renksiz) dikkatlice çıkarın ve yeni tüplere aktarın. Protein fazını (orta, beyaz) veya fenol/kloroform fazını (alt, pembe) asla transfer etmeyin.
- Yavaşça eşit hacimde% 70 EtOH ekleyin ve yavaşça karıştırın. Vorteks yapmayın.
- Numuneyi (700 μL'ye kadar) bir toplama tüpüne oturtulmuş bir RNA spin sütununa yükleyin. Oluşmuş olabilecek herhangi bir çökeltiyi dahil ettiğinizden emin olun.
- 4 °C'de 30 s için 9.000 x g'de döndürün ve ardından akışı atın.
- 700 μL tampon RW1 ekleyin, 4 °C'de 30 s boyunca 9.000 x g'de döndürün ve ardından akışı atın.
- Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 500 μL tampon RPE ekleyin.
- 4 °C'de 30 sn boyunca 9.000 x g'de döndürün ve ardından akışı atın.
- 500 μL tampon RPE ekleyin, 4 °C'de 2 dakika boyunca 9.000 x g'de döndürün ve ardından akışı atın.
- Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 1-2 dakika boyunca 9.000 x g'de döndürün (tamponsuz sütunlar).
- Kolonu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın ve doğrudan kolon membranına 30 μL RNaz içermeyen su ekleyin.
- Numuneyi RT'de 1-2 dakika inkübe edin. Daha sonra, RNA'yı çıkarmak için 4 ° C'de 1 dakika boyunca 9.000 x g'de döndürün.
- Bir florospektrometre kullanarak RNA konsantrasyonunu kontrol edin.
NOT: Konsantrasyonun burada hizalanması önerilir. - ~ 200 ng RNA şablonu kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Ticari bir kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR-RT) kiti kullanın ve üreticinin protokolünü izleyin. Reaksiyondan sonra, cDNA'yı 20 kez 200 μL'ye kadar seyreltin.
- 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR ileri astar, 0,018 μL 100 μM qPCR ters astar ve 0,96 μL ddH2O ekleyin.
- Bir qPCR çalıştırın (tutma aşaması: 2 dakika boyunca 50 °C ve 2 dakika boyunca 95 °C; PCR aşaması: 15 s için 95 °C ve 1 dakika boyunca 60 °C'lik 40 döngü; erime eğrisi aşaması: 15 s için 95 °C, 1 dakika için 60 °C ve 15 s için 95 °C). Niceleme için standart eğri yöntemini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, adiposit farklılaşmasını indükledikten 7 gün sonra tamamen farklılaşmış, lipid yüklü adipositler verir. Adiposit farklılaşma derecesi, trigliseritlerin ve lipitlerin yağ kırmızısı o boyaması (Şekil 1A) veya adipogenez Pparg'ın ana düzenleyicisi ve hedef Fabp4 gibi adiposit genlerinin qPCR-RT'si kullanılarak mRNA ekspresyon analizi ile değerlendirilebilir (Şekil 1B). İn vitro bej adiposit farklılaşmasını indüklemek için, rosiglitazon gibi bir PPARγ agonistinin tiazolidinedionlar sınıfı kullanılabilir. Gerçekten de, rosiglitazon ile yapılan deneylerde, Ucp1 ve Ppargc1a gibi kahverengi yağa özgü genlerin ekspresyon seviyeleri üzerinde 1 μM'ye kadar konsantrasyonların doza bağımlı bir etkisini gözlemliyoruz. Öte yandan, rosiglitazonun Fabp4 üzerindeki etkisi 0.1 μM'lik bir konsantrasyonda doyurulur (Şekil 1C).
Bu protokol ile elde edilen farklılaşmış adipositler, oksijen tüketim hızı (OCR) analizi16,30 (Şekil 2A) ve kromatin immünopresipitasyonu 31 (ChIP; Şekil 2B). Ölümsüzleştirilmiş preadipositler, canlılık kaybı olmadan sıvı azot hücresi depolama sisteminde saklanabilir ve deneylerde kullanılmak üzere herhangi bir zamanda çözülebilir.
Şekil 1: Preadipositlerin lipid yüklü adipositlere farklılaşması . (A) Vahşi tip farelerin inguinal beyaz yağ dokusundan (iWAT) elde edilen SVF'ler, adiposit farklılaşmasının 0. veya 7. gününde yağ kırmızısı o ile boyandı. (B) Adiposit farklılaşmasının 0. ve 7. günlerinde Pparg ve Fabp4'ün mRNA ekspresyon seviyeleri (ortalamanın [S.E.M.] ± standart hatası; N = 3). (C) 0.1, 0.2, 0.5 ve 1.0 μM rosiglitazon ile muamele edilen SVF türevli adipositlerde genel adiposit belirteci Fabp4 ve kahverengi yağa özgü genler Ucp1 ve Ppargc1a'nın mRNA ekspresyonu, farklılaşma ve bakım ortamı ile birlikte. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Diferansiye adipositlerle fonksiyonel ve mekanik analiz örnekleri. (A) iWAT SVF kaynaklı adipositlerin OCR analizi (N = 10). (B) Farklılaşmanın 0. ve 7. günlerinde Nfia floks/floks iWAT SVF türevli adipositlerde H3K27Ac için ChIP-qPCR. Ins-0,4 kb ve Fabp4-13 kb sitesi arka plan siteleri olarak gösterilir (S.E.M. ± ortalama; N = 2). Her iki deney için, bej adiposit farklılaşmasını indüklemek için farklılaşma ve bakım ortamı ile birlikte 1.0 μM rosiglitazon eklenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Farklılaşma ve bakım ortamının bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, preadipositler elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için SVF'nin murin yağ dokusundan izole edilmesi için bir protokol tanımlandı. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısının kullanılması, deneysel çeşitliliği azalttı, kontaminasyon riskini azalttı ve tekrarlanabilirliği arttırdı. Bu prosedür sunulan protokol içinde kritik bir adım olsa da, süreç son derece otomatiktir ve optimizasyona gerek yoktur. Bununla birlikte, fare yaşına ve yağ dokusu deposuna bağlı olarak, kıymanın optimizasyonu, örneğin parça boyutu veya kesme süresi gerekebilir.
SVF, preadipositler, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri ve diğer hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon olarak bilinir. Preadipositler kültür yemeklerine yapıştıklarından ve yıkama ve ortam değişikliklerine toleranslı olduklarından, pasajlar sırasında hücre popülasyonunda zenginleşirler. Bununla birlikte, bu protokolle elde edilen "preadipositlerin" hala heterojen olduğunu varsaymak mantıklıdır. Daha saf bir preadiposit popülasyonu elde etmek için PDGFRα32 gibi preadipositlerin daha önce bildirilen yüzey belirteçlerine karşı antikorlar kullanarak floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) gerekli olacaktır.
Özetle, burada kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanarak SVF izolasyonu için bir protokol tanımladık. Bu protokol, SVF'nin tüp raflı bir bakteri çalkalayıcı kullanan geleneksel protokole kıyasla daha kolay izole edilmesini sağlar ve daha az deneysel varyasyon, daha az kontaminasyon ve daha fazla tekrarlanabilirlik sağlar16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin bu eserle ilgili rakip bir finansal çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, deneysel yardımları için Takahito Wada ve Saiko Yoshida'ya (Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya) teşekkür eder. Bu çalışma YH'ye aşağıdaki hibelerle finanse edilmiştir: Tokyo Üniversitesi Mükemmel Genç Araştırmacı Programı'ndan araştırma hibesi; Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) KAKENHI Erken Kariyer Bilim İnsanları için Yardım Hibesi, hibe numarası 19K17976; Japonya Uygulamalı Enzimoloji Vakfı'ndan Gelecekteki Diyabet Araştırmalarının Ön Koşucusu (FFDR) için hibe, hibe numarası 17F005; Farmakolojik Araştırma Vakfı'ndan hibe; Mochida Memorial Tıbbi ve Farmasötik Araştırma Vakfı'ndan hibe; MSD Yaşam Bilimleri Vakfı'ndan hibe; Daiwa Menkul Kıymetler Sağlık Vakfı'ndan hibe; Tokyo Biyokimyasal Araştırma Vakfı'ndan hibe; Takeda Bilim Vakfı'ndan Yaşam Bilimleri Araştırma bursu; ve SENSHIN Tıbbi Araştırma Vakfı'ndan hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
