Summary
Detta protokoll beskriver den halvautomatiska isoleringen av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och uppnå adipocytdifferentiering in vitro. Användning av en vävnadsdissociator för kollagenassmältning minskar experimentell variation och ökar reproducerbarheten.
Abstract
In vitro-studien av vit, brun och beige adipocytdifferentiering möjliggör undersökning av cellautonoma funktioner hos adipocyter och deras mekanismer. Odödliga vita preadipocytcellinjer är allmänt tillgängliga och används ofta. Framväxten av beige adipocyter i vit fettvävnad som svar på externa signaler är emellertid svår att rekapitulera i full utsträckning med hjälp av allmänt tillgängliga vita adipocytcellinjer. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad utförs vanligen för att erhålla primära preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering. Malning och kollagenasnedbrytning av fettvävnad för hand kan dock resultera i experimentell variation och är benägen för kontaminering. Här presenterar vi ett modifierat halvautomatiskt protokoll som använder en vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF, i syfte att minska experimentell variation, minska kontaminering och öka reproducerbarheten. De erhållna preadipocyterna och differentierade adipocyterna kan användas för funktionella och mekanistiska analyser.
Introduction
Fettvävnadsbiologi har väckt allt större uppmärksamhet på grund av den växande förekomsten av fetma och typ 2-diabetes globalt1. Adipocyter lagrar överflödig energi i form av lipiddroppar, som frigörs vid svält. Dessutom upprätthåller fettvävnad systemisk energihomeostas genom att fungera som ett endokrint organ och kommunicera med andra vävnader 2,3. Intressant nog är både överskott av fettvävnad (fetma) och fettförlust (lipodystrofi) kopplade till insulinresistens och diabetes1. Adipocyter är indelade i tre typer: vit, brun och beige1. Vita adipocyter lagrar huvudsakligen överskottsenergi som lipider, medan bruna och beige adipocyter sprider energi i form av värme via mitokondriell frikopplingsprotein-1 (Ucp1)1,4. I synnerhet förekommer beige adipocyter (även kallade "inducerbara" bruna adipocyter) i vit fettvävnad som svar på kall eller sympatisk stimulering och uppvisar genuttrycksmönster som överlappar men skiljer sig från de "klassiska" bruna adipocyterna5. Nyligen har bruna och beige adipocyter förväntats som potentiella mål för behandlingar mot fetma och diabetes som syftar till att "förbättra energiavledningen" snarare än att "undertrycka energiintaget"4. Stödjande rapporteras riskallelen av FTO-fetmavarianten rs1421085 hos människor, som uppvisar den starkaste kopplingen till högre kroppsmassindex (BMI) bland vanliga varianter 6,7 och uppvisar olika gen-miljöinteraktioner8,9, att negativt reglera beige adipocytdifferentiering och funktion10. Peroxisomproliferatoraktiverad receptor γ (PPARγ) är känd som en mastertranskriptionsregulator för adipogenesis och är nödvändig och tillräcklig för adipocytdifferentiering11. Transkriptionsregulatorer, såsom PRD1-BF1-RIZ1 homolog domän innehållande 16 (PRDM16), tidig b-cellfaktor 2 (EBF2) och kärnfaktor I-A (NFIA), är avgörande för brun och beige adipocytdifferentiering och funktion 12,13,14,15,16,17,18. Å andra sidan kräver programmering av vita adipocytgener transkriptionsregulatorer, såsom transducinliknande förstärkareprotein 3 (TLE3) och zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro-modellsystem möjliggör molekylära studier som syftar till att förbättra förståelsen för mekanismerna bakom adipocyternas funktioner och dysfunktioner. Även om offentligt tillgängliga och odödliga preadipocytcellinjer såsom 3T3-L1 och 3T3-F442A existerar22,23,24, skulle odling av primära preadipocyter och differentiering till adipocyter vara en mer lämplig modell för att studera adipogenes in vivo. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad är en välkänd metod för att erhålla primära preadipocyter25,26. Kollagenasnedbrytning av fettvävnad, som vanligtvis utförs med hjälp av en bakteriell shaker med ett rörställ, kan dock resultera i experimentell variation och är benägen att kontaminera27,28. Här beskriver vi ett alternativt protokoll som använder en mild magnetaktiverad cellsortering (MACS) vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Tokyo och utfördes enligt de institutionella riktlinjerna från University of Tokyo.
1. Beredning av enzymlösning och medium
- Sätt båda sidor av inguinal vit fettvävnad (höger och vänster sida, cirka 150 mg) från en 7-8 veckor gammal mus och 2,5 ml enzymlösning i dissociatorns rör C.
- Rekonstituera enzym D med 3 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM)/F12 utan fetalt bovint serum (FBS) eller antibiotika, enzym R med 2,7 ml DMEM/F12 utan FBS eller antibiotika och enzym A med 1 ml buffert A.
- Bered 2,5 ml enzymlösning genom att tillsätta 100 μl enzym D, 50 μl enzym R, 12,5 μl enzym A och 2,35 ml DMEM / F12 utan FBS eller antibiotika i rör C. Ställ röret C med enzymlösning på is.
2. Isolering av fettvävnad
- Avliva 7-8 veckor gamla manliga C57BL / 6J-möss (cirka 20 g) genom cervikal dislokation.
- Vid en ren bänk, för att isolera inguinal vit fettvävnad, skär huden med trubbig / vass sax vid buken och mot de nedre extremiteterna. Isolera fettvävnaden från insidan av låren med en vass/vass sax. Ena sidan av inguinal fettvävnad wieghs ~ 75 mg.
- Lägg den isolerade fettvävnaden i rör C med enzymlösning på is och håll röret i den rena bänken för att bibehålla steriliteten.
3. Hackning och matsmältning av fettvävnad
- Tillsätt 2,5 ml enzymlösning till rör C vid den rena bänken.
- Finhacka fettvävnaden i små bitar genom att klippa med vass/vass sax 50 gånger. Skär fettvävnaden i ~ 2 mm2 bitar.
- Stäng locket på röret C, vänd röret upp och ner och fäst det på hylsan på vävnadsdissociatornmed locket på. Smält sedan provet i ~40 minuter vid 37 °C.
OBS: Denna studie använde gentleMACS Octo Dissociator med värmare (Miltenyi Biotec 130-096-427), och det förinstallerade programmet "37C_mr_ATDK_1" följdes.
4. Filtrering av cellsuspension
- Förvärm DMEM/F12 innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin till 37 °C.
- Lossa röret C från vävnadsdissociatorn och stoppa matsmältningen genom att tillsätta 5 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin och försiktigt pipettera fyra gånger.
- Centrifugera vid 700 x g i 10 min vid 20 °C.
- Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Återsuspendera pelleten genom att tillsätta 10 ml DMEM/F12 innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin och försiktigt pipettera fem gånger.
- Filtrera cellsuspensionen genom en cellsil med en diameter på 70 μm placerad på ett nytt 50 ml rör.
- Centrifugera vid 250 x g i 5 minuter och suspendera pelleten igen i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
5. Cellplätering
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen genom att tillsätta 10 ml DMEM/F12 innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin och pipettera tio gånger.
- Platta cellsuspensionen på en 10 cm kollagendragen skål och placera diskarna i en cellodlingsinkubator (37 °C, 5%CO2) i 1-2 timmar.
OBS: Kollagenbelagda rätter är inte absolut nödvändiga. Baserat på erfarenhet hjälper dock kollagenbelagda rätter vidhäftningen av preadipocyter och ökar därmed cellernas överlevnad. - Aspirera mediet och tvätta cellerna två gånger med 3 ml PBS per tvätt.
- Tillsätt 10 ml DMEM/F12 innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin och lägg tillbaka diskarna i cellodlingsinkubatorn (37 °C, 5 %CO2).
6. Passage av preadipocyter
- Nästa dag, aspirera mediet (cellerna kommer att vara vidhäftande, och därmed kan mediet aspireras), tvätta cellerna två gånger med 3 ml PBS per tvätt och tillsätt 10 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- När cellerna når 80% sammanflöde (vanligtvis 4 dagar efter SVF-isolering), dela cellerna i fyra 10 cm kollagenbelagda rätter.
- Specifikt aspirera mediet, tvätta cellerna med PBS (rumstemperatur [RT]), tillsätt 1 ml förvärmt 0,05% trypsin och inkubera i 5 minuter i cellodlingsinkubatorn.
- Tillsätt 10 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin för att släcka trypsinaktiviteten. Efter pipettering, centrifugera vid 440 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten, suspendera cellerna igen genom att tillsätta 40 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin och platta cellerna i fyra 10 cm kollagenbelagda rätter.
- Passera cellerna igen när de når 80% sammanflöde.
7. Beredning av retrovirus som uttrycker SV40 stort T-antigen för odödliggörande av preadipocyter (valfritt)
- Minst 3 dagar före odödliggörande, platta Platinum-E (Plat-E) förpackningsceller29 vid en densitet av 3,0 x 105 celler / ml i 2 ml DMEM med 10% FBS utan antibiotika. Använd en hemacytometer för att räkna cellerna.
- Nästa dag, transfekt 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (tillsätt genplasmid #1780) med lipofectamine 2000, enligt tillverkarens instruktioner.
- Efter 24 timmar, aspirera mediet och tillsätt 2 ml DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Nästa dag, skörda den retrovirala supernatanten. Retroviruset kan användas för odödliggörande omedelbart eller förvaras vid -80 °C.
8. Odödliggörande av preadipocyter med SV40 stort T-antigen (valfritt)
- Passera och expandera preadipocyterna två gånger efter SVF-isolering.
- Platta cellerna i 6-brunnsplattor med en densitet av 0,5-1,0 x 104 celler / ml i 2 ml DMEM / F12 med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Använd en hemacytometer för att räkna cellerna.
- Nästa dag bereds 250 μL färskt eller tinat retrovirus som uttrycker SV40 stort T-antigen per brunn av 6-brunnsplattorna. Centrifugera vid 440 x g i 5 minuter och placera supernatanten i ett nytt rör.
- Tillsätt 750 μL DMEM/F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin och 1 μL polybrene per 250 μL retroviral supernatant för att göra arbetsviruset.
- Aspirera mediet och tillsätt 1 000 μL av det fungerande retroviruset till varje brunn som innehåller preadipocyter.
- Tillsätt 1 ml DMEM / F12 med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin 4 timmar senare.
- Nästa dag, separera de infekterade preadipocyterna i en 10 cm skål och välj de infekterade cellerna med DMEM / F12 innehållande 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin och 500 μg / ml neomycin. För att övervaka antibiotikavalet, förbered en maträtt av oinfekterade celler med neomycin.
- Fortsätt att passera de infekterade cellerna med neomycin tills alla oinfekterade celler i monitorskålen är döda.
9. Adipocytdifferentiering
- Platta cellerna. För plattor med 12 brunnar, platta cellerna med en densitet av 4,0 x 104 celler / ml i 1 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- När preadipocyterna blir sammanflytande (48-72 timmar efter plätering), aspirera mediet och ersätt det med differentieringsmedium (se tabell 1 för sammansättning).
- På dag 2 av differentieringen (dvs. 48 timmar efter inducering av differentiering), ersätt mediet med underhållsmedium (se tabell 1 för sammansättning). Byt sedan underhållsmediet var 2: e dag. Terminal differentiering uppnås vid dag 7 av differentiering.
- Olja röd o färgning
- För oljeröd o färgning, aspirera mediet och skölj cellerna med 1 ml PBS per brunn. Fixera cellerna genom att tillsätta 1 ml 4% formaldehyd per brunn och inkubera cellerna i 15 minuter vid RT.
- Under inkubationen späd 0,5% olja röd o stamlösning (i isopropylalkohol) till 0,3% medddH2Ooch filtrera arbetslösningen med ett filterpapper.
- Efter 15 minuters inkubation, avlägsna formaldehyden, skölj cellerna med 60% isopropylalkohol, tillsätt 1 ml filtrerad oljeröd o arbetslösning och inkubera i 1 h vid RT.
- Tvätta cellerna med rinnande vatten efter inkubationen. Observera sedan lipidbelastade adipocyter under ett inverterat mikroskop (förstoring: 20x objektiv och 10x okular).
- mRNA-uttrycksanalys
OBS: Se tabell 2 för listan över primers som används i denna studie.- Aspirera mediet och tillsätt 1 ml / brunn trizol till brunnen.
- Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur, lossa cellerna genom pipettering och samla proverna i 1,5 ml rör. Proverna kan förvaras vid -80 °C tills RNA-extraktion.
- Tina det frysta provet till RT, tillsätt 200 μl kloroform till provet och skaka kraftigt i 15 sekunder.
- Inkubera provet vid rumstemperatur i 3 minuter och snurra sedan vid 20 000 x g i 15 minuter vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort vattenfasen (topp, färglös) och överför till nya rör. Överför aldrig proteinfasen (mitten, vit) eller fenol/kloroformfasen (nederst, rosa).
- Tillsätt långsamt en lika stor volym 70% EtOH och blanda försiktigt. Virvla inte.
- Fyll provet (upp till 700 μl) i en RNA-spinnkolonn som sitter i ett uppsamlingsrör. Var noga med att inkludera eventuell fällning som kan ha bildats.
- Snurra vid 9 000 x g i 30 s vid 4 °C och kasta sedan genomflödet.
- Tillsätt 700 μl buffert RW1, snurra vid 9 000 x g i 30 s vid 4 °C och kasta sedan genomflödet.
- Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör och tillsätt 500 μL buffert RPE.
- Snurra vid 9 000 x g i 30 s vid 4 °C och kasta sedan genomflödet.
- Tillsätt 500 μl buffert-RPE, snurra vid 9 000 x g i 2 minuter vid 4 °C och kasta sedan genomflödet.
- Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör och snurra (kolonner utan buffert) vid 9 000 x g i 1–2 minuter vid 4 °C.
- Överför kolonnen till ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör och tillsätt 30 μl RNasfritt vatten direkt på kolonnmembranet.
- Inkubera provet vid rumstemperatur i 1-2 minuter. Snurra sedan vid 9 000 x g i 1 minut vid 4 °C för att eluera RNA.
- Kontrollera RNA-koncentrationen med hjälp av en fluorospektrometer.
OBS: Det rekommenderas att justera koncentrationen här. - Utför omvänd transkription med ~ 200 ng RNA-mall. Använd ett kommersiellt kvantitativt realtidspolymeraskedjereaktionssats (qPCR-RT) och följ tillverkarens protokoll. Efter reaktionen späds cDNA 20 gånger till 200 μl.
- Tillsätt 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR forward primer, 0,018 μL 100 μM qPCR reverse primer och 0,96 μL ddH2O till varje brunn på en 384-brunnsplatta.
- Kör en qPCR (håll steg: 50 ° C i 2 min och 95 ° C i 2 minuter; PCR-steg: 40 cykler vid 95 °C i 15 sekunder och 60 °C i 1 minut. smältkurvsteg: 95 °C i 15 sekunder, 60 °C i 1 minut och 95 °C i 15 sekunder). Använd standardkurvmetoden för kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll ger fullständigt differentierade, lipidbelastade adipocyter 7 dagar efter inducering av adipocytdifferentiering. Graden av adipocytdifferentiering kan utvärderas genom oljeröd ofärgning av triglycerider och lipider (figur 1A), eller mRNA-uttrycksanalys med qPCR-RT av adipocytgener, såsom huvudregulatorn för adipogenesis Pparg och dess mål Fabp4 (figur 1B). För att inducera beige adipocytdifferentiering in vitro kan en tiazolidindionklass av PPARγ-agonist, såsom rosiglitazon, användas. I experiment med rosiglitazon observerar vi faktiskt en dosberoende effekt av koncentrationer upp till 1 μM på uttrycksnivåerna för de bruna fettspecifika generna, såsom Ucp1 och Ppargc1a. Å andra sidan är effekten av rosiglitazon på Fabp4 mättad i en koncentration av 0,1 μM (figur 1C).
Differentierade adipocyter erhållna med detta protokoll kan användas för olika funktionella och mekanistiska analyser, såsom syreförbrukningshastighet (OCR) analys16,30 (figur 2A) och kromatinimmunoprecipitation 31 (ChIP; Figur 2B). Odödliga preadipocyter kan lagras i ett flytande kvävecelllagringssystem utan förlust av livskraft och kan tinas när som helst för användning i experiment.
Figur 1: Differentiering av preadipocyter till lipidbelastade adipocyter . (A) SVF från inguinal vit fettvävnad (iWAT) hos vildtypsmöss färgades med oljeröd o vid dag 0 eller 7 av adipocytdifferentiering. (B) mRNA-uttrycksnivåer av Pparg och Fabp4 dag 0 och dag 7 av adipocytdifferentiering (medelvärde ± standardfel för medelvärdet [S.E.M.]. N = 3). c) mRNA-uttryck av den allmänna adipocytmarkören Fabp4 och de bruna fettspecifika generna Ucp1 och Ppargc1a i SVF-härledda adipocyter behandlade med 0,1, 0,2, 0,5 och 1,0 μM rosiglitazon, tillsammans med differentierings- och underhållsmediet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på funktionella och mekanistiska analyser med differentierade adipocyter. (A) OCR-analys av iWAT SVF-härledda adipocyter (N = 10). (B) ChIP-qPCR för H3K27Ac i Nfiaflox/flox iWAT SVF-härledda adipocyter dag 0 och 7 av differentieringen. Webbplatsen Ins-0.4 kb och Fabp4-13 kb visas som bakgrundsplatser (medelvärde ± S.E.M.; N = 2). För båda experimenten tillsattes 1,0 μM rosiglitazon tillsammans med differentierings- och underhållsmediet för att inducera beige adipocytdifferentiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av differentierings- och underhållsmedium. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Listan över primers som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi ett protokoll för isolering av SVF från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering in vitro. Användningen av en vävnadsdissociator för kollagenasuppslutning minskade experimentell variation, minskade risken för kontaminering och ökad reproducerbarhet. Även om denna procedur är ett kritiskt steg inom det presenterade protokollet, är processen mycket automatiserad och optimering behövs inte. Beroende på musens ålder och fettvävnadsdepå kan optimering av malning, till exempel storlek eller skärtid, krävas.
SVF är känd som en heterogen population bestående av preadipocyter, immunceller såsom makrofager, endotelceller och andra celler. Eftersom preadipocyter fäster vid odlingsrätter och är toleranta mot tvätt och medelförändringar, berikas de i cellpopulationen under passagerna. Det är emellertid rimligt att anta att de "preadipocyter" som erhålls genom detta protokoll fortfarande är heterogena. Fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) med antikroppar mot tidigare rapporterade ytmarkörer av preadipocyter såsom PDGFRα32 skulle krävas för att erhålla en renare preadipocytpopulation.
Sammanfattningsvis beskrev vi här ett protokoll för SVF-isolering med hjälp av en vävnadsdissociatorn för kollagenasuppslutning. Detta protokoll erbjuder enklare isolering av SVF jämfört med det konventionella protokollet med en bakteriell shaker med ett rörställ och ger minskad experimentell variation, minskad kontaminering och ökad reproducerbarhet16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har ett konkurrerande ekonomiskt intresse relaterat till detta arbete.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Takahito Wada och Saiko Yoshida (University of Tokyo, Tokyo, Japan) för deras experimentella hjälp. Detta arbete finansierades av följande bidrag till Y.H.: forskningsbidrag från University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bidragsnummer 19K17976; bidrag till Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) från Japan Foundation for Applied Enzymology, bidragsnummer 17F005; anslag från Stiftelsen för farmakologisk forskning; bidrag från Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; bidrag från MSD Life Science Foundation; bidrag från Daiwa Securities Health Foundation; bidrag från Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research bidrag från Takeda Science Foundation; och bidrag från SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
