Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.
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Artículo de método
Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula
En este artículo
Resumen
Resumen
El corazón en desarrollo es una estructura compleja que contiene varias células progenitoras controladas por mecanismos reguladores complejos. El examen de la expresión génica y el estado de cromatina de las células individuales permite la identificación del tipo y estado celular. Los enfoques de secuenciación de células individuales han revelado una serie de características importantes de la heterogeneidad de las células progenitoras cardíacas. Sin embargo, estos métodos generalmente están restringidos al tejido fresco, lo que limita los estudios con diversas condiciones experimentales, ya que el tejido fresco debe procesarse de inmediato en la misma ejecución para reducir la variabilidad técnica. Por lo tanto, se necesitan procedimientos fáciles y flexibles para producir datos de métodos como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) en esta área. Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente núcleos para posteriores dualómicas de núcleos únicos (snRNA-seq y snATAC-seq combinados). Este método permite el aislamiento de núcleos a partir de muestras congeladas de células progenitoras cardíacas y puede combinarse con plataformas que utilizan cámaras microfluídicas.
Introducción
Entre los defectos congénitos, los defectos cardíacos congénitos (CHD) son los más comunes, que ocurren en aproximadamente el 1% de los nacidos vivos cada año 1,2. Las mutaciones genéticas se identifican sólo en una minoría de casos, lo que implica que otras causas, como las anomalías en la regulación génica, están implicadas en la etiología de la cardiopatía coronaria 2,3. El desarrollo cardíaco es un proceso complejo de diversos tipos de células que interactúan, lo que dificulta la identificación de mutaciones causales no codificantes y sus efectos s....
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Protocolo
El procedimiento animal adoptado en este estudio fue aprobado por los comités de ética animal de la Universidad de Aix-Marsella (C2EA-14) y se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité nacional de ética designado para la experimentación animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorización Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Configuración del apareamiento cronometrado antes de la disección
- Para generar embriones de ratón, realice un apareamiento cronometrado entre ratones adultos 9,5 días antes del aislamiento de la región cardíaca. En es....
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Resultados
En comparación con la preparación de suspensiones unicelulares para enfoques unicelulares, la preparación de suspensiones de un solo núcleo es mucho más desafiante y requiere un mayor grado de resolución y procesamiento. El factor clave para el éxito combinado de snRNA-seq y snATAC-seq es una suspensión de núcleos limpia e intacta. El protocolo para el aislamiento eficiente de los núcleos debe adaptarse a cada tipo de tejido y condición (fresco o congelado). Aquí, se describe un protocolo optimizado para el aislamiento d.......
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Discusión
El análisis de la composición celular del corazón en desarrollo por estudios combinados de snRNA-seq y snATAC-seq proporciona una comprensión más profunda del origen de la cardiopatía congénita26. Varios laboratorios de investigación han estudiado los efectos de la criopreservación del tejido cardíaco en snRNA-seq27. La realización de snRNA-seq y snATAC-seq utilizando tejido fresco microdisecado de modelos de ratón de enfermedades humanas puede ser un desafío logístico cuan.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por ERA-CVD-2019 y ANR-JCJC-2020 a SS. Agradecemos a la instalación de Genómica y Bioinformática (GBiM) del laboratorio de Genética Médica U 1251 / Marsella y a los revisores anónimos por proporcionar valiosos comentarios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | Sin número de catálogo | |
| 5M Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Kit de una sola célula, 16 rxns | 10X Genomics 1000230 | ||
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Paquete de reactivos de expresión génica, 4 rxns (incluido el tampón de núcleos 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess portaobjetos de la cámara de recuento de células | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | Sin número de catálogo | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher 14190094 | estéril y sin RNasa | |
| TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos | Fisher Scientific | ||
| Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 50 mL | Fisher Scientific | ||
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | de alta |
| sensibilidad | inactivado por calor Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Kit de eliminación de células muertas: Dead Cell Romoval MicroBeads, tampón de unión 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | Sin número de catálogo | |
| Penicilina Estreptomicina (Pluma/Estreptococo) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µ m | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Inhibidor de rocas | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Kit de índice único N Set A, 96 rxn | 10X Genomics 1000212 | ||
| Placa de Petri estándar de 90 mm Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Agua bidestilada estéril | Thermofisher | R0582 | |
| Clorhidrato de Trizma solución (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Tinción de Azul Trypan (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Tripsina 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Puntas de pipeta filtradas de orificio ancho 200 μ l | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | Sin número |
Referencias
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
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Reimpresiones y permisos
