Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.
Abstract
Das sich entwickelnde Herz ist eine komplexe Struktur mit verschiedenen Vorläuferzellen, die von komplexen Regulationsmechanismen gesteuert werden. Die Untersuchung der Genexpression und des Chromatinzustandes einzelner Zellen ermöglicht die Identifizierung des Zelltyps und -zustands. Einzelzell-Sequenzierungsansätze haben eine Reihe wichtiger Merkmale der kardialen Vorläuferzellheterogenität aufgezeigt. Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf frisches Gewebe beschränkt, was Studien mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen einschränkt, da das frische Gewebe im selben Durchlauf auf einmal verarbeitet werden muss, um die technische Variabilität zu reduzieren. Daher werden in diesem Bereich einfache und flexible Verfahren zur Datengewinnung aus Methoden wie der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und dem Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (snATAC-seq) benötigt. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur schnellen Isolierung von Zellkernen für nachfolgende Single-Nuclei-Dual-Omics (kombinierte snRNA-seq und snATAC-seq) vor. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Zellkernen aus gefrorenen Proben kardialer Vorläuferzellen und kann mit Plattformen kombiniert werden, die mikrofluidische Kammern verwenden.
Introduction
Unter den Geburtsfehlern sind angeborene Herzfehler (KHK) am häufigsten und treten jedes Jahr bei etwa 1 % der Lebendgeburtenauf 1,2. Genetische Mutationen werden nur in einer Minderheit der Fälle identifiziert, was darauf hindeutet, dass andere Ursachen, wie z. B. Anomalien in der Genregulation, an der Ätiologie der KHK beteiligt sind 2,3. Die kardiale Entwicklung ist ein komplexer Prozess verschiedener und interagierender Zelltypen, was die Identifizierung kausaler nicht-kodierender Mutationen und ihrer Auswirkungen auf die Genregulation schwierig macht. Die Organogenese des Herzens beginnt mit zellulären Vorläuferzellen, aus denen verschiedene Subtypen von Herzzellen hervorgehen, darunter Myokard-, Fibroblasten-, Epikard- und Endokardzellen 4,5. Die Einzelzellgenomik entwickelt sich zu einer Schlüsselmethode für die Untersuchung der Herzentwicklung und die Bewertung der Auswirkungen zellulärer Heterogenität auf Gesundheit und Krankheit6. Die Entwicklung von Multi-Omics-Methoden zur gleichzeitigen Messung verschiedener Parameter und der Ausbau von Rechenpipelines haben die Entdeckung von Zelltypen und -subtypen im normalen und erkrankten Herzen ermöglicht6. Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Einzelkern-Isolationsprotokoll für gefrorene kardiale Vorläuferzellen, das aus Mausembryonen gewonnen wurde und mit nachgeschalteten snRNA-seq und snATAC-seq (sowie snRNA-seq und snATAC-seq kombiniert) kompatibel ist7,8,9.
ATAC-seq ist eine robuste Methode, die die Identifizierung regulatorisch offener Chromatinregionen und die Positionierung von Nukleosomenermöglicht 10,11. Diese Informationen werden verwendet, um Rückschlüsse auf den Ort, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zu ziehen. Die Aktivität von Chromatinfaktoren, einschließlich Remodelern, sowie die Transkriptionsaktivität der RNA-Polymerase können somit analysiert werden, da die Methode für die Messung quantitativer Veränderungen in der Chromatinstruktur hochempfindlich ist 1,2. Somit bietet ATAC-seq einen robusten und unparteiischen Ansatz, um die Mechanismen aufzudecken, die die transkriptionelle Regulation in einem bestimmten Zelltyp steuern. ATAC-seq-Protokolle wurden auch validiert, um die Chromatinzugänglichkeit in einzelnen Zellen zu messen, was die Variabilität der Chromatinarchitektur innerhalb von Zellpopulationen aufzeigt10,12,13.
Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte auf dem Gebiet der Einzelzellen gegeben hat, besteht die Hauptschwierigkeit in der Verarbeitung der frischen Proben, die für die Durchführung dieser Experimente benötigt werden14. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, wurden verschiedene Tests mit dem Ziel durchgeführt, Analysen wie snRNA-seq und snATAC-seq mit gefrorenem Herzgewebe oder -zellen durchzuführen15,16.
Mehrere Plattformen wurden verwendet, um Einzelzell-Genomikdaten zu analysieren17. Die weit verbreiteten Plattformen für die Einzelzell-Genexpression und die ATAC-Profilerstellung sind Plattformen für die Verkapselung mehrerer mikrofluidischer Tröpfchen17. Da diese Plattformen mikrofluidische Kammern verwenden, können Schmutz oder Aggregate das System verstopfen, was zu unbrauchbaren Daten führt. Der Erfolg von Einzelzellstudien hängt also von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.
Das hier vorgestellte Protokoll verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, in denen snRNA-seq und snATAC-seq verwendet werden, um angeborene Herzfehler zu verstehen 18,19,20,21,22,23. Bei diesem Verfahren wird die enzymatische Dissoziation von frisch mikropräpariertem Herzgewebe mit anschließender Kryokonservierung von kardialen Vorläuferzellen der Maus verwendet. Nach dem Auftauen werden die lebensfähigen Zellen gereinigt und für die Kernisolierung aufbereitet. In dieser Arbeit wurde dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus der gleichen Kernpräparation von kardialen Vorläuferzellen der Maus zu erhalten.
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Protocol
Das in dieser Studie angewandte Tierverfahren wurde von den Tierethikkommissionen der Universität Aix-Marseille (C2EA-14) genehmigt und gemäß den Protokollen durchgeführt, die von der ernannten nationalen Ethikkommission für Tierversuche (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisierung Apafis Nr. 33927-2021111715507212).
1. Einrichten der zeitgesteuerten Paarung vor der Präparation
- Um Mausembryonen zu erzeugen, führen Sie 9,5 Tage vor der Isolierung der Herzregion eine zeitgesteuerte Paarung zwischen erwachsenen Mäusen durch. Bei diesem Verfahren wurden Wildtyp-C57BL/6J-Mäuse im Alter von 2-6 Monaten verwendet, und die zeitgesteuerte Paarung wurde über Nacht durchgeführt.
- Prüfen Sie am nächsten Morgen, ob die weiblichen Mäuse einen Vaginalpfropfen haben. Betrachten Sie den Tag, an dem der Pfropfen als embryonaler Tag (E) 0,5 identifiziert wird.
2. Gewebepräparation und Zellisolierung
- Euthanasieren Sie das 2-6 Monate alte trächtige Weibchen C57BL/6J am 9,5. Tag nach der Empfängnis über CO2 mit steigender Konzentration gefolgt von einer zervikalen Luxation. Reinigen Sie den unteren Teil des Bauches mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Die Verwendung von Anästhetika vor der Zervixluxation wird nicht empfohlen, da dies die Embryonen Umweltveränderungen aussetzen würde, die sich auf nachfolgende transkriptomische und epigenomische Studien auswirken könnten. - Öffnen Sie den Bauch und das Bauchfell mit einer Schere. Stellen Sie sich die Gebärmutterhörner vor und verwenden Sie eine Pinzette, um beide Hörner zu entfernen.
- Legen Sie die Hörner in eine Petrischale, die kaltes Komplettmedium mit 1% FBS enthält. Obwohl kein bestimmtes Volumen erforderlich ist, muss darauf geachtet werden, dass die Embryonen vollständig in das Medium eingetaucht sind. Ein ungefähres Volumen von 10 ml pro 10 cm Petrischale ist angemessen.
- Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop mit 5-facher Vergrößerung und mit einer Pinzette das Endometriumgewebe, die Plazenta und den Dottersack von jedem Embryo.
- Legen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit kaltem Komplettmedium mit 1% FBS. Die embryonale Herzregion, wie auf dem schematischen Embryo in Abbildung 1 beschrieben, wird in kaltem, vollständigem Medium präpariert.
- Die Herzregionen, die von fünf Mausembryonen präpariert wurden, werden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zusammengefasst. Vorkühlende Schwingeimerzentrifugen auf 4 °C.
- Bei 300x g für 1 min bei RT in einer Schwingeimerzentrifuge zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Gewebe, indem Sie 1 ml PBS in Gewebekulturqualität hinzufügen.
- Bei 300 x g für 1 min bei RT zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Waschschritte für insgesamt zwei Wäschen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal und ersetzen Sie das PBS durch 0,05% Trypsin/EDTA (1x).
- Für den Gewebeaufschluss 50 μl 0,25 % Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 °C zugeben. Wenden Sie nach 5 Minuten eine sanfte mechanische Dissoziation durch Auf- und Abgesten mit einer Filterspitze mit breiter Öffnung an.
- Inaktivieren Sie die Trypsin-Verdauungsaktivität, indem Sie den dissoziierten Zellen 350 μl vollständiges Medium hinzufügen. Die resuspendierten Zellen werden durch ein 40 μm großes Zellsieb geführt.
3. Zellzählung und Viabilitätsbewertung
HINWEIS: Die Zellzahl und die Viabilität sind entscheidende Parameter für den Erfolg von Einzelzellexperimenten. Der snATAC-seq-Ansatz reagiert empfindlich auf geringfügige Variationen in der Zellzahl. Zu wenige Zellen führen zu einer Überverdauung des Chromatins, was zu einer höheren Anzahl von Reads und der Kartierung unzugänglicher Chromatinregionen (Rauschen) führt. In ähnlicher Weise erzeugt zu viele Zellen hochmolekulare Fragmente, die schwer zu sequenzieren sind. Für die genaue Bestimmung der Zell- und Zellkernkonzentrationen wurden die Zellzahl und Viabilität mit zwei verschiedenen Methoden bewertet.
- Führen Sie einen Trypanblau-Assay für die Zellzählung durch, wie unten beschrieben.
- Vortex 0,4%ige Trypanblau-Färbelösung, 10 s bei Raumtemperatur bei 2.000 x g schleudern und 10 μl in ein Mikroröhrchen überführen.
- Mischen Sie die Zellsuspension mit einer Pipette und fügen Sie 10 μl Suspension zu den bereits aliquotierten 10 μl Trypanblaulösung hinzu. 10 Mal vorsichtig mit einer Pipette mischen.
- Übertragen Sie 10 μl der gefärbten Zellen in einen Zählobjektträger. Legen Sie den Objektträger in die Theke, um die Zellkonzentration und Viabilität automatisch zu berechnen.
- Führen Sie eine fluoreszenzbasierte Bewertung der Mortalität durch, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Dieser Assay basiert auf der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen (Ethidiumhomodimer-1, EthD-1 und Calcein AM) zur Bewertung der Zellviabilität. Es wurde ein handelsübliches Kit verwendet und die Anweisungen des Anbieters für die entsprechende Vorbereitung und Verwendung befolgt.- Bereiten Sie eine 10 μM EthD-1-Lösung vor, indem Sie 5 μl der mitgelieferten 2 mM EthD-1-Stammlösung zu 1 ml sterilem D-PBS in Gewebekulturqualität hinzufügen und 5 s lang vortexen, um eine vollständige Vermischung zu gewährleisten.
- Übertragen Sie 2,5 μL der mitgelieferten 4 mM Calcein AM-Stammlösung in die bereits hergestellte EthD-1-Lösung. 5 s lang vortexen, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
- 10 μL der resultierenden 10 μM EthD-1 und 10 μM Calcein AM-Arbeitslösung zu 10 μL Zellsuspension geben.
Anmerkungen: Calcein ist in wässrigen Lösungen sehr anfällig für Hydrolyse, verwenden Sie diese Arbeitslösung also innerhalb von 1 Tag. - Übertragen Sie 10 μL der gefärbten Zellen auf einen Zählobjektträger. Setzen Sie den Objektträger in den automatischen Fluoreszenzzellenzähler ein. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem GFP-Filter und die toten Zellen mit einem RFP-Filter.
ANMERKUNG: Die beiden Zählmethoden ergaben ähnliche Zellzahlen und Lebensfähigkeiten, und die Gesamtzahl der frisch dissoziierten Zellen wurde auf durchschnittlich etwa 20.000 Zellen pro embryonaler Herzregion geschätzt (0,06 mm3).
4. Einfrieren von Zellen
- Die Zellsuspension wird bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne den Boden des Röhrchens zu berühren, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml gekühltem Gefriermedium.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes Kryomaterial und legen Sie das Kryomaterial in einen vorgekühlten Gefrierbehälter.
- Stellen Sie den Behälter für 4 h bis 8 h auf −80 ◦C auf. Übertragen Sie das Kryomaterial in flüssigen Stickstoff für nachgeschaltete Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsexperimente.
Anmerkungen: Das Kryomaterial sollte vor der Verwendung auf Trockeneis transportiert werden. Unserer Erfahrung nach können die Zellen mindestens 6 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden, ohne dass die Zelllebensfähigkeit verloren geht. Die Lagertemperatur sollte immer unter −150 °C gehalten werden, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern.
5. Auftauen der Zellen und Entfernen abgestorbener Zellen
- Legen Sie die Kryoflaschen für 1-2 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad. Entfernen Sie es, wenn ein winziger Kristall im Kryoland verbleibt.
- Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) komplettes Medium hinzu. Dreimal mit einer Pipette mischen. Übertragen Sie die Suspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml warmem Komplettmedium.
- Die gesamte Zellsuspension wird über ein 30 μm Sieb geführt. Spülen Sie das Sieb mit 1-2 ml warmem Komplettmedium aus und sammeln Sie den Durchfluss im selben konischen Röhrchen.
- 5 min bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen. Einmal mit PBS waschen und die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.
- 5 min bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu zerstören.
- Geben Sie 100 μl der bereitgestellten magnetischen Mikrokügelchen in die pelletierten Zellen und homogenisieren Sie sie fünfmal mit einer Pipettenspitze mit breitem Bohrungsdurchmesser. 15 min bei RT inkubieren.
- Spülen Sie in der Zwischenzeit die magnetische Trennsäule (Fassungsvermögen: 1 x 107 bis 2 x 108 Zellen) mit 500 μL 1x Bindepuffer aus.
- Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, verdünnen Sie die Zellsuspension mit den Mikrokügelchen mit 500 μL 1x Bindungspuffer.
- Tragen Sie die Zellsuspension (0,6 μL) auf die vorbereitete magnetische Trennsäule auf. Der Durchfluss ist die negativ selektierte lebende Zellfraktion und die magnetisch zurückgehaltene Fraktion die positiv selektierten toten Zellen.
- Sammeln Sie das Lebendzellen-Abwasser in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das 1,5-ml-Mikroröhrchen, das die Zellsuspension enthielt, und die Säule mit 2 ml 1x-Bindungspuffer und sammeln Sie das Abwasser im selben 15-ml-Röhrchen.
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu beschädigen.
- Fügen Sie 1 ml der PBS-BSA-Lösung hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie fünfmal mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu beschädigen.
- Fügen Sie 1 ml PBS-BSA hinzu, um das Pellet zu resuspendieren, und wiederholen Sie den Waschschritt für insgesamt zwei Wäschen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS-BSA-Lösung. Vorsichtig durch 10-maliges Pipettieren mischen.
- Bestimmen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit den zuvor beschriebenen Methoden (Schritt 3.1 und Schritt 3.2). Um mit dem nächsten Schritt fortzufahren, stellen Sie eine Zellenanzahl von ≥100.000 Zellen sicher. In Abbildung 2 finden Sie repräsentative Ergebnisse.
HINWEIS: Die Kryokonservierung führt zu einem Verlust von ca. 40 % des ursprünglichen Ausgangsmaterials lebender Zellen. Abhängig von der Startanzahl der Zellen führt die Bead-Trennung auf einer magnetischen Säule zu einer hohen Zellviabilität, teilt aber die Gesamtzahl der Zellen um das Zwei- bis Fünffache. Die Verwendung eines säulenbasierten Magnetkits zur Entfernung der toten Zellen wird nur empfohlen, wenn ausreichend Ausgangsmaterial zur Verfügung steht.
6. Isolierung von Zellkernen
HINWEIS: Die Kombination von snATAC und snRNA-seq wird mit einer Suspension aus sauberen und intakten Kernen durchgeführt. Die Optimierung der Lysebedingungen (Lysezeit und NP40-Konzentration) für den verwendeten Zelltyp wird empfohlen. Der optimale Lysezeitpunkt und die optimale Detergenzienkonzentration führen dazu, dass die maximale Anzahl von Zellen lysiert wird, ohne die Kernmorphologie zu stören. Der Verlust von Zellen/Kernen kann durch den Einsatz einer Schwingeimerzentrifuge anstelle einer Festwinkelzentrifuge reduziert werden. Um die Retention von Zellkernen auf Kunststoffen zu minimieren, wird empfohlen, Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen mit geringer Retention zu verwenden. Dies kann die Zellkernerholung erhöhen. Die Beschichtung der Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen mit 5% BSA ist eine kostengünstigere, aber zeitaufwändigere Alternative.
- Reinigen Sie den Arbeitsplatz und die Materialien mit 70%igem Ethanol und RNase-Entfernungslösung.
- Vorkühlende Schwingeimerzentrifugen auf 4 °C. Lysispuffer, Lyseverdünnungspuffer, 0,1x Lysepuffer und Waschpuffer frisch zubereiten (siehe Tabelle 1). Halten Sie die Puffer auf Eis.
- Die Zellsuspension wird bei 500 x g für 5min bei 4 °C in einer Schwingeimerzentrifuge zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand, ohne den Boden des Röhrchens zu berühren, um ein Verschieben des Zellpellets zu vermeiden.
- Fügen Sie 100 μl gekühlten 0,1-fachen Lysepuffer hinzu. Vorsichtig mischen, indem Sie 10 Mal pipettieren. 5 Minuten auf Eis inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml gekühlten Waschpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch fünfmaliges Pipettieren. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Kernpellet zu zerstören.
- Wiederholen Sie die Wäschen mit gekühltem Waschpuffer für insgesamt drei Wäschen. Bereiten Sie den verdünnten Kernpuffer vor. Nach der Resuspension ist die Kernlösung auf Eis zu legen.
7. Qualitäts- und Quantitätsbewertungen der isolierten Kerne
Anmerkungen: Basierend auf der anfänglichen Zellzahl und einer Schätzung von etwa 50 % Zellkernverlust während der Zelllyse wird die entsprechende Anzahl von Zellen in kaltem, verdünntem Zellkernpuffer resuspendiert. Die Berechnung des Resuspensionsvolumens mit gekühltem, verdünntem Nukleepuffer basiert auf der angestrebten Zellkernrückgewinnung und den entsprechenden Kernbestandskonzentrationen, die in der Bedienungsanleitung des Herstellers empfohlen werden. Ein Beispiel für diese Berechnung finden Sie im Zusatzprotokoll 1.
- Basierend auf der anfänglichen Zellzahl und einer Schätzung von etwa 50 % Zellkernverlust während der Zelllyse wird die entsprechende Anzahl von Zellen in kaltem, verdünntem Zellkernpuffer resuspendiert.
- Bestimmen Sie die tatsächliche Kernkonzentration. Mischen Sie 2 μl Kernstammlösung mit 8 μl verdünntem Kernpuffer und geben Sie die Mischung in die voraliquotierten 10 μl Trypanblau- oder EthD-1/CalceinAM-Arbeitslösung. Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatisierten Zellzähler. Weniger als 5% der Zellen sollten lebensfähig sein. In Abbildung 3 finden Sie repräsentative Ergebnisse.
- Berechnen Sie das Volumen des Kernbestands und das Volumen des verdünnten Kernpuffers, um ein Gesamtvolumen von 5 μl bei der empfohlenen Konzentration für die Transpositionsreaktion zu erhalten (siehe Bedienungsanleitung des Herstellers). Fahren Sie sofort mit der Transpositionsreaktion gemäß der Bedienungsanleitung17 fort.
HINWEIS: Alle Schritte von der Transpositionsreaktion bis zum Aufbau der ATAC- und GEX-Bibliotheken wurden gemäß dem Benutzerhandbuch des Kits durchgeführt, das für snRNA-seq und snATAC-seq kombiniert verwendet wird17.
8. Qualitätsanalyse der Bibliotheken snRNA-seq und snATAC-seq
- Bevor Sie mit der Next-Generation-Sequenzierung fortfahren, validieren Sie die Qualität und Größenverteilung der endgültigen snATAC-seq- und Genexpressions-GEX-Bibliotheken. Bewerten Sie die Qualität und Quantität der in den Bibliotheken identifizierten Sequenzen mithilfe von Fragmentanalysesystemen. In Abbildung 4 finden Sie repräsentative Ergebnisse der Qualitätsbewertung.
ANMERKUNG: Die endgültige Spur der snATAC-seq-Bibliotheken sollte die Periodizität der Nukleosomenwicklung zeigen, und die Größen sollten von 200 bp bis zu mehreren Kbp reichen, während die Größen in der Genexpressionsbibliothek zwischen 300 bp und 600 bp liegen sollten.
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Representative Results
Im Vergleich zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Einzelzellansätze ist die Herstellung von Einzelkernsuspensionen wesentlich anspruchsvoller und erfordert einen höheren Auflösungs- und Verarbeitungsgrad. Der Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Kombination von snRNA-seq und snATAC-seq ist eine saubere und intakte Zellkernsuspension. Das Protokoll für eine effiziente Zellkernisolierung muss an jeden Gewebetyp und -zustand (frisch oder gefroren) angepasst werden. In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Zellkernen aus eingefrorenen embryonalen Herzzellen der Maus beschrieben. Alle Schritte von der Dissektion der embryonalen Herzregion über die Dissoziation der Herzzellen bis hin zur Zellkernisolierung sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Für das Ausgangsmaterial wird eine Zellzahl von 1 x 105-1 x 106 Zellen und eine Zellviabilität >70% für eine effiziente Zellkernisolierung empfohlen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, ermöglichte der zusätzliche Schritt, der in diesem Protokoll durchgeführt wurde, um die toten Zellen nach dem Auftauen zu sortieren und zu entfernen, eine sauberere Zellsuspension mit einer signifikant höheren Zellviabilität zu erhalten und die Qualität der Ausgangsprobe zu verbessern. Neben der Zellkernisolierung liefert dieses Protokoll detaillierte Informationen darüber, wie die Qualität und Quantität der isolierten Kerne zu beurteilen ist (Abbildung 3). Die Qualität der isolierten Kerne hat einen großen Einfluss auf die Qualität der kombinierten snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten. Hier wurde die Qualität der isolierten Kerne durch die Auswertung der Kernmembranmorphologie beurteilt. Die isolierten Kerne erschienen glatt und gleichmäßig rund, wie in Abbildung 3C gezeigt, unter Hellfeldmikroskopie, was auf einen effektiven Isolationsprozess hinweist. Um die Genauigkeit zu erhöhen, wurden zwei verschiedene Zählmethoden verwendet, darunter Trypanblau und ein Kit zur fluoreszenzbasierten Beurteilung der Lebensfähigkeit, um die Zellen und Kerne zu quantifizieren. Der Fluoreszenz-Assay wurde verwendet, um die Zellviabilität auf der Grundlage der zellulären Integrität und der intrazellulären Esteraseaktivität zu bestimmen. Diese Farbstofflösung ermöglicht die Unterscheidung lebender Zellen von toten Zellen, indem gleichzeitig grün fluoreszierendes Calcein AM, das die intrazelluläre Esteraseaktivität anzeigt, und rot fluoreszierendes Ethidiumhomodimer 1, das den Verlust der zellulären Integrität widerspiegelt, sichtbar gemacht werden. Die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs zum Zählen hilft, Zellkerne von Zellklumpen und Trümmern zu unterscheiden. Mit diesem Protokoll sank die Zellviabilität von 80%-90% vor der Zellkernisolierung auf <5% nach der Zellkernisolierung, wie in Abbildung 3A,B dargestellt.
Unser Verfahren wurde mit der bestehenden Methode verglichen, bei der frisches Gewebe direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und der Lyseschritt ohne vorherige enzymatische Dissoziation durchgeführt wird (Zusatzprotokoll 2 und ergänzende Abbildung 1). Beide Ansätze wurden getestet, um festzustellen, welche Methode eine qualitativ bessere Kernsuspension ergibt. Das Einfrieren des gesamten embryonalen Herzgewebes führte zu einem hohen Prozentsatz nicht lysierter Zellen, die als lebend erkannt wurden, was auf eine inadäquate Zelllyse hindeutet (ergänzende Abbildung 1A). Aggregate und nicht-individuelle Zellen wurden trotz Filtration durch Filter beobachtet (ergänzende Abbildung 1A,B).
Die isolierten Zellkerne wurden verwendet, um Bibliotheken für gemeinsame snATAC-seq und snRNA-seq zu generieren. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der Qualitätskontrolle der cDNA, die für den Aufbau der Genexpressionsbibliothek (GEX) und der ATAC-Bibliothek verwendet wird. Die Qualitätskontrolle erfolgte mittels automatisierter Elektrophorese (Abbildung 5A). Die aus mRNA gewonnenen cDNAs wurden quantifiziert und die Ausbeute reichte für die spätere Verwendung in der GEX-Bibliothekskonstruktion aus. Es wurden eine hochwertige GEX-Bibliothek im Bereich von ~300 bp bis 600 bp und eine hochwertige ATAC-Bibliothek mit periodischer Nukleosomenwicklung im Bereich von 200 bp bis 7 kbp erhalten. Diese Bibliotheken wurden durch Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert und generierten erfolgreich die Genexpression und Chromatinzugänglichkeit im Einzelkern (Abbildung 5A). Diese Rohdaten konnten demultiplext und bioinformatisch analysiert werden, um ein transkriptionelles und epigenetisches Profil von E9.5-Vorläuferzellen der Maus zu erstellen. SnRNA-seq und snATAC-seq wurden auf der Grundlage bekannter Markergene mittels unüberwachtem Clustering mit dem Seurat-Toolkit für Einzelgenomik geclustert, identifiziert und markiert24 . Diese erste Analyse bestätigte das Vorhandensein aller erwarteten Herzzelltypen bei E9.5 (Abbildung 5B).
Alle oben genannten Ergebnisse unterstützen den Erfolg dieses Protokolls bei der Isolierung von Zellkernen, die für nachgeschaltete Einzelkernansätze aus gefrorenen embryonalen Herzzellen geeignet sind.
Abbildung 1: Darstellung der wichtigsten Schritte in der Probenvorbereitung für das kombinierte snRNA-seq- und snATAC-seq-Profiling. Dieses Flussdiagramm rekapituliert alle Schritte, einschließlich der Dissektion von Herzgewebe und der Dissoziation von Herzzellen, des Einfrierens und Auftauens von Zellen, der Aufreinigung lebender Zellen durch Entfernen abgestorbener Zellen und der Isolierung von Zellkernen, die für den gleichzeitigen Nachweis der Zugänglichkeit von mRNA und Chromatin aus derselben Zelle durchgeführt werden. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; BSA = Rinderserumalbumin; RT = Raumtemperatur. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Viabilität der optimierten aufgetauten Zellen nach der Sortierung toter Zellen. Bilder, die die Zellzahl und Viabilität mit einem automatisierten Zellzähler vor (oben) und nach (unten) Entfernung toter Zellen mit dem Trypanblau-Ausschlussfarbstoff zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Zellkernpräparation. (A,B) Bilder, die die Zellzahl und Viabilität mit einem automatisierten Zellzähler vor (oben) und nach (unten) Zellkernisolierung zeigen. Es wurden zwei Zählmethoden verwendet: (A) der Fluoreszenz-Mortalitätstest und (B) der Trypan-Blau-Assay. (C) Bilder, die die Qualität der Kernisolierung zeigen. Die Bilder wurden mit 20x (Maßstabsbalken = 50 μm) mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Das Hellfeldbild (links) zeigt die Kernmorphologie; die Ausschreibung (Mitte) zeigt Zellen, die ihre Membranintegrität verloren haben, mit anderen Worten, isolierte Kerne; und das GFP (rechts), das normalerweise die Esteraseaktivität lebender Zellen anzeigt, bestätigt hier das Fehlen lebender Zellen in der Kernsuspension. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Qualitätskontrolle der Einzelzell-Genexpression und der ATAC-Bibliotheken. DNA-Analyse mit automatisierter Elektrophorese, die die Qualität und Größenverteilung der cDNA (oben), der GEX-Bibliothek (Mitte) und der ATAC-Bibliothek (unten) zeigt. Für die cDNA-Quantifizierung wurde die Zone von 200 bp bis 8.900 bp ausgewählt, und der Bioanalysator schätzte die cDNA-Konzentration (in pg/μL; roter Kreis). Es wurde eine ausreichende cDNA-Ausbeute erzielt, um mit dem Aufbau der GEX-Bibliothek fortzufahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Probenleistung, die mit der Cell Ranger-Software25 bewertet wurde. (A) Kreuzempfindlichkeitsdiagramm, das die Transpositionsereignisse in Peaks pro Barcode auf der x-Achse und RNA-eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs) pro Barcode auf der y-Achse zeigt. Erwartungsgemäß befinden sich die Zellen hauptsächlich in der oberen rechten Ecke, mit hohen RNA- und ATAC-Daten. Es wurde eine klare Trennung zwischen den Zellen und den Nicht-Zellen (leere GEMs, Hintergrundsignal) beobachtet. (B) Repräsentatives UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) aller erfassten Zellen in scRNA-seq (links) und scATAC-seq (rechts), eingefärbt nach Clusteridentität und gruppiert nach Zelltypen. Es wurde eine gute Trennung der Cluster beobachtet. Gemeinsame GEX- und ATAC-Rohdaten wurden durch die Sequenzierung von 7.000 Zellkernen aus der präparierten embryonalen Herzregion der E9.5-Maus gewonnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Qualitätskontrolle der Zellkernisolierung nach der bestehenden Methode, bei der frisches Gewebe direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren wird. (A) Bilder, die die Anzahl der isolierten Kerne unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers und Trypanblau als Ausschlussfarbstoff vor (oben) und nach (unten) Filtration durch ein 40-μm-Sieb zeigen. Ein hoher Prozentsatz von nicht-lysierten Zellen wurde als lebend detektiert. Der Nachweis von 20% lebenden Zellen deutet auf eine inadäquate Zelllyse hin. Die schwarzen Pfeile zeigen Aggregate an. (B) Bilder, die die Qualität der isolierten Kerne zeigen. Die Bilder wurden bei 20x (oben und in der Mitte mit einem Maßstabsbalken von 50 μm) und 40x (unten mit einem Maßstabsbalken von 25 μm) mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Das Hellfeldbild (links) zeigt die Kernmorphologie; Die Ausschreibung (rechts) zeigt Zellen, die ihre Membranintegrität verloren haben, also isolierte Zellkerne. Die schwarzen Pfeile zeigen Multiplets von Kernen an, die durch Trümmer verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 1: Tabelle der Puffer und Lösungen, die in der Prozedur verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusatzprotokoll 1: Beurteilung der Menge der isolierten Kerne. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzprotokoll 2: Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Analyse der zellulären Zusammensetzung des sich entwickelnden Herzens durch kombinierte snRNA-seq- und snATAC-seq-Studien liefert ein tieferes Verständnis der Entstehung von angeborenen Herzfehlern26. Mehrere Forschungslabore haben die Auswirkungen der Kryokonservierung von Herzgewebe auf snRNA-seq27 untersucht. Die Durchführung von snRNA-seq und snATAC-seq unter Verwendung von frischem, mikropräpariertem Gewebe aus Mausmodellen menschlicher Krankheiten kann beim Vergleich verschiedener Versuchsbedingungen eine logistische Herausforderung darstellen. Für ein bestimmtes Entwicklungsstadium besteht eine Schwierigkeit darin, dass die Kontroll- und Versuchsgruppe im selben Durchlauf verarbeitet werden müssen, um die technische Variabilität zu reduzieren, die durch die Probenverarbeitung entsteht. Wenn die Verarbeitung von frischem Gewebe nicht möglich ist, wird aufgrund unserer Ergebnisse empfohlen, das gesamte embryonale Herzgewebe zu dissoziieren und dann kryokonservieren, anstatt es einzufrieren. Die Wahl der einen Methode gegenüber der anderen beruht auf der Tatsache, dass es viel schwieriger ist, lebensfähige Einzelzellen nach dem Auftauen zu isolieren, wenn das Herzgewebe ganz eingefroren ist. Wenn das Gewebedissoziationsprotokoll jedoch nicht optimiert ist, kann es besser sein, das Gewebe als Ganzes einzufrieren. Die Dissoziation mit anschließender Kryokonservierung wird bevorzugt, da dieses Gewebedissoziationsprotokoll >90 % frische, lebensfähige Zellen ohne Zelltypverzerrung liefert.
Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile, wie z. B. die Verwendung von gefrorenen Zellen, wodurch frisches Gewebe überflüssig wird, und die Verwendung eines Einzelzell-Dissoziationsschritts, der die Isolierung intakter Einzelkerne ermöglicht. Dies ist in der Tat für die nachgelagerte Einzelzellanalyse von entscheidender Bedeutung. Die enzymatische Dissoziation kann jedoch zu transkriptionellen Verzerrungen in Zellpopulationen führen. Die enzymatische Zelldissoziation greift in die zelluläre Mikroumgebung ein und induziert so bei den meisten Zelltypen transkriptionelle Veränderungen28. Die primäre Determinante dieser Veränderungen ist die Dissoziationszeit, nicht der Zelltyp29. Um dissoziationsinduzierte Artefakte zu mildern, ist es wichtig, die empfohlene Verdauungszeit einzuhalten. Die veröffentlichte Literatur in verschiedenen Geweben deutet darauf hin, dass eine Verdauungszeit von 30 min oder weniger geringfügige transkriptionelle Veränderungen induziert28,30. Darüber hinaus könnten bioinformatische Interventionen eingesetzt werden, um Datenverzerrungen zu minimieren31,32.
Die Gewinnung reiner und intakter Einzelkerne ist der wichtigste Faktor in der Einzelkerngenomik. Die Verstopfung der mikrofluidischen Kammern von Einzelzellplattformen durch das Vorhandensein von Zellclustern oder organischen Ablagerungen führt zu einer schlechten Datenqualität oder, was noch problematischer ist, zum Scheitern von Experimenten. In diesem Verfahren wurden bestehende Protokolle modifiziert, indem enzymatische Dissoziation, Kryokonservierung und Aufreinigung lebensfähiger kardialer Vorläuferzellen kombiniert wurden. Unser Verfahren ermöglicht die Isolierung von reinen Zellkernen, ohne dass eine FACS-Sortierung erforderlich ist. Mit diesem Verfahren erhielten wir eine qualitativ hochwertige Kernsuspension ohne Verklumpung, fast keine Trümmer und intakte Einzelkerne. Der Schritt der Zellisolierung ist entscheidend, um ein potenzielles Verklumpen der Kerne zu vermeiden. Dies kann durch schonendes Pipettieren mit großen Pipettenspitzen oder durch Filterung der Zellkerne vermieden werden. Durch den Einsatz von Filtern in verschiedenen Stufen und die anschließende Betrachtung unter dem Lichtmikroskop können solche Probleme vermieden werden.
Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich für die Erstellung von snRNA-seq- und snATAC-seq-Profilen aus demselben Zellkernpräparat verwendet, das aus E9.5-Vorläuferzellen des Herzens gewonnen wurde. Diese Methode kann bei trächtigen Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu Mausmodellen für angeborene Herzfehler verwendet werden. Angeborene Herzfehler treten wahrscheinlich aufgrund der Unterbrechung von Signalwegen auf, die die Differenzierung, Vermehrung, Migration und das Überleben von kardialen Vorläuferzellen steuern33,34. Um den Ursprung dieser Defekte besser zu verstehen, konzentrierte sich diese Studie speziell auf das Embryonalstadium 9.5, in dem die Vorläuferzellen der wichtigsten bei angeborenen Herzfehlern betroffenen Areale vorhanden sind, insbesondere die kardialen Vorläuferzellen des zweiten Herzfeldes11 und der Neuralleiste35. Die Anwendung dieses Verfahrens auf Zellen des adulten Mäuseherzens und des menschlichen Herzens erfordert eine Optimierung des Protokolls, insbesondere im Hinblick auf die Zelldissoziations- und Lyseschritte.
Die Hauptüberlegungen zwischen manueller und automatisierter Zellzählung sind die Kosten, der Arbeitsaufwand und die Genauigkeit. Automatisierte Zähler sind schneller als die meisten erfahrenen Wissenschaftler, die eine manuelle Zählung durchführen. Gerade wenn es sich um eine große Anzahl von Proben handelt, ist es von großem Vorteil, einfach auf count drücken zu können und das Ergebnis zu sehen. Dies ist ein wichtiger Punkt, denn sobald die Kerne isoliert sind, müssen sie schnell verarbeitet werden, um den Verlust ihrer Integrität zu vermeiden. Der Hauptvorteil automatisierter Systeme besteht darin, dass diese Systeme die Variabilität zwischen Benutzern oder Laboren eliminieren. Ein weiterer Vorteil ist, dass automatisierte Systeme in der Regel ein größeres Sichtfeld haben als Hämozytometer. Wenn die Anzahl der Zellen/Kerne oder die Konzentration der Zellen/Kerne geringer ist, ist dieses größere Sichtfeld sicherlich ein Vorteil gegenüber der traditionellen manuellen Methode.
Ein hoher Prozentsatz der mitochondrialen DNA-Kontamination kann beobachtet werden, wenn die Konzentration des nichtionischen Detergens zu hoch ist. Durch die Verringerung der Konzentration im Lysepuffer kann diese Kontamination reduziert werden, ohne die Ausbeute der Kerne zu verringern. Die zufriedenstellendsten Ergebnisse erzielten wir in unseren Experimenten mit einem Lysepuffer, der 0,1 % Detergens enthielt. Das Drehen der Kerne in einem Schaukeleimer kann auch die Anzahl der Mitochondrien im Pellet reduzieren.
Ein geeignetes Verhältnis von Tn5-Transposase zu Zellkernen ist entscheidend für eine erfolgreiche snATAC-seq13,14. Zum Beispiel kann ein zu hoher Tn5-Gehalt aufgrund des geschlossenen Chromatins und der geringen Komplexität der Sequenzierungsbibliotheken zu einem hohen Hintergrund führen, während die Sublyse möglicherweise nicht zu einer vollständigen PCR-amplifizierten Bibliothekführt 13. Um die Anzahl der Kerne genau zu bestimmen, haben wir zwei komplementäre Methoden verwendet.
Multimodale Omics-Datensätze bieten die Möglichkeit, mehrere Ebenen der genomischen Organisation gleichzeitig zu untersuchen 9,36. Der gemeinsame multimodale Ansatz von RNA und ATAC ermöglicht die Untersuchung von vorgeschalteten Regulatoren und nachgeschalteten metabolischen Genen und bietet einen umfassenden Ansatz für die Untersuchung von Transkriptionsnetzwerken und Chromatinarchitektur im Kontext der Herzentwicklung mit Einzelzellauflösung. Dieses Protokoll zur Einzelkernisolierung ist sowohl mit der individuellen als auch mit der gemeinsamen Auswertung von Expressions- und Chromatindatensätzen kompatibel. Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine wichtige epigenetische Ebene der Regulation, da sie die Aktivität von Transkriptionsregulatoren an bestimmten genomischen Stellen ermöglicht 8,9,10,11,12,13. Eine Vielzahl von Informationen über die Identität und die Zielorte von Dutzenden möglicher Transkriptionsfaktoren liefert somit die DNA-Sequenz im Chromatinprofil. Der Vergleich der durch snATAC-seq gewonnenen Informationen mit dem snRNA-Expressionsprofiling kann helfen, die relevantesten Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die dann mit Cut&Run37 weiter analysiert werden können. Wir hoffen, dass dieses Verfahren interessierten Forscherinnen und Forschern hilft und sie ermutigt, diese leistungsfähige Methode für ihre Forschung zu nutzen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch ERA-CVD-2019 und ANR-JCJC-2020 bis SS unterstützt. Wir danken der Genomics and Bioinformatics Facility (GBiM) des U 1251/Marseille Medical Genetics Lab und den anonymen Gutachtern für ihre wertvollen Kommentare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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