Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.
Abstract
El corazón en desarrollo es una estructura compleja que contiene varias células progenitoras controladas por mecanismos reguladores complejos. El examen de la expresión génica y el estado de cromatina de las células individuales permite la identificación del tipo y estado celular. Los enfoques de secuenciación de células individuales han revelado una serie de características importantes de la heterogeneidad de las células progenitoras cardíacas. Sin embargo, estos métodos generalmente están restringidos al tejido fresco, lo que limita los estudios con diversas condiciones experimentales, ya que el tejido fresco debe procesarse de inmediato en la misma ejecución para reducir la variabilidad técnica. Por lo tanto, se necesitan procedimientos fáciles y flexibles para producir datos de métodos como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) en esta área. Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente núcleos para posteriores dualómicas de núcleos únicos (snRNA-seq y snATAC-seq combinados). Este método permite el aislamiento de núcleos a partir de muestras congeladas de células progenitoras cardíacas y puede combinarse con plataformas que utilizan cámaras microfluídicas.
Introduction
Entre los defectos congénitos, los defectos cardíacos congénitos (CHD) son los más comunes, que ocurren en aproximadamente el 1% de los nacidos vivos cada año 1,2. Las mutaciones genéticas se identifican sólo en una minoría de casos, lo que implica que otras causas, como las anomalías en la regulación génica, están implicadas en la etiología de la cardiopatía coronaria 2,3. El desarrollo cardíaco es un proceso complejo de diversos tipos de células que interactúan, lo que dificulta la identificación de mutaciones causales no codificantes y sus efectos sobre la regulación génica. La organogénesis del corazón comienza con progenitores celulares que dan lugar a diferentes subtipos de células cardíacas, incluyendo células miocárdicas, fibroblásticas, epicárdicas y endocárdicas 4,5. La genómica unicelular está emergiendo como un método clave para estudiar el desarrollo del corazón y evaluar el impacto de la heterogeneidad celular en la salud y la enfermedad6. El desarrollo de métodos multiómicos para la medición simultánea de diferentes parámetros y la expansión de pipelines computacionales ha facilitado el descubrimiento de tipos y subtipos celulares en el corazón normal y enfermo6. Este artículo describe un protocolo fiable de aislamiento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtenidas de embriones de ratón que es compatible con snRNA-seq y snATAC-seq aguas abajo (así como snRNA-seq y snATAC-seq combinados)7,8,9.
ATAC-seq es un método robusto que permite la identificación de regiones reguladoras de cromatina abierta y el posicionamiento de nucleosomas10,11. Esta información se utiliza para sacar conclusiones sobre la ubicación, identidad y actividad de los factores de transcripción. La actividad de los factores de cromatina, incluidos los remodeladores, así como la actividad transcripcional de la ARN polimerasa, pueden, por lo tanto, ser analizadas ya que el método es altamente sensible para medir cambios cuantitativos en la estructura de la cromatina 1,2. Por lo tanto, ATAC-seq proporciona un enfoque robusto e imparcial para descubrir los mecanismos que controlan la regulación transcripcional en un tipo de célula específico. Los protocolos ATAC-seq también han sido validados para medir la accesibilidad de la cromatina en células individuales, revelando variabilidad en la arquitectura de la cromatina dentro de las poblaciones celulares10,12,13.
Aunque ha habido avances notables en el campo de las células individuales en los últimos años, la principal dificultad es el procesamiento de las muestras frescas necesarias para realizar estos experimentos14. Para evitar esta dificultad, se han realizado diversas pruebas con el objetivo de realizar análisis como snRNA-seq y snATAC-seq con células o tejido cardíaco congelado15,16.
Se han utilizado varias plataformas para analizar datos genómicos unicelulares17. Las plataformas ampliamente utilizadas para la expresión génica unicelular y el perfil ATAC son plataformas para la encapsulación de gotas microfluídicas múltiples17. Como estas plataformas utilizan cámaras microfluídicas, los desechos o agregados pueden obstruir el sistema, lo que resulta en datos no utilizables. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.
El protocolo presentado aquí utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq y snATAC-seq para comprender los defectos cardíacos congénitos 18,19,20,21,22,23. Este procedimiento utiliza la disociación enzimática de tejido cardíaco recién microdiseccionado seguido de la criopreservación de células progenitoras cardíacas de ratón. Después de la descongelación, las células viables se purifican y procesan para el aislamiento nuclear. En este trabajo, este protocolo se utilizó con éxito para obtener datos de snRNA-seq y snATAC-seq de la misma preparación nuclear de células progenitoras cardíacas de ratón.
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Protocol
El procedimiento animal adoptado en este estudio fue aprobado por los comités de ética animal de la Universidad de Aix-Marsella (C2EA-14) y se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité nacional de ética designado para la experimentación animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorización Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Configuración del apareamiento cronometrado antes de la disección
- Para generar embriones de ratón, realice un apareamiento cronometrado entre ratones adultos 9,5 días antes del aislamiento de la región cardíaca. En este procedimiento, se utilizaron ratones C57BL / 6J de tipo salvaje de 2 a 6 meses, y el apareamiento cronometrado se realizó durante la noche.
- A la mañana siguiente, verifique si los ratones hembra tienen un tapón vaginal. Considere el día en que el tapón se identifica como día embrionario (E) 0.5.
2. Preparación de tejidos y aislamiento celular
- Eutanasia a la mujer embarazada de 2-6 meses de edad C57BL / 6J en el día 9.5 después de la concepción a través deCO2 con una concentración creciente seguida de luxación cervical. Limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70%.
NOTA: No se recomienda el uso de anestésicos antes de la luxación cervical ya que esto expondría a los embriones a cambios ambientales que podrían afectar los estudios transcriptómicos y epigenómicos posteriores. - Abra el abdomen y el peritoneo con tijeras. Visualice los cuernos uterinos y use fórceps para extirpar ambos cuernos.
- Coloque los cuernos en una placa de Petri que contenga medio completo frío con 1% de FBS. Si bien no se requiere un volumen específico, se debe tener cuidado para garantizar que los embriones estén completamente inmersos en el medio. Un volumen aproximado de 10 mL por placa de Petri de 10 cm es apropiado.
- Bajo el microscopio estereoscópico ajustado a un aumento de 5x y usando fórceps, retire el tejido endometrial, la placenta y el saco vitelino de cada embrión.
- Coloque los embriones en una placa de Petri con medio completo frío con 1% de FBS. Diseccionar la región cardíaca embrionaria, como se describe en el embrión esquemático ilustrado en la Figura 1, en medio completo frío.
- Agrupe las regiones cardíacas diseccionadas de cinco embriones de ratón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugadoras de cucharón oscilante Prechill a 4 °C.
- Centrífuga a 300x g durante 1 min en RT en una centrífuga de cucharón oscilante. Retire el sobrenadante y lave los pañuelos agregando 1 ml de PBS de grado de cultivo de tejidos.
- Centrifugar a 300 x g durante 1 minuto a RT. Retire el sobrenadante y repita los pasos de lavado para un total de dos lavados. Repita el lavado dos veces, reemplazando el PBS con tripsina/EDTA al 0,05% (1x).
- Para la digestión de tejidos, añadir 50 μL de tripsina/EDTA al 0,25% durante 10 min a 37 °C. Aplique una disociación mecánica suave después de 5 minutos con gestos hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de filtro de orificio ancho.
- Inactivar la actividad digestiva de tripsina añadiendo 350 μL de medio completo a las células disociadas. Pasar las células resuspendidas a través de un filtro celular de 40 μm.
3. Recuento celular y evaluación de viabilidad
NOTA: El recuento de células y la viabilidad son parámetros críticos para el éxito de los experimentos de una sola célula. El enfoque snATAC-seq es sensible a variaciones menores en el número de células. Muy pocas células conducen a la digestión excesiva de la cromatina, lo que resulta en un mayor número de lecturas y el mapeo de regiones de cromatina inaccesibles (ruido). Del mismo modo, tener demasiadas células genera fragmentos de alto peso molecular que son difíciles de secuenciar. Para la determinación precisa de las concentraciones de células y núcleos, el recuento de células y la viabilidad se evaluaron mediante dos métodos diferentes.
- Realice un ensayo de azul de tripano para el recuento celular, como se describe a continuación.
- Solución de tinción de azul de tripano al 0,4% de vórtice, centrifugar durante 10 s a temperatura ambiente a 2.000 x g y transferir 10 μL a un microtubo.
- Con una pipeta, mezclar la suspensión celular y añadir 10 μL de suspensión a los 10 μL de solución de azul de tripano ya alistados. Mezclar cuidadosamente 10 veces con una pipeta.
- Transfiera 10 μL de las células teñidas a un portaobjetos de conteo. Coloque la corredera en el contador para calcular automáticamente la concentración y viabilidad de la célula.
- Realizar una evaluación de mortalidad basada en fluorescencia como se describe a continuación.
NOTA: Este ensayo se basa en el uso de colorantes fluorescentes (ethidium homodimer-1, EthD-1 y calcein AM) para evaluar la viabilidad celular. Se utilizó un kit disponible comercialmente y se siguieron las instrucciones del proveedor para la preparación y el uso apropiados.- Prepare una solución de EthD-1 de 10 μM agregando 5 μL de la solución madre de 2 mM de EthD-1 suministrada a 1 ml de D-PBS estéril de grado de cultivo tisular, y vórtice durante 5 s para garantizar una mezcla completa.
- Transfiera 2,5 μL de la solución madre de calceína AM de 4 mM suministrada a la solución EthD-1 ya preparada. Vórtice durante 5 s para asegurar una mezcla completa.
- Añadir 10 μL de la solución de trabajo resultante de 10 μM EthD-1 y 10 μM de calceína AM a 10 μL de suspensión celular.
NOTA: La calceína es altamente susceptible a la hidrólisis en soluciones acuosas, así que use esta solución de trabajo dentro de 1 día. - Transfiera 10 μL de las células teñidas a un portaobjetos de conteo. Inserte la diapositiva en el contador automático de células fluorescentes. Cuente las celdas vivas con un filtro GFP y las celdas muertas con un filtro RFP.
NOTA: Los dos métodos de conteo dieron recuentos celulares y viabilidad similares, y se estimó que el número total de células recién disociadas promedió alrededor de 20,000 células por región cardíaca embrionaria (0.06 mm3).
4. Congelación celular
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el fondo del tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio de congelación refrigerado.
- Transfiera la suspensión celular a un criovial preenfriado y coloque el criovial en un recipiente de congelación preenfriado.
- Colocar el envase a −80 ◦C durante 4 h a 8 h. Transfiera el criovial al nitrógeno líquido para experimentos de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC aguas abajo.
NOTA: El criovial debe ser transportado en hielo seco antes de su uso. En nuestra experiencia, las células pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante al menos 6 meses sin pérdida de viabilidad celular. La temperatura de almacenamiento debe mantenerse por debajo de -150 ° C en todo momento para evitar la formación de cristales de hielo.
5. Descongelación celular y eliminación de células muertas
- Coloque los crioviales en un baño maría a 37 °C durante 1-2 min. Retírelo cuando quede un pequeño cristal en el criovial.
- Añadir 1 ml de medio completo precalentado (37 °C). Mezclar con una pipeta tres veces. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de medio completo caliente.
- Pasar toda la suspensión celular sobre un colador de 30 μm. Enjuague el colador con 1-2 ml de medio completo tibio y recoja el flujo en el mismo tubo cónico.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Lave una vez con PBS y transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
- Agregue 100 μL de las microperlas magnéticas proporcionadas a las células peletizadas y homogeneice cinco veces con una punta de pipeta de diámetro ancho. Incubar durante 15 min en RT.
- Mientras tanto, enjuague la columna de separación magnética (capacidad: 1 x 107 a 2 x 108 celdas) con 500 μL de 1x tampón de unión.
- Una vez completada la incubación, diluir la suspensión celular que contiene las microperlas con 500 μL de tampón de unión 1x.
- Aplique la suspensión celular (0,6 μL) a la columna de separación magnética preparada. El flujo es la fracción de células vivas seleccionadas negativamente, y la fracción retenida magnéticamente son las células muertas seleccionadas positivamente.
- Recoger el efluente de células vivas en un tubo de centrífuga de 15 ml. Enjuague el microtubo de 1,5 ml que contenía la suspensión celular y la columna con 2 ml de tampón de unión 1x, y recoja el efluente en el mismo tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
- Añadir 1 ml de la solución de PBS-BSA y mezclar suavemente pipeteando cinco veces con una punta de pipeta de orificio ancho. Transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
- Agregue 1 ml de PBS-BSA para resuspender el pellet y repita el paso de lavado para un total de dos lavados.
- Resuspender las células en 100 μL de solución PBS-BSA. Mezclar suavemente pipeteando 10 veces.
- Determinar la concentración y viabilidad de las células utilizando los métodos descritos anteriormente (paso 3.1 y paso 3.2). Para continuar con el siguiente paso, asegúrese de un recuento de células de ≥100.000 celdas. Consulte la figura 2 para obtener resultados representativos.
NOTA: La criopreservación resulta en una pérdida de aproximadamente el 40% del material de partida inicial de las células vivas. Dependiendo del número inicial de células, la separación de cuentas en una columna magnética da como resultado una alta viabilidad celular, pero divide el número total de células por dos a cinco veces. La utilización de un kit magnético basado en columnas para eliminar las células muertas se recomienda solo cuando se dispone de suficiente material de partida.
6. Aislamiento de núcleos
NOTA: snATAC y snRNA-seq combinados se realizan con una suspensión de núcleos limpios e intactos. Se recomienda la optimización de las condiciones de lisis (tiempo de lisis y concentración de NP40) para el tipo de célula utilizada. El punto de tiempo óptimo de lisis y la concentración de detergente son aquellos que resultan en el número máximo de células que se lisan sin interrumpir la morfología nuclear. La pérdida de células/núcleos se puede reducir utilizando una centrífuga de cucharón oscilante en lugar de una centrífuga de ángulo fijo. Para minimizar la retención de núcleos en los plásticos, se recomienda utilizar puntas de pipeta de baja retención y tubos de centrífuga. Esto puede aumentar la recuperación de los núcleos. El recubrimiento de las puntas de pipeta y los tubos de centrífuga con BSA al 5% es una alternativa menos costosa pero que requiere más tiempo.
- Limpie el lugar de trabajo y los materiales con etanol al 70% y solución de eliminación de RNasa.
- Centrifugadoras de cucharón oscilante Prechill a 4 °C. Tampón de lisis recién preparado, tampón de dilución de lisis, tampón de lisis 0.1x y tampón de lavado (ver Tabla 1). Mantenga los tampones en hielo.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de cucharón oscilante. Retire suavemente todo el sobrenadante sin tocar el fondo del tubo para evitar desalojar el pellet celular.
- Añadir 100 μL de tampón de lisis 0,1x refrigerado. Mezclar suavemente pipeteando 10 veces. Incubar durante 5 minutos en hielo.
- Agregue 1 ml de tampón de lavado refrigerado y mezcle suavemente pipeteando cinco veces. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet del núcleo.
- Repita los lavados con tampón de lavado refrigerado para un total de tres lavados. Prepare el tampón de núcleos diluidos. Después de la resuspensión, mantenga la solución madre de núcleos en hielo.
7. Evaluaciones cualitativas y cuantitativas de los núcleos aislados
NOTA: Sobre la base del recuento inicial de células y la estimación de aproximadamente el 50% de pérdida de núcleos durante la lisis celular, resuspender el número apropiado de células en tampón de núcleos diluidos en frío. El cálculo del volumen de resuspensión con tampón de núcleos diluidos refrigerados se basa en la recuperación de núcleos prevista y las concentraciones correspondientes de núcleos recomendadas por la guía del usuario del fabricante. Véase un ejemplo de este cálculo en el Protocolo suplementario 1.
- Sobre la base del recuento inicial de células y la estimación de aproximadamente el 50% de pérdida de núcleos durante la lisis celular, resuspender el número apropiado de células en tampón de núcleos diluidos en frío.
- Determine la concentración real de núcleos. Mezclar 2 μL de solución madre de núcleos con 8 μL de tampón de núcleos diluidos y añadir la mezcla a los 10 μL prealistados de azul de tripano o solución de trabajo EthD-1/calceinAM. Cuente los núcleos usando un contador de celdas automatizado. Menos del 5% de las células deberían ser viables. Consulte la figura 3 para obtener resultados representativos.
- Calcular el volumen de existencias de núcleos y el volumen de tampón de núcleos diluidos para obtener un volumen total de 5 μL a la concentración recomendada para la reacción de transposición (consulte la guía del usuario del fabricante). Proceda inmediatamente a la reacción de transposición de acuerdo con la guía del usuario17.
NOTA: Todos los pasos desde la reacción de transposición hasta la construcción de las bibliotecas ATAC y GEX se realizaron de acuerdo con la guía del usuario del kit utilizado para snRNA-seq y snATAC-seq combinados17.
8. Análisis de calidad de las bibliotecas snRNA-seq y snATAC-seq
- Antes de proceder a la secuenciación de próxima generación, valide la calidad y la distribución de tamaño de las bibliotecas finales snATAC-seq y GEX de expresión génica. Evaluar la calidad y cantidad de secuencias identificadas en las bibliotecas utilizando sistemas de análisis de fragmentos. Consulte la Figura 4 para obtener resultados representativos de la evaluación de la calidad.
NOTA: La traza final de las bibliotecas snATAC-seq debe mostrar la periodicidad del devanado nucleosomal, y los tamaños deben variar de 200 pb a varios Kbp, mientras que los tamaños en la biblioteca de expresión génica deben variar de 300 pb a 600 pb.
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Representative Results
En comparación con la preparación de suspensiones unicelulares para enfoques unicelulares, la preparación de suspensiones de un solo núcleo es mucho más desafiante y requiere un mayor grado de resolución y procesamiento. El factor clave para el éxito combinado de snRNA-seq y snATAC-seq es una suspensión de núcleos limpia e intacta. El protocolo para el aislamiento eficiente de los núcleos debe adaptarse a cada tipo de tejido y condición (fresco o congelado). Aquí, se describe un protocolo optimizado para el aislamiento de núcleos de células cardíacas embrionarias de ratón congeladas. Todos los pasos desde la disección de la región cardíaca embrionaria y la disociación de células cardíacas hasta el aislamiento de núcleos se resumen en la Figura 1. Para el material de partida, se recomienda un recuento de células de 1 x 105-1 x 106 células y una viabilidad celular >70% para un aislamiento eficiente de los núcleos. Como se muestra en la Figura 2, el paso adicional realizado en este protocolo para clasificar y eliminar las células muertas después de la descongelación permitió obtener una suspensión celular más limpia con una viabilidad celular significativamente mayor y mejorar la calidad de la muestra inicial. Además del aislamiento de núcleos, este protocolo proporciona información detallada sobre cómo evaluar la calidad y cantidad de los núcleos aislados (Figura 3). La calidad de los núcleos aislados tiene un gran impacto en la calidad de los datos combinados de snRNA-seq y snATAC-seq; Aquí, la calidad de los núcleos aislados se evaluó mediante la evaluación de la morfología de la membrana nuclear. Los núcleos aislados parecían lisos y uniformemente redondos, como se muestra en la Figura 3C, bajo microscopía de campo claro, lo que indica un proceso de aislamiento efectivo. Para mayor precisión, se utilizaron dos métodos de conteo diferentes, incluido el azul de tripano y un kit para la evaluación de viabilidad basada en fluorescencia, para cuantificar las células y los núcleos. El ensayo de fluorescencia se utilizó para determinar la viabilidad celular basada en la integridad celular y la actividad de la esterasa intracelular. Esta solución de colorante permite distinguir las células vivas de las células muertas visualizando simultáneamente la calceína verde fluorescente AM, que indica la actividad de la esterasa intracelular, y el homodímero de etidio fluorescente rojo 1, que refleja la pérdida de integridad celular. El uso de un tinte fluorescente para contar ayuda a distinguir los núcleos de los grupos de células y los desechos. Usando este protocolo, la viabilidad celular pasó del 80%-90% antes del aislamiento de los núcleos al <5% después del aislamiento de los núcleos, como se muestra en la Figura 3A, B.
Nuestro procedimiento se comparó con el método existente, que consiste en congelar tejido fresco directamente en nitrógeno líquido y realizar la etapa de lisado sin disociación enzimática previa (Protocolo Suplementario 2 y Figura Suplementaria 1). Ambos enfoques se probaron para determinar qué método proporciona una suspensión de núcleos de mejor calidad. La congelación instantánea de todo el tejido cardíaco embrionario dio lugar a un alto porcentaje de células no lisadas detectadas como vivas, lo que indica una lisis celular inadecuada (Figura complementaria 1A). Se observaron agregados y células no individuales a pesar de la filtración a través de filtros (Figura suplementaria 1A, B).
Los núcleos aislados se utilizaron para generar bibliotecas para snATAC-seq y snRNA-seq conjuntos. La Figura 4 ilustra los resultados del control de calidad del ADNc utilizado para la construcción de la biblioteca de expresión génica (GEX) y la biblioteca ATAC. El control de calidad se realizó mediante electroforesis automatizada (Figura 5A). Se cuantificaron los ADNc derivados del ARNm, y el rendimiento fue suficiente para su uso posterior en la construcción de la biblioteca GEX. Se obtuvo una biblioteca GEX de alta calidad que varía de ~ 300 pb a 600 pb y una biblioteca ATAC de alta calidad con devanado de nucleosomas periódicos que van desde 200 pb a 7 kbp. Estas bibliotecas se secuenciaron mediante secuenciación de alto rendimiento y generaron con éxito la expresión génica de un solo núcleo y la accesibilidad a la cromatina (Figura 5A). Estos datos brutos estaban listos para ser demultiplexados y analizados bioinformáticamente para generar perfiles transcripcionales y epigenéticos de células progenitoras cardíacas E9.5 de ratón. SnRNA-seq y snATAC-seq se agruparon, identificaron y marcaron en función de genes marcadores conocidos utilizando agrupamiento no supervisado con el kit de herramientas Seurat para genómica única24 . Este análisis inicial confirmó la presencia de todos los tipos de células cardíacas esperadas en E9.5 (Figura 5B).
Todos los resultados anteriores apoyan el éxito de este protocolo en el aislamiento de núcleos que son adecuados para enfoques de núcleos únicos aguas abajo de células cardíacas embrionarias congeladas.
Figura 1: Representación de los pasos principales en la preparación de la muestra para el perfil combinado de snRNA-seq y snATAC-seq. Este diagrama de flujo recapitula todos los pasos, incluida la disección del tejido cardíaco y la disociación de células cardíacas, la congelación y descongelación celular, la purificación de células vivas mediante la eliminación de células muertas y el aislamiento de núcleos, que se llevan a cabo para la detección simultánea de ARNm y accesibilidad a la cromatina de la misma célula. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; BSA = albúmina sérica bovina; RT = temperatura ambiente. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Viabilidad de las células descongeladas optimizadas después de la clasificación de células muertas. Imágenes que muestran el recuento de células y la viabilidad utilizando un contador de células automatizado antes (arriba) y después (abajo) de la eliminación de células muertas utilizando el colorante de exclusión azul de tripano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Control de calidad de la preparación de los núcleos. (A,B) Imágenes que muestran el recuento de células y la viabilidad utilizando un contador de células automatizado antes (arriba) y después del aislamiento (inferior) de los núcleos. Se utilizaron dos métodos de conteo: (A) el ensayo de mortalidad fluorescente y (B) el ensayo de azul de tripano. (C) Imágenes que muestran la calidad del aislamiento de los núcleos. Las imágenes se tomaron a 20x (barra de escala = 50 μm) utilizando microscopía de campo claro y fluorescencia. La imagen de campo claro (izquierda) muestra la morfología nuclear; la RFP (medio) muestra células que perdieron su integridad de membrana, es decir, núcleos aislados; y la GFP (derecha) que normalmente indica la actividad de la esterasa de las células vivas aquí confirma la ausencia de células vivas en la suspensión de los núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control de calidad de la expresión génica unicelular y bibliotecas ATAC. Análisis de ADN con electroforesis automatizada que muestra la calidad y la distribución de tamaño del ADNc (arriba), la biblioteca GEX (centro) y la biblioteca ATAC (abajo). Para la cuantificación del ADNc, se seleccionó la zona que oscilaba entre 200 pb y 8.900 pb, y el bioanalizador estimó la concentración de ADNc (en pg/μL; círculo rojo). Se obtuvo un rendimiento suficiente de ADNc para proceder con la construcción de la biblioteca XXX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Rendimiento de la muestra evaluado con el software Cell Ranger25. (A) Gráfico de sensibilidad cruzada que muestra los eventos de transposición en picos por código de barras en el eje x e identificadores moleculares únicos de ARN (UMI) por código de barras en el eje y. Como era de esperar, las células se encuentran principalmente en la esquina superior derecha, con altos datos de ARN y ATAC. Se observó una clara separación entre las células y las no células (GEM vacíos, señal de fondo). (B) Gráfica representativa de aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) de todas las células capturadas en scRNA-seq (izquierda) y scATAC-seq (derecha) coloreadas por identidad de clúster y agrupadas según los tipos de células. Se observó una buena separación de grupos. Los datos brutos conjuntos de GEX y ATAC se obtuvieron de la secuenciación de 7.000 núcleos de la región cardíaca embrionaria del ratón E9.5 diseccionada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Control de calidad del aislamiento de núcleos a partir del método existente que implica congelar tejido fresco directamente en nitrógeno líquido. (A) Imágenes que muestran el recuento de núcleos aislados utilizando un contador celular automatizado y azul de tripano como colorante de exclusión antes (arriba) y después (abajo) de la filtración a través de un filtro de 40 μm. Un alto porcentaje de células no lisadas se detectaron como vivas. La detección de 20% de células vivas indica lisis celular inadecuada. Las flechas negras indican agregados. (B) Imágenes que muestran la calidad de los núcleos aislados. Las imágenes se tomaron a 20x (superior y medio con una barra de escala de 50 μm) y 40x (inferior con una barra de escala de 25 μm) utilizando microscopía de campo claro y fluorescencia. La imagen de campo claro (izquierda) muestra la morfología nuclear; la RFP (derecha) muestra células que perdieron su integridad de membrana, en otras palabras, núcleos aislados. Las flechas negras indican multiplicadores de núcleos unidos por escombros. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla 1: Tabla de tampones y soluciones utilizadas en el procedimiento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Protocolo complementario 1: Evaluación de la cantidad de núcleos aislados. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Protocolo complementario 2: Aislamiento de núcleos de tejido congelado rápidamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El análisis de la composición celular del corazón en desarrollo por estudios combinados de snRNA-seq y snATAC-seq proporciona una comprensión más profunda del origen de la cardiopatía congénita26. Varios laboratorios de investigación han estudiado los efectos de la criopreservación del tejido cardíaco en snRNA-seq27. La realización de snRNA-seq y snATAC-seq utilizando tejido fresco microdisecado de modelos de ratón de enfermedades humanas puede ser un desafío logístico cuando se comparan diferentes condiciones experimentales. Para una etapa dada de desarrollo, una dificultad es que los grupos de control y experimentales deben procesarse en la misma ejecución para reducir la variabilidad técnica introducida por el procesamiento de muestras. Cuando no es posible procesar tejido fresco, se recomienda, según nuestros resultados, disociar y luego criopreservar en lugar de congelar todo el tejido cardíaco embrionario. La elección de un método sobre el otro se basa en el hecho de que si el tejido cardíaco se congela entero, aislar células individuales viables después de la descongelación es mucho más difícil. Sin embargo, si el protocolo de disociación de tejidos no está optimizado, entonces puede ser mejor congelar rápidamente el tejido entero. Se prefiere la disociación seguida de criopreservación dado que este protocolo de disociación tisular produce >90% de células viables frescas sin sesgo de tipo celular.
Este enfoque tiene varios beneficios, como el uso de células congeladas, que elimina la necesidad de tejido fresco, y el uso de un paso de disociación de una sola célula, que permite el aislamiento de núcleos individuales intactos; De hecho, esto es crítico para el análisis de células individuales aguas abajo. Sin embargo, la disociación enzimática puede inducir un sesgo transcripcional en poblaciones celulares. La disociación celular enzimática interfiere con el microambiente celular y, por lo tanto, induce cambios transcripcionales en la mayoría de los tipos celulares28. El principal determinante de estos cambios es el tiempo de disociación, no el tipo de célula29. Para moderar los artefactos inducidos por la disociación es importante seguir el tiempo de digestión recomendado. La literatura publicada en diversos tejidos indica que un tiempo de digestión de 30 min o menos induce cambios transcripcionales menores28,30. Además, las intervenciones bioinformáticas podrían utilizarse para minimizar las distorsiones de los datos31,32.
La obtención de núcleos únicos puros e intactos es el factor más importante en la genómica de un solo núcleo. La obstrucción de las cámaras microfluídicas de las plataformas unicelulares debido a la presencia de grupos de células o desechos orgánicos conduce a una mala calidad de los datos o, lo que es más problemático, a un fracaso experimental. En este procedimiento, los protocolos existentes se modificaron combinando disociación enzimática, criopreservación y purificación de células progenitoras cardíacas viables. Nuestro procedimiento permite el aislamiento de núcleos puros sin necesidad de clasificación FACS. Usando este procedimiento, obtuvimos una suspensión nuclear de alta calidad sin aglutinación, casi sin escombros y núcleos individuales intactos. El paso de aislamiento celular es crucial para evitar la posible aglutinación de los núcleos; De hecho, esto puede evitarse mediante un pipeteo suave con grandes puntas de pipeta o filtrando los núcleos. El uso de filtros en diferentes pasos y la posterior observación bajo un microscopio óptico pueden prevenir tales problemas.
El protocolo descrito aquí se utilizó con éxito para el perfil snRNA-seq y snATAC-seq de la misma preparación de núcleos obtenida de células progenitoras cardíacas E9.5. Este método se puede usar en ratones de tipo salvaje embarazadas versus modelos de ratón para defectos cardíacos congénitos. Los defectos cardíacos congénitos probablemente ocurren debido a la interrupción de las vías que controlan la diferenciación, multiplicación, migración y supervivencia de las células progenitoras cardíacas33,34. Para comprender mejor el origen de estos defectos, este estudio se centró específicamente en la etapa embrionaria 9.5, en la que están presentes los progenitores de las principales áreas afectadas en los defectos cardíacos congénitos, en particular los progenitores cardíacos del segundo campo cardíaco11 y la cresta neural35. La aplicación de este procedimiento a las células del corazón del ratón adulto y el corazón humano requiere la optimización del protocolo, particularmente en términos de los pasos de disociación celular y lisis.
Las principales consideraciones entre el conteo manual y automatizado de celdas son los costos, la mano de obra y la precisión. Los contadores automatizados son más rápidos que la mayoría de los científicos calificados que realizan un conteo manual. Especialmente cuando se trata de una gran cantidad de muestras, es de gran beneficio poder simplemente presionar contar y ver el resultado. Este es un punto importante porque una vez que los núcleos están aislados, deben procesarse rápidamente para evitar la pérdida de su integridad. El principal beneficio de precisión de los sistemas automatizados es que estos sistemas eliminan la variabilidad entre usuarios o laboratorios. Otra ventaja es que los sistemas automatizados suelen tener un campo de visión más grande que los hemocitómetros. Cuando el número de células/núcleos o la concentración de las células/núcleos son menores, este campo de visión más amplio es sin duda una ventaja sobre el método manual tradicional.
Se puede observar un alto porcentaje de contaminación del ADN mitocondrial cuando la concentración del detergente no iónico es demasiado alta. Al disminuir su concentración en el tampón de lisis, esta contaminación puede reducirse sin disminuir el rendimiento de los núcleos. Los resultados más satisfactorios se obtuvieron en nuestros experimentos con un tampón de lisis que contenía 0,1% de detergente. Girar los núcleos en un cubo oscilante también puede reducir el número de mitocondrias en el pellet.
Tener una proporción adecuada de transposasa Tn5 a núcleos es crucial para el éxito de snATAC-seq13,14. Por ejemplo, tener demasiada Tn5 puede conducir a un fondo alto debido a la cromatina cerrada y la baja complejidad de las bibliotecas de secuenciación, mientras que la sublisis puede no resultar en una biblioteca amplificada por PCR completa13. Para determinar el número de núcleos con precisión, utilizamos dos métodos complementarios.
Los conjuntos de datos ómicos multimodales brindan la oportunidad de investigar múltiples niveles de organización genómica simultáneamente 9,36. El enfoque multimodal conjunto de ARN y ATAC permite el estudio de reguladores aguas arriba y genes metabólicos aguas abajo y proporciona un enfoque integral para el estudio de redes transcripcionales y arquitectura de cromatina en el contexto del desarrollo del corazón a la resolución de una sola célula. Este protocolo para el aislamiento de núcleos únicos es compatible con la evaluación individual y conjunta de conjuntos de datos de expresión y cromatina. La accesibilidad a la cromatina es un nivel epigenético importante de regulación porque permite la actividad de reguladores transcripcionales en sitios genómicos específicos 8,9,10,11,12,13. Una multitud de información sobre la identidad y los sitios objetivo de docenas de posibles factores de transcripción son, por lo tanto, proporcionados por la secuencia de ADN en el perfil de cromatina. La comparación de la información obtenida por snATAC-seq con el perfil de expresión de snRNA puede ayudar a identificar los factores de transcripción más relevantes, que luego pueden ser analizados por Cut&Run37. Esperamos que este procedimiento ayude a los investigadores interesados y los anime a utilizar este poderoso método para su investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por ERA-CVD-2019 y ANR-JCJC-2020 a SS. Agradecemos a la instalación de Genómica y Bioinformática (GBiM) del laboratorio de Genética Médica U 1251 / Marsella y a los revisores anónimos por proporcionar valiosos comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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